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5微生物的遗传和变异
第5章微生物的遗传和变异
本章要点：
1.遗传变异的物质基础。
2.基因突变的特点和机制。
3.菌种如何选育及如何诱变育种?
4.基因重组。
5.基因工程的原理和操作步骤。
6.如何保藏菌种？
5.1基因对遗传性状的控制
5.1.1遗传和变异的物质基础DNA
遗传变异的物质基础曾是生物学中激烈争论的重大问题。
1944年Avery等人以微生物为研究对象进行的三个经典实验有力地证实了核酸是遗传物质，基因是其信息单位，染色体是其存在形式。
一.证明核酸是遗传变异的物质基础的经典实验
1.转化实验
转化指A品系的生物吸收了来自B品系生物的遗传物质从而获得B品系的遗传性状的现象。
转化现象是格里菲斯（Griffith）于1928年研究肺炎链球菌感染小白鼠的实验中发现，后经艾弗里（Avery）等于1944年证实的。
2.噬菌体感染实验
1952年，侯喜（A.D.Hershey）和蔡斯（M.Chase）为了证实噬菌体的遗传物质是DNA，用放射性同位素标记大肠杆菌T2噬菌体进行实验（图5-1）。
图5-1噬菌体感染实验
3.植物病毒重建实验
1956年Fraenkel-Conrat等用含RNA的烟草花叶病毒进行了病毒（TMV）重建实验（图5-2），证实了RNA是遗传物质。
图5-2TMV重建实验
5.1.2DNA的结构与复制
一.DNA的化学组成
DNA是一种大分子化合物，由4种核苷酸组成。
每一种核苷酸又由碱基、脱氧核糖和磷酸3部分构成。
4种核苷酸的差异仅在于碱基不同。
在DNA中，4种碱基是；腺嘌呤（adenine，A）、鸟嘌呤（guanine，G）、胞嘧啶（cytosine，C）和胸腺嘧啶（thymine，T）。
脱氧核糖1位上的碳原子与嘌呤9位上的氮原子相连，5位上的碳原子与磷酸相连，就构成了4种不同的核苷酸。
二.DNA的双螺旋结构模型
1953年美国遗传学家沃森（JamesDewayWatson）和英国物理学家克里克（FrancisHarryComptonCrick）根据英国晶体衍射专家维尔金斯（MauriceHughFrederickWilkins）对脱氧核糖核酸的X射线衍射资料，以及碱基含量分析、键长键角资料、酸碱滴定数据等，提出了像麻花、油条一样扭在一起的DNA双螺旋结构模型（图5-3、5-4）。
图5-3DNA的一级结构图5-4DNA分子双螺旋结构示意图
三.DNA的复制
通过实验证明，DNA的复制是以半保留复制（semiconservativereplication）形式进行的。
其复制过程是这样的：
首先碱基对间的氢键断裂，两条核苷酸链的螺旋松开，碱基显露出来，就像拉链一样拉开。
然后以每条单链为模板，按照碱基对互补的要求，在DNA多聚酶的催化作用下，通过碱基配对，逐渐合成一条新的核苷酸链，再和旧链形成新的双螺旋。
5.2基因突变
突变泛指细胞内（或病毒颗粒内）的遗传物质的分子结构或数量突然发生的可遗传的变化。
突变往往导致产生新的等位基因及新的表现型。
狭义的突变专指基因突变，也称点突变，而广义的突变则包括基因突变和染色体畸变。
突变的概率一般很低，约为10-6×10-9。
突变是工业微生物产生变种的根源，是育种的基础，但也是菌种发生退化的主要原因。
5.2.1微生物突变体的主要类型
基因突变的类型极为多样。
人们可从不同的角度对基因突变进行分类，并给以不同的名称。
根据突变体表型不同，可把突变分成以下几种类型：
营养缺陷型、抗性突变型、条件致死突变型、形态突变型、抗原突变型、其他突变型。
5.2.2基因突变的分子基础
一.碱基置换及其对遗传信息的影响
碱基置换是指DNA中核苷酸的一个碱基被另一个碱基所取代。
