小麦纹枯病菌拮抗菌株X23的鉴定及其抗菌特性分析.docx

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小麦纹枯病菌拮抗菌株X23的鉴定及其抗菌特性分析

小麦纹枯病菌拮抗菌株X2―3的鉴定及其抗菌特性分析

　　摘要：

从小麦根际土中分离到一株对小麦纹枯病菌拮抗活性较高的菌株X2-3，为进一步利用该菌株，对其进行了鉴定，并对其抗菌特性进行了分析。

根据菌落形态和产酶特征及16SrDNA分析，将菌株X2-3鉴定为辣椒溶杆菌（Lysobactercapsici）。

平板对峙法测定其抑菌谱发现，X2-3对Rhizoctoniacerealis、Thielaviopsisbasicola等多种植物病原真菌和Phytophthoraparasitica等卵菌表现明显的抑菌活性，但对Xanthomonasoryzaepv.oryzae和Ralstoniasolanacearum等革兰氏阴性细菌没有拮抗活性。

抗菌物质稳定性分析结果发现，粗提纯的抗菌物对蛋白酶K和温度不敏感，表明该物质可能属于非线性蛋白，且具有一定的耐热性。

　　关键词：

辣椒溶杆菌；鉴定；抗菌物质；拮抗活性

　　中图分类号：

S482.2+92文献标识号：

A文章编号：

1001-4942（2016）05-0093-05

　　AbstractAstrainX2-3thatshowedhigherantifungalactivitytoRhizoctoniacerealiswasisolatedfromwheatrhizospheresoil.Thenitwasidentifiedanditsantifungalcharacteristicswereanalyzedforfurtherutilization.ThestrainX2-3wasidentifiedasLysobactercapsicibasedontheculturalpropertiesand16SrDNAsequence.AntimicrobialspectrumanalysisindicatedthatX2-3showedobviousantimicrobialactivitiestoplantpathogenicfungiRhizoctoniacerealis，ThielaviopsisbasicolaandoomycetesPhytophthoraparasitica，butnottogram-negativebacteriasuchasXanthomonasoryzaepv.oryzaeandRalstoniasolanacearum.ThestabilityanalysisresultsshowedthattheantimicrobialsubstancecrudelypurifiedfromstrainX2-3werenotsensitivetoproteaseKandhightemperature，whichindicatedthatitmightbenonlinearproteinandhadcertainheatresistance.

　　KeywordsLysobactercapsici；Identification；Antifungalsubstance；Antimicrobialactivity

　　溶杆菌属（Lysobacter）在自然环境中多见于土壤和水体等，由于该类细菌生长较慢，与芽孢杆菌、假单孢杆菌等细菌相比，其分离纯化较为困难，分离出现的比例相对较低[1]。

溶杆菌为革兰氏阴性菌，菌体杆状，无鞭毛，可滑行，基因组G+C含量较高，在NA培养基菌落乳白色或淡黄色，圆形，表面光滑。

目前已知的溶杆菌有20个种，包括产酶溶杆菌（Lysobacterenzymogenes）、抗生素溶杆菌（L.antibioticus）和胶状溶杆菌（L.gummosus）等[2]。

溶杆菌属因具有如下特性而备受关注：

（1）溶杆菌可产生蛋白酶、几丁质酶和纤维素酶等多种胞外酶，这些酶类对多种病原真菌、细菌和线虫具有溶菌活性；

（2）可产生β-内酰胺类、大环肽类和缩肽类等多种抗生素，在抗生素的研制和开发中有重要价值[3]。

溶杆菌在植物病害防治中已有一些研究和报道，其中研究较多的为L.enzymogenes，研究发现，L.enzymogenes菌株C3对小麦赤霉病、高羊茅叶斑病和菜豆锈病等都有较好的防治效果[4，5]。

　　纹枯病是小麦的重要病害之一，由于该病的病原菌主要存在于病田土壤，药剂防治较为困难，利用土壤有益微生物防治该类病害是有效的措施之一。

本研究从小麦根际土壤中分离到一株对纹枯病菌表现较强抑菌活性的菌株，经16SrDNA序列比对，结合培养特征等，对菌株X2-3进行了鉴定，并对其产生的抗菌物质的稳定性进行了分析，为进一步利用该菌株提供依据。

