枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用.docx

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枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用

枯草芽孢杆菌在生物菌肥中的应用

作者：

2007级生物工程4班陈聪

指导教师：

马传营技术员

摘要：

介绍了生物菌肥的种类和特点，分析了菌肥在提高土壤肥力、协助营养吸收、促进矿质营养释放、改善品质及增产和减少病虫害等方面的作用。

分析了生物菌肥相对于化肥的优势以及国内外对生物菌肥的研究情况，并对其发展进行了展望。

枯草芽孢杆菌作为一种具有研究、应用和商业价值的微生物菌种在生物菌肥的研究中起到了重要作用，近年来国内外对枯草芽孢杆菌的研究应用有了很大的进展，利用其对玉米小斑病菌的拮抗作用可研发生产有效防治玉米小斑病的生物菌剂。

关键词：

生物菌肥；枯草芽孢杆菌；玉米小斑病菌；拮抗作用；生物防治

TheapplicationofBacillussubtilisinbio-fertilizer

Abstract:

Describesthetypesandcharacteristicsofbio-fertilizer,analysesthefunctionoffertilizertoimprovesoilfertility,helpnutrientabsorption,promotethereleaseofmineralnutrients,improvecropquality,increasecropproductionandreducepestsanddiseasesetc.AnalysestheadvantagesofthebiologicalfertilizercomparedtothechemicalfertilizersandtheresearchsituationinChinaandabroad,alsodiscusseditsdevelopmentinthefuture.Bacillussubtilisasakindofmicrobialstrainshasplayedanimportantroleinthestudyofbio-fertilizerbecauseofitsresearch,applicationandcommercialvalue,inrecentyears，theresearchandapplicationofBacillussubtilisinChinaandabroadhasgainedagreatprogress,usingitsantagonisticmechanismonBipolarismaydiscanproducenewbiologicalagentstoeffectivelypreventthesouthernleafblightofcorn.

Keywords:

bio-fertilizer;Bacillussubtilis;Bipolarismaydis;Antagonism;BiologicalControl

1引言

生物菌肥的发展

长期以来，由于我国在农业生产中大量使用化学肥料，使得所施肥料的利用率低，致使土壤板结、土壤微生物区系发生变化、食品质量不安全，还造成大量的经济损失和环境恶化等一系列的社会问题，由于化学农药的大量使用，使病虫产生了抗药性，化肥农药的残留严重危害了人类健康。

在当前农业可持续发展的形势下，开辟微生物肥料部分替代化肥日益受到重视[1]。

生物菌肥是近年来发展起来的一种新型肥料，它是一种多元素肥料，主要由固氮菌、解钾菌及多种微量元素和腐殖酸组成。

由于含有大量的微生物，生物菌肥主要以微生物生命活动的产物来活化土壤，改善作物营养条件和生长环境，另外，生物菌肥还具有改良土壤、抗旱、培肥地力、促早熟、抵抗病虫害等功效，还能解决土壤化肥农药残留等问题，从而发挥土壤的潜在肥力，提高农产品的产量和品质。

枯草芽孢杆菌是芽孢杆菌属的一种。

是一种好氧型、内生抗逆孢子的杆状细菌，广泛存在于自然界中如土壤、湖泊、海洋和动植物的体表，自身没有致病性。

该菌作为植物病害生防细菌之一，具有较强的防病作用，在极端的条件下，还可以诱导产生抗逆性很强的内源孢子[2].由于该菌能产生耐热的芽孢，既易于生产，进行剂型加工，又易于存活，定殖与繁殖[3]。

枯草芽孢杆菌的批量生产工艺简单，成本较低，施用方便，储存期长，而且其制剂的稳定性，与化学制剂的相容性和在不同植物、不同年份防治效果的一致性方面均优于不产生芽孢的细菌和真菌生防菌株，是一种较理想的生防微生物。

