专题九 现代生物科技专题.docx

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专题九现代生物科技专题

专题九　现代生物科技专题

第15讲　基因工程与细胞工程

　1.基因工程的诞生（Ⅰ）　2.基因工程的原理及技术（含PCR技术）（Ⅱ）　3.基因工程的应用（Ⅱ）　4.蛋白质工程（Ⅰ）　5.植物的组织培养（Ⅱ）　6.动物细胞培养与体细胞克隆（Ⅱ）　7.细胞融合与单克隆抗体（Ⅱ）

（1）限制性核酸内切酶、DNA连接酶和质粒是基因工程中常用的三种工具酶。

（）

（2）E·coliDNA连接酶既可连接平末端，又可连接黏性末端。

（）

（3）载体的作用是携带目的基因导入受体细胞中，使之稳定存在并表达。

（）

（4）应用DNA探针技术，可以检测转基因抗冻番茄植株中目的基因的存在及其完全表达。

（）

（5）蛋白质工程是在分子水平上对蛋白质分子直接进行操作，定向改变分子的结构。

（）

（6）愈伤组织是外植体通过脱分化和再分化后形成的。

（）

（7）利用物理法或化学法可以直接将两个植物细胞进行诱导融合。

（）

（8）制备肝细胞悬液时先用剪刀剪碎肝组织，再用胃蛋白酶处理。

（）

（9）与“多利”羊等克隆哺乳动物相关的技术有胚胎移植、细胞培养和核移植技术。

（）

（10）体细胞杂交技术可用于克隆动物和制备单克隆抗体。

（）

1．推测限制酶存在于原核生物中的作用。

2．作为基因工程表达载体，只需含有目的基因就可以完成任务吗？

为什么？

3．利用大肠杆菌可以生产人的胰岛素，能生产人的糖蛋白吗？

1．（2018·全国Ⅰ，T38）回答下列问题：

（1）博耶（H.Boyer）和科恩（S.Coben）将非洲爪蟾核糖体蛋白基因与质粒重组后导入大肠杆菌细胞中进行了表达，该研究除证明了质粒可以作为载体外，还证明了____________________（答出两点即可）。

（2）体外重组的质粒可通过Ca2＋参与的________方法导入大肠杆细菌细胞：

而体外重组的噬菌体DNA通常需与________组装成完整噬菌体后，才能通过侵染的方法将重组的噬菌体DNA导入宿主细胞，在细菌、心肌细胞、叶肉细胞中，可作为重组噬菌体宿主细胞的是_________________________________。

（3）真核生物基因（目的基因）在大肠杆菌细胞内表达时，表达出的蛋白质可能会被降解。

为防止蛋白质被降解，在实验中应选用________的大肠杆菌作为受体细胞，在蛋白质纯化的过程中应添加________的抑制剂。

2．（2017·全国Ⅰ，T38）真核生物基因中通常有内含子，而原核生物基因中没有，原核生物没有真核生物所具有的切除内含子对应的RNA序列的机制。

已知在人体中基因A（有内含子）可以表达出某种特定蛋白（简称蛋白A）。

回答下列问题：

（1）某同学从人的基因组文库中获得了基因A，以大肠杆菌作为受体细胞却未得到蛋白A，其原因是_________________________________。

（2）若用家蚕作为表达基因A的载体，在噬菌体和昆虫病毒两种载体中，不选用________________作为载体，其原因是_________________________________。

（3）若要高效地获得蛋白A，可选用大肠杆菌作为受体，因为与家蚕相比，大肠杆菌具有____________________________________________________________（答出两点即可）等优点。

（4）若要检测基因A是否翻译出蛋白A，可用的检测物质是____________________（填“蛋白A的基因”或“蛋白A的抗体”）。

（5）艾弗里等人的肺炎双球菌转化实验为证明DNA是遗传物质做出了重要贡献，也可以说是基因工程的先导，如果说他们的工作为基因工程理论的建立提供了启示，那么，这一启示是_________________________________。

3．（2015·全国Ⅱ，T40）已知生物体内有一种蛋白质（P），该蛋白质是一种转运蛋白，由305个氨基酸组成。

如果将P分子中158位的丝氨酸变成亮氨酸，240位的谷氨酰胺变成苯丙氨酸，改变后的蛋白质（P1）不但保留P的功能，而且具有了酶的催化活性。

回答下列问题：

（1）从上述资料可知，若要改变蛋白质的功能，可以考虑对蛋白质的________进行改造。

（2）以P基因序列为基础，获得P1基因的途径有修饰________基因或合成________基因，所获得的基因表达时是遵循中心法则的，中心法则的全部内容包括________的复制；以及遗传信息在不同分子之间的流动，即：