其中一个嘌呤被另一个嘧啶或是一个嘧啶被另一个嘌呤所取代（G→C或C→G），叫颠换（transversion）；如果一个嘌呤被另一个嘌呤或是一个嘧啶被另一个嘧啶所取代，称转换（transition）。
根据它们对氨基酸序列的影响不同，可分为下列几种情况：
1.同义突变：
由于遗传密码具有简单性，所以有些碱基替换并不造成氨基酸的变化。
2.错义突变：
指碱基替换后引起氨基酸序列的改变。
有些错义突变严重影响到蛋白质的活性，甚至使活性完全丧失，从而影响了基因的表型。
3.无义突变：
编码区的单碱基突变导致终止密码子的形成，使mRNA的翻译提前终止，形成不完整的肽链，因而其产物一般是没有活性的。
二.移码突变及其产生
由于在DNA分子的编码区插入或缺失非3的整数倍个（1个、2个或4个）核苷酸而导致的阅读框架的位移。
因为遗传信息是按3个碱基为一组依次排列而成的，蛋白质的翻译是从起始密码子开始，按密码子顺序依次向下读码。
当在起始密码子后面加入1个、2个或4个碱基后，则后面的所有密码子的阅读框都发生改变，结果翻译出来的蛋白质的氨基酸序列与野生型完全不同。
当然，如果插入或缺失的碱基正好是3个或其整数倍，那么在翻译出的多肽上可能是多一个、几个或少一个、几个氨基酸，而不完全打乱整个氨基酸序列。
三.缺失和重复
大片段的缺失或重复（超过几个碱基对）是基因突变的主要原因之一。
特别是在放线菌中的自发突变中，缺失或重复范围从几个基因到几十个基因。
5.2.3基因突变的特点
一.不对应性：
即突变的性状与引起突变的原因间无直接的对应关系。
二.自发性：
由于自然界环境因素的影响和微生物内在的生理生化特点，在没有人为诱发因素的情况下，各种遗传性状的改变可以自发地产生。
三.稀有性：
生物的基因自发突变是随时发生的，但发生的几率是很低的，即突变率很低，也很稳定，一般在10-6～10-9之间。
这反映了物种和基因的相对稳定性。
四.独立性：
基因突变的发生一般是独立的，即在某一群体中既可能发生抗青霉素的突变型，也可发生抗链霉素或其他某药物的突变型，而且还可发生不属抗药性的突变型。
五.可诱变性：
通过各种物理、化学诱变剂的作用，提高突变率，一般可提高10～105倍。
六.可逆性：
基因突变的过程是可逆的。
通常存在于某种生物中的野生型基因A可突变为对应的基因a，这个过程称为正向突变；反之，由基因a也可以突变成野生型基因A，称为回复突变或回变。
七.稳定性：
突变的根源是遗传物质结构发生了稳定的变化，产生的变异性状是稳定的、可遗传的。
5.2.4基因突变的机制
突变是DNA分子结构或数目的变化。
据引起变化的原因可分为自发突变和诱发突变；据DNA变化的程度可分为基因突变和染色体畸变。
一.碱基置换
A＝TT＝A颠换
C＝GG＝C转换
碱基对的转换可由互变异构和化学诱变引起。
1.互变异构
在DNA分子的四种碱基中，胸腺嘧啶（T）和鸟嘌呤（G）可以酮式或烯醇式出现。
胞嘧啶（C）和腺嘌呤（A）可以氨基式或亚氨基式出现。
在生物体中，一般以酮式和氨基式结构存在。
但在极少数情况下，胸腺嘧啶分子中的N3位上的氢能转移到C4位氧上，使酮式转变为烯醇式，但瞬间即恢复为酮式，这种分子结构上的互变称为互变异构。
如果就在变为烯醇式的瞬间，DNA的复制刚好到达这一部位，这时的胸腺嘧啶就不再与腺嘌呤配对，而与鸟瞟岭配对。
2.化学诱变剂引起的碱基对置换
能够引起DNA分子中碱基对置换的诱变剂很多，常见的有碱基结构类似物，如亚硝酸、羟胺、烧化剂等。
它们可直接或间接地引起DNA分子的碱基对置换。
二.移码突变
移码突变指DNA分子中增添或缺失少数几个碱基对，而造成其后面全部遗传密码发生转录和翻译错误的基因突变。
点突变一般只涉及到一个密码子的改变，而移码突变涉及到了突变点以后所有密码子的改变，因此是一类影响较大的突变。