生物菌肥的种类及特点

狭义的生物肥料，是通过微生物生命活动，是农作物得到特定的肥料效应的制品，它本身不含营养元素，不可替代化肥。

广义的生物肥料既含有作物所需的营养元素，又含有微生物制品，是生物、有机和无机的结合体，也可以说是利用高科技手段将野外环境中筛选出来的微生物经诱变、复壮后，再经工业发酵精加工而成的一种高含菌量的生物制品。

1.2.1生物菌肥的分类

生物菌肥从作用上可分为：

生物固氮菌剂；分解土壤有机物菌剂（有机磷细菌肥、综合细菌肥）；分解土壤难溶性矿物质的菌剂（硅酸盐细菌肥料、无机磷细菌肥料）；抗病与刺激作物生长的菌剂（抗生菌肥料）。

从成分上可分为：

单纯生物肥和有机-无机-生物复合肥。

单纯生物肥只富含微生物，单独使用不能给农作物供给充足的营养，需与化肥或者有机肥混合使用；有机-无机-生物复合肥综合了各类肥料的特点，可以提供较为全面的营养需要。

1.2.2生物菌肥的特点

生物菌肥作为一种生物制剂与化学肥料相比具有以下特点：

①不破坏土壤结构，保护生态，不污染环境，对人、牲畜和植物无毒无害；②肥效持久；③提高作物产量和改进作物产品品质；④成本低廉；⑤有些种类的生物菌肥对作物具有选择性；⑥其效果往往受到土壤条件（如养分、有机质、水分、酸碱度等）和环境因素（如温度、通气、光照等）制约；⑦一般不能与杀虫剂、杀菌剂（杀真菌或杀细菌）混用；⑧易受紫外线的影响，不能长期暴露于阳光下照射[4]。

生物菌肥的作用

1.3.1促进土壤形成

微生物在土壤形成过程中起到了至关重要的作用，土壤中含有的有机质和微生物的活动使土壤中含有丰富的矿物质元素，从而可以培养农作物，生物菌肥含有大量的微生物，进一步提高了土壤培养农作物的能力。

1.3.2提高土壤肥力水平

微生物在生命活动中，不断分解土壤中的有机质，产生多种有机酸（如腐殖酸），增强土壤的保肥能力。

在改善土壤物理性质、化学性质和生物性质的同时，生物菌肥的使用也很大程度提高了土壤的全氮量，使得土壤全量养分的含量提高。

另外，生物菌肥使土壤养分可以重复利用，如氮、钾、磷等，提高了土壤养分的有效性。

1.3.3提高作物产量

调查结果显示：

生物菌肥在于化肥结合使用下，比传统化肥施用方式增产5%-10%，占增产报道总数的%，增产10%-15%的占到%，增产15%-20%的占%，报道增产20%以上的占%。

1.3.4增加作物抗性

在生物菌肥进入土壤之后，一方面有益菌在植物根际大量繁殖，在植物根区形成优势种群，同时有益菌在生长繁殖过程中，还会分泌出多种有机酸和抗生素等物质，从而抑制病原菌等有害菌的繁殖；另一方面，有些有益菌群在植物根部形成一道生物屏障，以阻止有害菌的入侵和定殖[5]。

1.3.5减少环境污染

化肥的滥用、污水灌溉造成环境污染、土壤质量下降、农产品质量下降等问题，而生物肥料不会带来着这些负面影响，反而会帮助解决工业垃圾和生活废弃物的处理，增加土壤肥力，降解土壤中残留农药化肥，减少环境污染。

1.3.6提高作物品质

国内外大量研究和实验证明，生物菌肥的科学使用不尽能够提高作物产量，减少成本，保护环境，而且能够明显提高农产品的品质，如蛋白质、糖、维生素等物质的含量均有所提高，在有些情况下，改善产品品质比提高产量的好处更大。