_________________________________________。

（3）蛋白质工程也被称为第二代基因工程，其基本途径是从预期蛋白质功能出发，通过________和________，进而确定相对应的脱氧核苷酸序列，据此获得基因，再经表达、纯化获得蛋白质，之后还需要对蛋白质的生物________进行鉴定。

启动子

L1基因

GFP基因

终止子

4．（2018·全国Ⅱ，T38）某种荧光蛋白（GFP）在紫外光或蓝光激发下会发出绿色荧光，这一特性可用于检测细胞中目的基因的表达。

某科研团队将某种病毒的外壳蛋白（L1）基因连接在GFP基因的5′末端，获得了L1－GFP融合基因（简称为甲），并将其插入质粒P0，构建了真核表达载体P1，其部分结构和酶切位点的示意图如下，图中E1～E4四种限制酶产生的黏性末端各不相同。

↑　↑　↑　↑

E1　　E2　E3E4

回答下列问题：

（1）据图推断，该团队在将甲插入质粒P0时，使用了两种限制酶，这两种酶是________。

使用这两种酶进行酶切是为了保证________，也是为了保证_________________________________。

（2）将P1转入体外培养的牛皮肤细胞后，若在该细胞中观察到了绿色荧光，则说明L1基因在牛的皮肤细胞中完成了________和________过程。

（3）为了获得含有甲的牛，该团队需要做的工作包括：

将能够产生绿色荧光细胞的________移入牛的________中、体外培养、胚胎移植等。

（4）为了检测甲是否存在于克隆牛的不同组织细胞中，某同学用PCR方法进行鉴定，在鉴定时应分别以该牛不同组织细胞中的________（填“mRNA”“总RNA”或“核DNA”）作为PCR模板。

5．（2013·全国Ⅱ，T40）甲、乙是染色体数目相同的两种二倍体药用植物，甲含有效成分A，乙含有效成分B。

某研究小组拟培育同时含有A和B的新型药用植物。

回答下列问题：

（1）为了培育该新型药用植物，可取甲和乙的叶片，先用________酶和________酶去除细胞壁，获得具有活力的________，再用化学诱导剂诱导二者融合。

形成的融合细胞进一步培养形成________组织，然后经过________形成完整的杂种植株。

这种培育技术称为_________________________________。

（2）上述杂种植株属于多倍体，多倍体是指_________________________________。

假设甲与乙有性杂交的后代是不育的，而上述杂种植株是可育的，造成这种差异的原因是_________________________________。

（3）这种杂交植株可通过制作人工种子的方法来大量繁殖。

经植物组织培养得到的________等材料用人工薄膜包装后可得到人工种子。

6．（2017·全国Ⅲ，T38）编码蛋白甲的DNA序列（序列甲）由A、B、C、D、E五个片段组成，编码蛋白乙和丙的序列由序列甲的部分片段组成，如图1所示。

回答下列问题：

（1）现要通过基因工程的方法获得蛋白乙，若在启动子的下游直接接上编码蛋白乙的DNA序列（TTCGCTTCT……CAGGAAGGA），则所构建的表达载体转入宿主细胞后不能翻译出蛋白乙，原因是_________________________________。

（2）某同学在用PCR技术获取DNA片段B或D的过程中，在PCR反应体系中加入了DNA聚合酶、引物等，还加入了序列甲作为______________，加入了________________作为合成DNA的原料。

（3）现通过基因工程方法获得了甲、乙、丙三种蛋白，要鉴定这三种蛋白是否具有刺激T淋巴细胞增殖的作用，某同学做了如下实验：

将一定量的含T淋巴细胞的培养液平均分成四组，其中三组分别加入等量的蛋白甲、乙、丙，另一组作为对照，培养并定期检测T淋巴细胞浓度，结果如图2。

①由图2可知，当细胞浓度达到a时，添加蛋白乙的培养液中T淋巴细胞浓度不再增加，此时若要使T淋巴细胞继续增殖，可采用的方法是________________。

细胞培养过程中，培养箱中通常要维持一定的CO2浓度，CO2的作用是_________________________________。

②仅根据图1、图2可知，上述甲、乙、丙三种蛋白中，若缺少______________（填“A”“B”“C”“D”或“E”）片段所编码的肽段，则会降低其刺激T淋巴细胞增殖的效果。

7．（2014·全国Ⅰ，T40）某研究者用抗原（A）分别免疫3只同种小鼠（X、Y和Z），每只小鼠免疫5次，每次免疫一周后测定各小鼠血清抗体的效价（能检测出抗原抗体反应的血清最大稀释倍数），结果如下图所示。