　　1材料与方法

　　1.1供试材料

　　菌株材料：

菌株X2-3参照韩超等[6]的方法从小麦根际土壤中筛选获得。

用于抗菌作用测定的病原菌包括小麦根腐病菌（Bipolarissorokiniana）、小麦纹枯病菌（Rhizoctoniacerealis）、烟草黑胫病菌（Phytophthoraparasitica）和群结腐霉（Pythiummyriotylum）等，所用菌株详细见表1。

所用供试病原菌均由山东农业大学分子植物病理学实验室提供。

　　培养基：

细菌筛选、培养用NA培养基；细菌抗菌物质产生及分析用LB培养基；真菌培养及抗菌作用分析用PDA培养基。

　　1.2方法

　　1.2.1菌株鉴定菌落形态观察：

将筛选出的菌株X2-3划线于NA培养基，28℃培养48h，观察菌落特征，包括菌落形态、大小、颜色等。

　　产酶特性分析：

以NA为基础培养基，以0.1%（W/V）昆布多糖替代葡萄糖为唯一碳源，分析该菌株是否具有产葡聚糖酶的能力；蛋白酶分析以终浓度为1%（W/V）的脱脂奶粉代替蛋白胨，分析该菌株是否具有产蛋白酶的能力。

将在NA培养基上培养好的X2-3菌体稀释至OD600为0.5，取10μL滴于测试用培养基平板，28℃培养3d，观察透明圈有无及大小，分析是否具有产酶能力。

　　分子鉴定：

菌株X2-3在LB培养基28℃下振荡培养至对数生长期，8000r/min离心收集菌体。

参照Rainey等（1996）[7]的方法提取基因组DNA。

用16SrDNA通用引物（27F：

AGAGTTTGATCCTGGCTCAG；1492R：

GGTTACCTTGTTACGACTT）进行PCR扩增[8]。

PCR反应体系（25μL）：

Taq酶（5U/μL）0.5μL，dNTPs（2.5mmol/L）2.0μL，10×Buffer（Mg2+）2.5μL，上下游引物各1.0μL，模板DNA1.0μL，最后补足17.0μL双蒸水。

PCR反应条件参照韩超等[6]的方法。

PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测后，用胶回收试剂盒回收目的片段，送上海生工测序。

将所测16SrDNA序列用BLAST软件与GenBank数据库进行相似性比对，用分析软件DNAMANv5.2.2进行序列同源性分析。

　　1.2.2X2-3的抑菌活性测定以表1病原菌作为供试菌进行抑菌活性测定。

菌株X2-3在NA培养基培养2d，用无菌水稀释至OD600为0.5，取15μL菌液滴于PDA或NA平板的中心位置（抗真菌或卵菌分析用PDA培养基，抗细菌分析用NA培养基），于28℃培养2d，备用。

　　用直径5mm打孔器从培养的真菌和卵菌的菌落边缘打取菌落圆片，移至PDA培养基，距X2-3菌落约3cm。

28℃继续培养2～5d，观察记录抑菌圈大小，根据抑菌圈大小判断该菌株的拮抗效果。

　　对细菌的抑菌能力采用平板喷雾法测定，把培养好的Xanthomonasoryzaepv.oryzae和Ralstoniasolanacearum分别制成1×108cfu/g左右的孢子悬浮液，用无菌微量喷雾器均匀喷在X2-3菌落周围，28℃继续培养2d，观察记录抑菌圈有无及大小。