与染色体畸变相比，移码突变仍属于DNA分子的微小损伤。
三.染色体畸变
由于某些理化因素的作用造成DNA分子的大损伤所引起的突变叫染色体畸变。
包括染色体的缺失、重复、插入、易位和倒位，也包括染色体数目的变化。
染色体结构上的变化可分为染色体内畸变和染色体间畸变两类。
引起染色体畸变的原因很多，可以自发地进行，也可以诱发进行。
亚硝酸等诱发点突变的诱变剂，也可引起染色体畸变。
物理诱变剂一般以引起染色体畸变为主。
1.紫外线：
DNA具有强烈的紫外吸收能力，尤其是核酸链上的碱基对。
其主要生物学效应是其对DNA的作用，包括使DNA链断裂、DNA链内或链间交联、嘧啶碱的水合作用及胸腺嘧啶二聚体的形成。
2.X射线、γ射线和快中子：
X射线、γ射线和快中子等属于电离辐射，穿透力强，碰到原子或分子便产生次级电子，次级电子可产生电离作用。
它们的直接效应是碱基间、DNA间、糖与磷酸间的化学键断裂；间接效应是电离作用引起水或有机分子产生自由基作用于DNA分子，导致缺失或其他损伤。
3.热：
可使胞嘧啶脱氨基变成尿嘧啶，从而引起碱基配对错误；还可引起鸟嘌呤脱氧核糖键移动，从而在DNA复制时出现碱基对的错配。
4.生物诱变因子：
转座因子也是实验室中常用的诱变因子，它们可在基因组的任何部位插入，引起该基因的失活导致突变。
转座因子是细胞中能改变自身位置的一段DNA序列。
5.3菌种的选育
选种是根据微生物的特性，采用各种分离筛选方法，从自然界中或从生产实践中选出符合人们要求的菌种。
育种是根据微生物遗传变异的原理，在已有的菌种基础上，采用诱变或杂交的方法，迫使菌种发生变异，然后在变异的菌株中挑选出符合生产实际要求的菌种。
5.3.1从自然界中获得新菌种
一.从自然界中选种
1.样品采集
根据我们的目的到最合适的地方去采集样品。
在这方面，掌握了解微生物的生态知识有利于菌种的筛选。
从土壤中采集样品，又称采土。
采土的时候，应注意土壤肥瘦、采土深度、采土季节、采土方法。
2.增殖培养
增殖培养是往样品中加人适合某些微生物生长繁殖的物质，或创造有利于某些微生物生长繁殖的环境条件，这样就促进了某些微生物大量繁殖，如往土样中加入一些石油，能利用石油的微生物容易生长繁殖；把土样加入到含糖浓度高的培养基中，并把pH调到4以下，就可使酵母菌得到增殖。
3.分离纯化
分离纯化有很多方法：
平板划线分离法、稀释涂布分离法、单孢直接挑取法、菌丝尖端切割法等。
4.性能测定
性能测定分粗测和精测。
粗测又称初筛，主要起定性的作用，一般在培养皿上进行。
经初筛后的菌种还要进行精测，才能适合生产的需要。
精测又称复筛，一般采用接近生产工艺条件的三角烧瓶液体进行振荡培养或用台式发酵罐进行发酵，然后测定发酵液，再进行分析比较，最后选出比较理想的菌种。
二.从生产中选种
在生产过程中，经常注意那些菌体形态或菌落性状以及某些生理性能上发生自然变异的微生物，将它们挑选出来，进行比较试验，有时可以选出更加理想的菌种。
5.3.2自发突变与定向培育
一.自发突变的原因
引起微生物自发突变的因素很多，主要有以下几方面：
DNA复制、微生物自身产生诱变物质、环境对微生物的诱变作用等。
二.自发突变的偶然性及其热点
S.Luria等人提出突变是一个偶然事件，突变概率很低，这些突变可发生在任一瞬间、任一碱基，这是难以预见的，因此任何时间、任何基因或任一个基因位置都有可能发生突变，这似乎说明突变是随机的，但有些事实证明突变并非是完全随机的，突变位置也并非是完全随机分布的。
发现突变热点和突变频率有某种规律性。
所谓突变热点是指同一基因内部突变率特别高的位点。
3.定向育种
定向育种是指在某一特定条件下，长期培养某一微生物菌群，通过不断转接传代以积累其自发突变，并最终获得优良菌株的过程。
由于自发突变的频率较低，变异程度较轻微，故用此法育种十分缓慢。
5.4诱变育种