生物菌肥中的有效微生物

自然界中不少微生物（病毒、细菌、真菌和线虫）具有杀虫、杀菌、除草及植物生物调节活性。

此类微生物具有很高的专一性，其对靶标害物具有极高的选择性，而对其他生物却十分安全。

利用微生物的这种特性生产的菌肥分为细菌肥料、放线菌肥料、真菌类肥料、光合细菌肥料、复合菌剂肥料等。

枯草芽孢杆菌作为细菌的一种，也具有作为有效生物菌肥菌种的潜质。

1.4.1枯草芽孢杆菌在农业中的应用

随着科学技术的发展，人们对微生物的研究更加深入。

由于生物防治对环境生态和人类健康无毒害的优点而备受重视，从而得到了越来越广泛的应用。

枯草芽孢杆菌作为一种有效恢复土壤活性及防治害虫的优良菌种，具有较悠久的研究历史，目前在全球范围内有数百株野生型枯草芽孢杆菌记录保存，该细菌可以产生40余种抗菌物质，其中很多具有优良性状的菌株已应用于生产实践，例如，美国的GEO3、MBI600、QST713和B.subtilis.var.amyloliquefaciens,澳大利亚开发的B.subtilisA213,日本东京技术研究所的B.subtilisRB-14,中国研发的B916、B908、B3、B903、XM16等[6]。

1.4.2枯草芽孢杆菌国内研究概况

国内对枯草芽孢杆菌的研究主要包括大田作物的叶部病害、果实病害和土传病害等。

枯草芽孢杆菌可以从植物体内分离出来，研究表明植物内生菌对植物生长具有促进作用，内生菌可增进宿主植物对N、P等营养元素的吸收，对宿主植物的生长起促进作用[7]。

不同菌株的作用机理存在很大的差异。

现已从作物的根际土壤、根表、植株及叶片上分离筛选出多株可以拮抗不同作物病害的枯草芽孢菌株，并对这些菌株进行了发酵条件的研究，对其中分离处得抗菌物质进行了特性研究，同时开展了温室和大田试验。

国内已成功开发并投入生产的枯草芽孢杆菌商品制剂有麦丰宁、纹曲宁、依天得、百抗、根腐消等。

其中麦丰宁对小麦纹枯病田间防效达50％~80％，它主要产生一种抗菌物质来一直病原菌菌丝的生长、菌核形成及萌发。

纹曲宁是100亿活芽孢／ml枯草芽孢杆菌水剂和％井冈霉素的复混制剂。

“百抗”已在多个省推广使用。

百抗对水稻纹枯病防效70％以上，其作用机制为位点占领、营养竞争等。

根腐消主要防治三七根腐病。

枯草芽孢杆菌为细菌性植物保护剂，是多种植物病原菌的竞争性抑制剂。

它通过竞争性生长繁殖占据生存空间的方式来阻止植物病原菌的生长，能在植物表面迅速形成一层保护膜，使农作物免受病原菌为害。

枯草芽孢杆菌还能分泌抑菌物质，抑制病菌孢子发芽和菌丝生长。

下表1列出了国内研发的主要枯草芽孢杆菌制剂。

表1我国已注册的枯草芽孢杆菌菌剂产品[8]