若要制备杂交瘤细胞，需取免疫后小鼠的B淋巴细胞（染色体数目为40条），并将该细胞与体外培养的小鼠骨髓瘤细胞（染色体数目为60条）按一定比例加入试管中，再加入聚乙二醇诱导细胞融合，经筛选培养及抗体检测，得到不断分泌抗A抗体的杂交瘤细胞。

回答下列问题：

（1）制备融合所需的B淋巴细胞时，所用免疫小鼠的血清抗体效价需达到16000以上，则小鼠最少需要经过________次免疫后才能有符合要求的。

达到要求的X、Y、Z这3只免疫小鼠中，最适合用于制备B淋巴细胞的是________小鼠，理由是____________________。

（2）细胞融合实验完成后，融合体系中除含有未融合的细胞和杂交瘤细胞外，可能还有__________________，体系中出现多种类型细胞的原因是_________________________________。

（3）杂交瘤细胞中有________个细胞核，染色体数目最多是________条。

（4）未融合的B淋巴细胞经过多次传代培养后都不能存活，原因是_________________________________。

考点一　基因工程

1．基因工程的基本工具

（1）限制酶≠DNA酶≠解旋酶

限制酶是切割某种特定的脱氧核苷酸序列，并使两条链在特定的位置断开；DNA酶是将DNA水解为基本组成单位；解旋酶是将DNA的两条链间的氢键打开形成两条单链。

（2）使用限制酶的注意点

①一般用同种限制酶切割载体和目的基因。

②不同的限制酶也能切割出相同的黏性末端。

（3）DNA连接酶≠DNA聚合酶

DNA连接酶连接两个DNA片段，而DNA聚合酶只能将单个脱氧核苷酸添加到脱氧核苷酸链上。

2．基因工程的基本操作程序

（1）目的基因的获取途径

方法

具体操作

人工合成

直接分离

从自然界已有的物种中分离，如从基因文库中获取

化学合成

已知核苷酸序列的较小基因，直接利用DNA合成仪用化学方法合成，不需要模板

逆转录法

以mRNA为模板，在逆转录酶作用下人工合成

PCR技术扩增

①原理：

DNA复制；②条件：

模板DNA、

引物、脱氧核苷酸、热稳定的DNA

聚合酶　　　　　　　　　　　　

③过程

（2）基因表达载体的构建——重组质粒的构建

①表达载体的组成：

目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因＋复制原点。

②启动子和终止子：

启动子是RNA聚合酶结合位点，启动转录；终止子是终止转录的位点。

（3）将目的基因导入受体细胞

植物细胞

动物细胞

微生物细胞

常用

方法

农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法

显微注射技术

感受态细胞法（用Ca2＋处理）

受体细胞

受精卵、体细胞

受精卵

原核细胞

（4）目的基因的检测与鉴定

①导入检测：

DNA分子杂交技术（使用DNA探针）。

②表达检测

③个体生物学水平鉴定：

如对转基因作物进行抗虫或抗病等接种实验。

（1）基因工程中的载体与细胞膜上的载体不同。

（2）启动子、终止子

①启动子（DNA片段）≠起始密码子（位于mRNA上）。

②终止子（DNA片段）≠终止密码子（位于mRNA上）。

3．蛋白质工程

1．（2017·全国Ⅱ，T38）几丁质是许多真菌细胞壁的重要成分，几丁质酶可催化几丁质水解。

通过基因工程将几丁质酶基因转入植物体内，可增强其抗真菌病的能力。

回答下列问题：

（1）在进行基因工程操作时，若要从植物体中提取几丁质酶的mRNA，常选用嫩叶而不选用老叶作为实验材料，原因是_________________________________。

提取RNA时，提取液中需添加RNA酶抑制剂，其目的是______________________。

（2）以mRNA为材料可以获得cDNA，其原理是______________________________。

（3）若要使目的基因在受体细胞中表达，需要通过质粒载体而不能直接将目的基因导入受体细胞，原因是___________________________________________（答出两点即可）。

（4）当几丁质酶基因和质粒载体连接时，DNA连接酶催化形成的化学键是________________。

（5）若获得的转基因植株（几丁质酶基因已经整合到植物的基因组中）抗真菌病的能力没有提高，根据中心法则分析，其可能的原因是_________________________________。

2．（2016·全国Ⅰ，T40）某一质粒载体如图所示，外源DNA插入到Ampr或Tetr中会导致相应的基因失活（Ampr表示氨苄青霉素抗性基因，Tetr表示四环素抗性基因）。