诱变育种是人为的利用物理和化学等因素，使诱变的细胞内遗传物质染色体或DNA的片段发生缺失、易位、倒位、重复等畸变，或DNA的某一部位发生改变（又称为点突变），从而使微生物的遗传物质DNA和RNA的化学结构发生变化，引起微生物的遗传变异，然后设法从群体中选出少数优良性状的菌株，以供科学实验或生产实践中使用。
5.4.1物理诱变
一.紫外线（UV）诱变
DNA和RNA的嘌呤和嘧啶有很强的紫外光吸收能力，最大的吸收峰在260nm。
对于紫外的作用已有多种解释，但研究的比较清楚的一个作用是使DNA分子形成嘧啶二聚体，阻碍碱基正常配对，并可能引起突变或死亡。
另外嘧啶二聚体的形成，还会妨碍双链的解开，影响DNA的复制和转录。
二.激光诱变
激光辐射可以通过产生光、热、压力和电磁场效应的综合作用，直接或间接地影响生物有机体，引起细胞DNA或RNA、质粒、染色体畸变效应、酶的激活或钝化，以及细胞分裂和细胞代谢活动的改变。
不同种类的激光辐射生物有机体，所表现出的细胞学和遗传学变化也不同。
三.离子束注入诱变
通过对人们所希望的离子进行加速，从而对细胞进行刻蚀加工。
注入细胞内部的离子可对部分基因进行修饰、加工、引导外源基因，尤其是大分子基因组转入受体细胞，实现在新遗传背景下的诱变育种及遗传转化。
四.徽波辐射诱变
微波能够透射到生物组织内部，使偶极分子和蛋白质的极性侧链以极高的频率振荡，增加分子的运动，导致热量的产生。
微波还能够对氢键、疏水键和范德华力产生作用，使其重新分配，从而改变蛋白质的构象与活性。
五.空间诱变
高空诱变就是利用高空探测气球搭载微生物，经过大气的平流层或电离层的电离辐射而诱发细胞变异。
5.4.2化学诱变
化学诱变就是利用化学诱变剂处理分散均匀的微生物细胞群，以引起碱基置换、染色体断裂、基因重组或基因突变等生物学效应，使后代产生变异。
然后采用简便、快速、简单的筛选方法，可筛选符合育种目标的菌株，以供生产实践或科学研究用。
化学诱变剂是靠各自的活性基团，靠它们特有的化学特性直接与生物分子进行各种特定的化学反应，从而引起生物分子化学性质的变化。
化学诱变剂的种类很多，根据它们对DNA的作用机制，可以分为三大类：
第一类是烷化剂，它与一个或多个核酸碱基起化学变化，因而引起DNA复制时碱基配对的转换而发生变异。
例如硫酸二乙酯、亚硝酸、甲基磺酸乙酯、N-甲基-N’-亚硝基胍、亚硝基甲基脲等。
第二类是一些碱基类似物，它们通过代谢作用渗入到DNA分子中而引起变异，例如 5-溴尿嘧啶、5-氨基尿嘌呤、2-氨基嘌呤、8-氮鸟嘌呤等。
第三类是吖啶类，它造成DNA分子增加或减少一、二个碱基，从而引起碱基突变点以下全部遗传密码在转录和翻译时产生错误。
5.5基因重组
将两个不同性状个体内的基因通过一定途径转移到一起，经过遗传分子间的重新组合，形成新的遗传型个体的过程称为基因重组或遗传重组。
5.5.1原核微生物的基因重组
原核微生物的基因重组形式很多，机制较远时，其特点是①片段性，仅一小段DNA序列参与重组；②单向性，即从供体菌向受体菌（或从供体基因组向受体基因组）作单方向转移；③转移机制独特而多样，基因重组的方式主要有转化、转导、接合和原生质体融合几种形式。
5.5.2真核微生物的基因重组
在真核微生物中，基因重组方式很多，主要有有性杂交、准性杂交、原生质体融合和遗传转化等，其中原生质体融合和遗传转化与原核生物中介绍过的内容基本相同，这里仅介绍有性杂交和准性杂交。
一.有性杂交
杂交是在细胞水平上进行的一种遗传重组方式。
有性杂交一般指细胞间的接合和随之发生的染色体重组，并产生新遗传型后代的一种育种技术。
凡能产生有性孢子的酵母菌、霉菌和覃菌，原则上都可应用与高等动、植物杂交育种相似的有性杂交方法进行育种。
二.准性杂交