Table1BacillussubtilisbacteriumagentproductsregisteredinChina

产品名

公司

有效成分

剂型

主要防治对象

文曲宁

江苏农业科学院植保研究所

B.subtilisB916+井冈霉素

水剂

水稻纹枯病、稻曲病

百抗

云南农业大学，中国农业大学和云南星耀生物制品厂

B.subtilisB908

可湿性粉剂

水稻纹枯病，三七、烟草、花卉、小麦、白菜等土传病害

台湾宝

光华化工股份有限公司

B.subtilis

可湿性粉剂

白粉病、灰斑病、炭疽病等疾病

麦丰灵

南京农业大学

B.subtilisB3

粉剂

小麦纹枯病

亚宝

香港经纶全汛有限公司

B.subtilis

可湿性粉剂

水稻纹枯病、稻瘟病、甘蓝黑斑病

枯草芽孢杆菌BS-208杀菌剂

武汉天惠生物有限公司

B.subtilisBs-208

可湿性粉剂，水剂

黄瓜白粉病、草莓白粉病和灰霉病、番茄灰霉病、棉花黄萎病、枯萎病和立枯病等

增产剂

中国农业大学植物生态工程研究所与上海农乐生物工程为制品厂

Bacillus.spp

可湿性粉剂，水剂

活体微生物生长调节剂，对作物具有壮苗、抗病及增产作用

威绿达

浙江大学生物技术研究所

B.subtilis+绿色木霉+毛壳酶

菌肥

有效防治猝倒病、根瘤病、立枯病、枯萎病等病害，促进作物生长，增加作物产量

1.4.3枯草芽孢杆菌国外研究概况

二十世纪四十年代，枯草芽孢杆菌被证明具有防止植物病害的作用。

自此之后，对枯草芽孢杆菌的研究成为各国的研究热点。

枯草芽孢杆菌可以防治水稻等作物的多种土传真菌病害、豌豆根腐病等。

迄今为止，已有多种枯草芽孢杆菌制剂应用于农业生产中，例如由美国研发并登记注册的杀菌剂Serenade和SouataAS,可防治蔬菜水果灰霉病、白粉病等真菌和细菌病害。

韩国研制的杀菌剂Mildewide,主要防治霜霉病、白粉病等真菌病害。

俄罗斯开发的可湿性粉剂Alifine-B,主要防治做种作物真菌病害。

迄今为止美国己有4株枯草芽抱杆菌（B1subtilis）生防菌株（QST713、MB1600、GB03和FZB24）得到了美国环保署（EPA）商品化或有限商品化生产应用许可。

QST713为美国AgraQuest公司开发出来的活菌制剂,商品名Serenade,不仅通过美国环保局（EPA）的登记而且还得到食用作物病害应用的审批和认可,通过叶面施用能防治蔬菜、樱桃、葡萄、葫芦和胡桃多种作物的白粉病、烂根病、霜霉病、疫病、灰霉病等细菌和真菌引起的病害[9]。

下表2详细列出了近年来世界各国研发的主要枯草芽孢杆菌制剂。

表2美国已注册的防治植物病害的枯草芽孢杆菌生物制剂

Table2SelectedB.subtilis-basedplantdiseasebio-controlproductsinAmerican[10]

Productname

Company

Bacilluscomponent

Formulationtype

Primarytarget

Serenade

AgraQuest.Davis.CA

B.subtilisQST713

WP.aqueoussuspension

Fungi.bacteriaonmultiplevegetable,fruits

EcoGuard

Novozmew.Salem.VA

B.lichoniformisSB3086

Howable

Sclerotiniahomoeocarpaonturf

Kodiak

Gustafson.Plano.TX

B.subtilisGB03

WP（Conc.）floeable

Fungi.oncotton.large-seededlegumes.soybeans

Yieldshield

Gustafson

B.pumillusGB34

WP（Conc.）

Fungiinsoybeans

BioYield

Gustafson

B.amyloliquefaciensGB99+B.subtilisGB122

Dryflake

Fungionbeddingplantsinpottingmixes

Subtilex

MicrobioLtd

B.subtilisMBI600

WP（Conc.）

Fungioncotton,large-seededlegumes,soybeans

HiStickL+Subtilex

BekerUnderwood

B.subtilisBI600+rhizobium

Flowable

Fungionsoybeans,peanuts

枯草芽孢杆菌的研发存在的问题

尽管在枯草芽孢杆菌生物菌剂研究中已经取得了相当瞩目的成就，但仍然存在着一些迫于解决的问题。

枯草芽孢杆菌作为一种生防微生物，在对农作物施用过程中易受到土壤PH、温度、土壤微环境及作物生长状况等因素的影响，从而使得生物防治效果不稳定，还不能够适用于大范围的作物施用。