有人将此质粒载体用BamHI酶切后，与用BamHI酶切获得的目的基因混合，加入DNA连接酶进行连接反应，用得到的混合物直接转化大肠杆菌，结果大肠杆菌有的未被转化，有的被转化。

被转化的大肠杆菌有三种，分别是含有环状目的基因、含有质粒载体、含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌。

回答下列问题：

（1）质粒载体作为基因工程的工具，应具备的基本条件有_______________________________________（答出两点即可）。

（2）如果用含有氨苄青霉素的培养基进行筛选，在上述四种大肠杆菌细胞中，未被转化的和仅含有环状目的基因的细胞是不能区分的，其原因是__________________；并且________________和________________的细胞也是不能区分的，其原因是_________________________________。

在上述筛选的基础上，若要筛选含有插入了目的基因的重组质粒的大肠杆菌的单菌落，还需使用含有________的固体培养基。

（3）基因工程中，某些噬菌体经改造后可以作为载体，其DNA复制所需的原料来自于________。

3．（2018·陕西第二次联考）根据基因工程的有关知识，回答下列问题：

（1）大肠杆菌质粒常作为基因工程目的基因的载体，另外，________和________也可作为载体。

若用重组质粒转化大肠杆菌，一般情况下，不能直接用未处理的大肠杆菌作为受体细胞，原因是_________________________________。

（2）利用转基因技术实现胰岛素的批量生产是目前糖尿病治疗的新思路，该过程中的关键操作环节是_________________________________。

（3）对于胰岛素基因的获取，途径之一是通过提取________细胞中的胰岛素mRNA，经过________过程合成，之后通过________技术大量扩增。

4．（2018·安徽滁州期末）苹果等果实的果肉细胞液泡中有丰富的无色的多酚类营养物质，其他一些囊泡结构中含有多酚氧化酶（PPO），催化多酚氧化成褐色物质，此过程称为果实褐变。

科学家利用基因沉默技术培育了一种不褐变的转基因苹果。

回答下列问题：

（1）将目的基因导入植物细胞采用最多的方法是__________，该方法中需将目的基因插入到农杆菌的____________上。

（2）培育不褐变的苹果采用的是第二代基因工程技术，导入的是苹果细胞原本就有的多酚氧化酶基因（PPO基因），当细胞内有许多份PPO基因时，PPO基因________形成的mRNA之间容易形成双链区而失去________机会，从而导致多酚氧化酶含量大大减少。

基因沉默分为转录水平的沉默（TGS）和转录后水平的沉默（PTGS），则培育不褐变苹果的转基因沉默属于________（填“TGS”或“PTGS”）。

（3）可用________酶从苹果基因组中切取PPO基因，也可用PCR技术从苹果基因组中克隆出PPO基因，则要实现PCR定点克隆DNA片段，最关键的是设计_________________________________。

5．（2018·安徽皖北协作区联考）某些微生物能表达黄曲霉毒素B1（AFB1）解毒酶。

将该酶添加在饲料中可以降解AFB1，清除其毒性。

下图为采用基因工程技术生产AFB1解毒酶的流程图。

―→

据图回答问题：

（1）过程Ⅰ需要选择含解毒酶的菌液中的细胞提取总RNA，理由是_________________________________。

（2）过程Ⅱ中，需要用引物的原因是_________________________________。

（3）构建酵母工程菌最常用的运载工具是________，操作程序中关键环节是________，检测酵母工程菌中AFB1解毒酶基因是否转录，应采用________方法。

（4）采用蛋白质工程进一步改造该酶的基本途径是：

从提高酶的活性出发，设计预期的________，推测应有的氨基酸序列，找到相对应的_________________________________。

考点二　克隆技术

1．理清植物组织培养的流程

（1）条件：

无菌、离体。

（2）培养基组成：

无机营养、有机营养、激素、琼脂。

（3）植物组织培养中添加蔗糖的目的是提供营养和调节渗透压。

（4）植物组织培养的目的不同，培养阶段也就不同：

①若生产人工种子，则培养到胚状体阶段。

②若提取细胞产品，则一般培养到愈伤组织阶段。

③若培育新个体，则应培养到试管苗阶段。

2．理清植物体细胞杂交技术

（1）酶解方法：

用纤维素酶和果胶酶处理。

（2）促融方法：

①物理法：

离心、振动、电激等；

②化学法：

聚乙二醇（PEG）。

（3）植物体细胞杂交即将不同种的植物体细胞，在一定条件下融合成杂种细胞，并把杂种细胞培育成新的植物体的过程，不管是染色体数、基因型还是染色体组数都采用直接相加的方法。