准性生殖是一种类似于有性生殖，但比它更为原始的一种两性生殖方式，它可使同种生物两个不同菌株的体细胞发生融合，且不以减数分裂的方式而导致低频率的基因重组并产生重组子。
因此可以认为，准性生殖是在自然条件下真核微生物体细胞间的一种自发性的原生质体融合现象。
准性生殖常见于某些真菌，尤其是还未发现有性生殖的半知菌类。
5.6基因工程
基因工程（Geneticengineering）或重组DNA技术（RecombinantDNAtechnology）是指在基因水平上的遗传工程，它是用人为的方法将所需的某一供体生物的遗传物质DNA分子提取出来，在离体条件下切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后导入某一受体细胞中，让外来的遗传物质在其中进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种育种技术。
5.6.1基因工程的发展历史
微生物育种的实践推动着微生物遗传变异基本理论的研究，而对遗传变异本质的日益深入研究又大大促进了遗传育种的发展。
1927年，发现X射线能诱发生物体突变，以后又发现紫外线等物理因子的诱变作用，于是很快被应用于早期的青霉素生产菌种Penicilliumchrysogenum（产黄青霉）的诱变育种中，并取得了显著成效；1946年，当发现了化学诱变剂的诱变作用，并初步研究了它们的作用规律后，在生产实践中就掀起了利用化学诱变剂进行诱变育种的热潮；几乎在同一时期，由于对真核微生物的有性杂交、准性杂交和原核微生物种种基因重组现象的研究，在育种实践上出现了各种杂交育种新技术；步入20世纪50年代以来，由于对遗传物质的存在形式、转移方式以及结构功能等问题研究，促进了分子遗传学的飞速发展。
5.6.2基因工程的主要过程
基因工程技术涉及如下步骤：
目的基因（即外源基因或供体基因）的获取，通常包括DNA的纯化技术、酶促消化或机械切割、以游离目的DNA序列；载体系统的选择，对细菌细胞来说，合适的克隆载体有质粒和细菌噬菌体；目的基因与克隆载体的连接，形成重组体；将重组DNA分子转到合适的宿主中，如大肠杆菌，当利用质粒时，对一重组的病菌载体来说此过程又称为转化或转染；“工程菌”或“工程细胞株”的表达、监测及实验室和一系列生产性试验等，利用细胞培养技术，培养筛选转化的细胞，一个转化的宿主细胞能生长并产生遗传上相同的克隆细胞，每个细胞都携带着转化的目的基因。
图5-5基因工程的主要原理与操作步骤示意图
5.6.3基因工程的应用
基因工程正在或即将使人们的某些梦想和希望变成现实。
基因工程广泛应用于工业、食品、农业、医疗、采矿、冶炼、材料、能源、环境保护和生物学基本理论的研究，带动了生物技术的高速发展。
重要的应用有：
基因工程药物、转基因植物和转基因动物、改造传统工业发酵菌种、基因治疗、基因工程在微生物研究中的应用、基因工程在环境保护中的应用等。
5.6.4基因工程研究展望
基因工程的兴起导致生物科学发生了深刻的变化，主要表现引发了生物科学中技术上的创新和迅猛发展；技术上的重大突破，促使生物科学获得前所未有的高速发展；为改造生物提供强有力的手段，使生物学进入创造性的新时期。
5.7菌种保藏与灭菌
5.7.1菌种的退化和防治
一.菌种退化
生产菌株生产性状的劣化、遗传标记的丢失称为菌种退化。
菌种退化可以是形态上的，也可以是生理上的，具体表现有①菌落和细胞形态的改变；②生长速度缓慢，产孢子越来越少；③代谢产物生产能力地下降；④致病菌对宿主侵染力的下降，⑤抗不良环境条件（抗噬菌体、抗低温、抗高温等）能力的减弱等。
二.菌种退化的原因
1.基因突变
菌种退化的主要原因就是那些控制生产性状的基因发生负突变。
退化性变异是大量存在的，而进化性变异则是个别的。
2.分离现象
遗传育种获得的菌种若是多核（或是单核）但DNA双链之一发生突变，随着传代，其生产性状也将发生退化。