大多数的枯草芽孢杆菌制剂还处于实验室研究阶段，没有进入实际应用。

1.5.1产品标准化

在衡量农药产品的标准中，只把侧重点放在药效上而忽略了有害杂质的含量，没有明确要求对对有害杂质进行限量导致一些农药产品产生副作用。

2004年国家工商总局组织辽宁地区市场抽查，共抽查了38个经销单位的60个产点，杀菌剂的合格率仅为%[11]。

现在国内没有严格的标准来衡量枯草芽孢杆菌的有效成分，有些以有效杀菌成分为标准，有些以活芽孢数位标准，而且国家统一的标准来进行有效杀菌成分的检测。

1.5.2生产成本高

在枯草芽孢杆菌发酵过程中分泌的有效杀菌物质较低，而且在生产发酵过程中容易感染杂菌，种种因素使得发酵操作要求的成本过高，研究开发一种新产品所花费的时间较长，应用于农作物后效果不明显，防治对象单一等等问题都提高了生产成本。

1.5.3实际应用中存在问题

枯草芽孢杆菌菌剂从实验室研发到走向田间是一个复杂的过程，主要问题是菌剂的货架储存期短。

另外，关于枯草芽孢杆菌的基础理论研究不够多，在实际应用过程中，往往要考虑多方面的因素，而不单单是菌剂的作用机理，例如，土壤的温度、湿度、pH等都可能对枯草芽孢杆菌的活性造成影响，从而使枯草芽孢杆菌活性降低或者使其产生的有效杀菌物质降解，因此防治效果不理想。

另外，由于菌剂的价格问题，使得许多农业生产者不会选择这类制剂。

立题依据

玉米小斑病是由Bipolarismaydis所引起的一种真菌病害，是甜玉米生育期的常发性病害。

病菌以菌丝和分生孢子在病株残体上越冬，第二年产生分生孢子，成为初次侵染源。

分生孢子靠风力和雨水的飞溅传播，在田间形成再次侵染。

其发病轻重，和品种、气候、菌源量、栽培条件等密切相关。

一般，抗病力弱的品种，生长期中露日多、露期长、露温高、田间闷热潮湿以及地势低洼、施肥不足等情况下，发病较重。

近年来随着种植面积的逐年扩大和感病品种的扩种，发病有加重趋势，已成为甜玉米的严重病害之一。

目前生产上用于防治玉米小斑病的化学试剂主要是常用的杀菌剂，玉米小斑病主要用40%克瘟散，50%多菌灵，75%代森锰锌等药剂500-800倍进行页面喷雾防治[12]。

但效果不是很理想，由于枯草芽孢杆菌对玉米小斑病菌的生长具有抑制作用，因此探讨玉米小斑病的生物防治具有重要意义。

2.材料与方法

实验材料与器材

2.1.1实验材料

蔗糖，马铃薯，麦芽糖，酵母膏，琼脂，燕麦片，胰蛋白胨，牛肉膏，硫酸铵，K2HPO4,5%孔雀绿溶液，%碱性复红溶液，香柏油，擦镜液，无菌水

2.1.2实验菌种

枯草芽孢杆菌A16（BacillussubtilisA16）玉米小斑病菌（Bipolarismaydis）

2.1.3实验仪器

显微镜，酒精灯，载玻片，盖玻片，吸水纸，胶头滴管，试管，试管夹，培养皿，三角瓶，烧杯，控温摇床，移液枪，高压蒸汽灭菌锅，电子天平，PH测试仪，接种环，直尺，无菌操作台

实验方法

2.2.1发酵种子培养

2.2.1.1配制LB培养基

①用烧杯称取32g马铃薯，32gNaCl,16g酵母膏放至锅中，烧杯用水冲洗，加入部分水，使药品溶解

②用30%NaOH调pH,至7，补齐3200ml水

③分装至6个三角瓶中，每个500ml

④121℃灭菌23min。

得6×500mlLB培养基,待用

（以下实验部分需用不同容量及数量的LB培养基，按照比例重新配置即可）

2.2.1.2活化菌种

①将装有BacillussubtilisA16的种子瓶拿入无菌操作室，同时将200ml的LB培养基拿进超净工作台，紫外灭菌20min.