3．动物细胞培养

（1）动物细胞培养中两次使用胰蛋白酶的作用不同

第一次：

处理剪碎的组织，使其分散成单个细胞。

第二次：

使贴壁生长的细胞从瓶壁上脱落下来。

（2）传代细胞的特点

传代培养到10代以内的细胞核型稳定，10～50代时部分细胞核型发生变化，50代以后遗传物质可能发生变化。

（3）原代培养与传代培养的区别

区分原代培养和传代培养的关键是是否分瓶培养。

贴壁生长到一定程度需要用胰蛋白酶处理，然后再分瓶培养，原代培养结束，开始传代培养。

（4）动物细胞培养的条件

①无菌、无毒的环境；②特殊营养：

血清、血浆；③适宜的温度和pH；④气体环境：

含95%空气加5%CO2的混合气体。

4．动物细胞核移植技术

（1）选择受体细胞为去核卵母细胞的原因

①营养丰富；②体积大，易操作；③含有激发细胞核全能性表达的物质。

（2）核移植获得的克隆动物与提供细胞核的亲本性状可能不同的三个原因：

①克隆动物遗传物质来自两个亲本。

②发育过程中可能发生基因突变或染色体变异。

③外界环境可能引起不遗传的变异。

5．动物细胞融合与单克隆抗体

（1）3种细胞特点不同

①免疫后的B淋巴细胞：

能分泌抗体，不能大量增殖。

②骨髓瘤细胞：

能大量增殖，不能分泌抗体。

③杂交瘤细胞：

既能分泌抗体，又能大量增殖。

（2）2次筛选目的不同

第一次筛选：

利用特定选择培养基筛选，获得杂交瘤细胞，即AB型细胞（A为B淋巴细胞，B为骨髓瘤细胞），该细胞既能分泌抗体又能大量增殖，筛选掉A、B、AA、BB型细胞。

第二次筛选：

利用多孔板法和抗原－抗体杂交法筛选，获得产生特异性抗体的杂交瘤细胞。

1．（2017·海南，T31）甲、乙两名同学分别以某种植物的绿色叶片和白色花瓣为材料，利用植物组织培养技术繁殖该植物。

回答下列问题：

（1）以该植物的绿色叶片和白色花瓣作为外植体，在一定条件下进行组织培养，均能获得试管苗，其原理是____________________________________________________________。

（2）甲、乙同学在诱导愈伤组织所用的培养基中，均加入一定量的蔗糖，蔗糖水解后可得到________。

若要用细胞作为材料进行培养获得幼苗，该细胞应具备的条件是

_________________________________

（填“具有完整的细胞核”“具有叶绿体”或“已转入抗性基因”）。

（3）图中A、B、C所示的是不同的培养结果，该不同结果的出现主要是由于培养基中两种激素用量的不同造成的，这两种激素是________。

A中的愈伤组织是叶肉细胞经________形成的。

（4）若该种植物是一种杂合体的名贵花卉，要快速获得与原植株基因型和表现型都相同的该种花卉，可用组织培养方法繁殖，在培养时，________（填“能”或“不能”）采用经减数分裂得到的花粉粒作为外植体，原因是_______________________________。

2．（2018·广东茂名大联考）利用现代生物技术，科研人员对马铃薯的培育进行了研究，请回答相关问题：

（1）培育马铃薯脱毒苗所依据的原理是________，该培育过程涉及________和________两个阶段。

（2）研究马铃薯茎尖外植体大小对幼苗的成苗率和脱毒率的影响，结果如图。

据图可知：

茎尖越小，脱毒率________，成苗率________，培养脱毒苗茎尖的适宜大小为________。

（3）若想培育出“番茄－马铃薯”植株，运用传统有性杂交能否得到可育的杂种植株？

为什么？

_________________________________。

（4）若马铃薯细胞中含m条染色体，番茄细胞内有n条染色体，则“番茄－马铃薯”细胞在有丝分裂后期含________条染色体。

3．科学家利用细胞融合技术研究细胞膜的结构特性，进行了下列实验。

（1）将鼠细胞和人细胞在________培养箱中培养一段时间，用________处理，获取实验用的单细胞悬液。

（2）将两种细胞在37℃下混合培养，在培养液中加入________诱导融合，形成融合细胞，一般两两融合的细胞有________种。

（3）细胞膜的主要成分是磷脂和蛋白质。

将连接了荧光染料的抗体与融合细胞在一定条件下培养，抗体与融合细胞的膜蛋白（抗原）特异性结合，其目的是标记膜蛋白，以便于显微镜观察。

用荧光显微镜观察融合细胞表面荧光的颜色和________，开始时，鼠的细胞为绿色，人的细胞为红色，两种颜色不混合；一段时间后，可观