这种退化不是基因突变引起的，而是由于诱变获得的高产株本身不纯。
三.菌种退化的防治
1.从菌种选育时考虑
在育种过程中，应尽可能使用孢子或单核菌株，避免对多核细胞进行处理，采用较高剂量使单链突变的同时，另一条单链丧失了模板作用，可以减少出现分离回复现象；同时，在诱变处理后应进行充分的后培养及分离纯化，以保证获得菌株的“纯度”。
2.从菌种保藏角度考虑
不论在实验室还是在生产实践上，必须严格控制菌种可传代次数。
斜面保藏的时间较短，只能作为转接和短期保藏的种子用，应该在采用斜面保藏的同时，采用沙土管、冻干管和液氮管等能长期保藏的手段。
3.从菌种培养的角度考虑
各种生产菌对培养条件的要求和敏感性不同，培养条件要有利于生产菌株，不利于退化菌株的生长。
4.从菌种管理的角度考虑
菌种复壮就是在菌种发生退化后，通过纯种分离和性能测定，从退化的群体中找出尚未退化的个体，以达到恢复该菌种原有性状的一种措施，但这是一种消极的措施。
5.7.2菌种保藏的原理和方法
一.定期移植保藏法
将菌种接种于适宜的斜面或液体培养基，也可进行穿刺培养，待生长成健壮的菌体（对数期细胞、有性孢子或无性孢子）后，将菌种放置4℃冰箱保藏，每间隔一定时间需重新移植培养一次。
二.液体石蜡保藏法
在生长良好的斜面表面覆盖一层无菌的液体石蜡，液面高出培养基1cm，将其置试管架上以直立状态低温保藏。
液体石蜡可防止水分蒸发、隔绝氧气，所以能延长保藏时间。
但缺点是必须直立放在冰箱中，占据较大空间。
三.沙管保藏法、土壤保藏法
土壤是自然界微生物的共同活动场所，土壤颗粒对微生物具有一定的保护作用。
取河沙过24目筛，用10%～20%的盐酸浸泡除去有机质，洗涤、烘干、分装入安瓿管，加塞灭菌。
需要保藏的菌株先用斜面培养基培养，再用无菌水制成细胞或孢子悬液，将10滴悬液注入装有洗净、灭菌河沙的沙管内，使细胞或孢子吸附在沙上，放到干燥器中吸干河沙中的水分，将干燥后的沙管用火焰熔封管口，可室温或低温保藏。
四.麸皮保藏法
将麸皮（也可用各种谷物代替）与水或其他培养基成分以一定比例拌匀，加水或培养液与麸皮的比例为1:
0.8或1:
1或1:
105，原则上是按照不同菌种对水分的不同要求而定。
将拌匀的麸皮分装在试管或安瓿管等容器里，装入的麸皮应保持疏松，不要压紧。
高温灭菌后，将菌种的孢子液接入。
适宜温度下培养，直至长出菌丝。
再放在干燥器中干燥后，20℃以下温度保藏。
也可将小管用火焰熔封。
该法操作简单，菌种保藏时间长，不易退化，工厂中经常采用。
五.蒸馏水保藏法
每个试管中装5ml灭菌的无菌水，用接种针从斜面或平板上挑取一环菌种细胞，接入蒸馏水中并使之悬浮，试管用无菌的橡皮塞塞紧，放置10℃低温保藏。
需用时，可从管内移出一环接到培养基上，而原来的管加塞后仍可继续保藏。
六.冷冻干燥保藏法
该法是将菌液在冻结状态下升华其中水分，最后获得干燥的菌体样品。
它同时具备干燥、低温和缺氧的菌种保藏条件，所以，可使微生物菌种得到较长时间的保存。
七.液氮超低温保藏法
液氮超低温保藏过程是将菌种悬浮液封存于圆底安瓿管或塑料的液氮保藏管（材料应能耐受较大温差骤然变化）内，放到-150～-196℃的液氮冰箱内保藏。
操作过程中一大原则是“慢冻快融”。
八.甘油保藏法
甘油保藏法浴液氮超低温保藏法类似。
菌种悬浮在10%（体积分数）甘油蒸馏水，置低温（-70～-80℃）保藏。
该法较简便，保藏期较长，但需要有超低温冰箱。
实际工作中，常将待保藏的菌种培养至对数期的培养液直接加到已灭菌的甘油中，并使甘油的终浓度在10%～30%左右，再分装于小离心管中，置低温保藏。
基因工程菌常采用该法保藏。
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