②按1:

1000比例，每瓶培养基中加入200μl种子

③将接种完的LB培养基放入摇床内36℃,200r/min培养过夜

④将种子瓶放回冰箱4℃保存

2.2.1.3菌种扩大培养

①将上步得到的200ml接种枯草芽孢杆菌的LB培养基，18×500mlLB培养基拿入无菌操作台，开紫外灯对超净工作台灭菌20min左右

②把上步试验中接种到200ml培养瓶中的菌种按照3%的接种量接种到500ml的LB培养基中，共有9L×18个大瓶

③36℃,200r/min摇床培养，预得上罐前种子

2.2.2发酵生产监测（对0004,0005,0006罐进行实验室发酵罐模拟实验）

2.2.2.1取样

从0004,0005,0006三罐中分别取样

2.2.2.2压片复染

①制作菌种常规涂片：

取洁净载玻片，滴一滴取样液于玻片中央，室温自然干燥，涂面朝上，通过火焰2-3次进行热固定

②于图片上滴3-5滴孔雀绿溶液；用试管夹夹住载玻片在火焰上用微火加热，自载玻片上出现蒸汽时开始计时约4-5min；倾去染液，待玻片冷却后，用自来水冲洗至孔雀绿不再褪色为止；用%的碱性复红溶液进行复染1min，水洗；

2.2.2.3观察结果

将制作好的压片置片干燥后用油镜观察

2.2.3BacillussubtilisA16与Bipolarismaydis的拮抗实验

2.2.3.1各种培养基的配制

①酵母浸膏培养液：

蔗糖`，酵母浸膏12g，K2HPO44g,无菌水1000ml

②酵母浸膏培养基：

酵母浸膏培养液+琼脂20g

③燕麦培养基：

燕麦片30g，琼脂18g，无菌水1000ml

2.2.3.2玉米小斑病菌（Bipolarismaydis）的培养

将玉米叶表面分离的玉米小斑病菌移植于燕麦片培养基上，25-30℃培养7d左右，待菌落表面达培养皿面积2/3时，22℃光照培养3d

2.2.3.3拮抗细菌（BacillussubtilisA16）的培养

将A,B,C三罐的枯草芽孢杆菌分别接种于盛有150ml酵母浸膏培养液的三角瓶中，30℃，240r/min震荡培养48h

2.2.3.4拮抗实验

以玉米小斑病菌为靶标菌，采用平板对峙法测定枯草芽孢杆菌对玉米小斑病菌的拮抗作用。

将2mm×2mm大小的玉米小斑病菌菌丝块接在燕麦培养基中央，25℃培养3d，在离接种处25mm处的左右两边等距划线接种枯草芽孢杆菌，对照组只接种病原菌玉米小斑病菌，25℃培养5d，每组处理3次重复

3实验结果

发酵生产监测（0004,0005,0006实验室种子罐）

0004罐发酵试验进行得比0005,0006罐相对早一些，比0005和0006提前进入发酵阶段，0005和0006罐进行同步发酵试验，以下表格记录三天内三个罐的发酵情况

表30004，0005,0006罐的发酵情况记录

Table3Fermentationconditionsrecordoffermentor0004,0005,0006

发酵罐编号

发酵情况记录

第一天上午

0004

视野内大量菌体，少量芽孢，应处于对数生长期末期

0005

视野内菌体量多，无污染，正处于对数生长期

0006

视野内菌体量多，无污染，正处于对数生长期

第一天下午

0004

视野内芽孢占大概65%，处于发酵生产末期

0005

视野内大量菌体，少量芽孢，处于对数生长期末期

0006

视野内大量菌体，少量芽孢，处于对数生长期末期

第二天上午

0004

视野内大量芽孢，几乎发酵结束

0005

视野内大量杆菌，发酵正常，与正常发酵周期相符

0006

视野内大量杆菌，发酵正常

第二天下午

0005

视野内大量杆菌，少量芽孢，发酵正常

0006

视野内大量杆菌，发酵正常

第三天上午

0005

视野内大量菌