　　1.2.3抗菌物质稳定性测定菌株X2-3在LB培养液经28℃、180r/min培养72h，于10000r/min、4℃离心20min，重复2次，得到无菌滤液。

参照任嘉红等[9]的方法，将1L无菌滤液经硫酸铵沉淀、甲醇萃取、旋转蒸发等处理后，共得到0.3g粗提物，用无菌水将粗提物配置成浓度约250mg/mL，备用。

　　以立枯丝核菌为指示菌，采用琼脂孔扩散对峙法，测定X2-3粗提物对温度和蛋白酶K的稳定性。

　　热稳定性测定：

将粗提液用1.5mL离心管分装，分别在40、50、60、70、80、90℃和100℃等温度下处理30min，备用。

将直径5mm的立枯丝核菌菌丝块移至PDA平板中央，并在距菌丝块约2cm处分别打孔，每孔加入30μL上述粗提液，以室温（25℃）保存的未经加热处理的粗提液为对照，每处理重复3次。

28℃培养2d，测量记录抑菌圈大小，分析抑菌效果。

　　蛋白酶K稳定性测定：

取0.5mL粗提液，加入蛋白酶K溶液使其终浓度为0.1mg/mL，充分混匀后，置37℃水浴锅中温育2h使其充分反应，以未加蛋白酶K处理为对照。

参照上述方法测定抑菌活性，每处理重复3次。

　　2结果与分析

　　2.1菌株X2-3的培养特征

　　菌落形态特征：

菌株X2-3在NA培养基培养48h形成圆形菌落，乳白色至淡黄色、不透明、有光泽、不产生荧光，表面光滑、无褶皱、边缘整齐，菌落粘稠，流动性强（图1a）。

　　产酶特性：

图1b和1c分别是X2-3在以昆布多糖为唯一碳源和脱脂奶粉为氮源的培养基上的培养特征。

可见，X2-3在昆布多糖和脱脂奶粉培养基上28℃培养3d，在菌落周围都可产生明显的透明圈，表明该菌株具有β-1，3-葡聚糖酶和蛋白酶产生能力，显示菌株X2-3具有溶杆菌的培养特征。

　　2.2菌株X2-3的分子鉴定

　　对菌株X2-3的DNA进一步用细菌16SrDNA进行PCR扩增，在1400bp左右扩增出一条单一条带。

对扩增片段进行了序列测定，对所测序列在NCBI数据库中与已报道的细菌16SrDNA进行BLAST比较，并用MEGA5.0软件分析系统进化关系（图2）。

结果显示，菌株X2-3与已报道的辣椒溶杆菌（Lysobactercapsici）菌株AZ78（基因登录号KF196834）和YC5194（基因登录号NR044250）亲缘关系最近，相似性在99.8%，分在同一分支，进一步确定该菌株为Lysobactercapsici（X2-3基因登录号为KP978015）。

　　2.3菌株X2-3抗菌活性分析

　　利用平板对峙法，分析了菌株X2-3对10种病原菌的抑制作用，结果见表1。

从表1可见，X2-3对R.cerealis、Thielaviopsisbasicola、B.sorokiniana等植物病原真菌和P.parasitica、P.myriotylum等植物病原卵菌均表现较强的抑菌效果，其中，以对R.cerealis、T.basicola和B.sorokiniana抑菌效果最好，抑菌圈半径均在10mm以上，对R.solani和P.myriotylum效果较差，抑菌圈直径大约在7～8mm之间；对X.oryzaepv.oryzae和R.solanacearum等革兰氏阴性细菌没有抑菌作用。

部分抑菌效果见图3。

　　2.4菌株X2-3抗菌物质稳定性分析

　　以立枯丝核菌为指示菌，分析了X2-3粗提物对蛋白酶K和温度的敏感性。

图4A是不同温度处理后粗提物的抗菌活性，可见，粗提物在不同温度下处理30min，其抗菌活性差异明显。

随处理温度的升高，抑菌圈直径越来越小，即抗菌活性越来越小，其中40℃处理后其抗菌活性与对照几乎没有差异，50～80℃处理，粗提物仍有较好的抑菌作用，相互间差异不显著，90～100℃时活性虽显著降低，但仍有部分抑菌活性，表明该物质对温度有一定忍耐力。

　　蛋白酶K是一种作用广谱的蛋白酶，能够以线性蛋白为底物降解多种蛋白质。

X2-3粗提物经蛋白酶K处理2h，其抗菌活性与对照几乎没有差异（图4B），说明该物质对蛋白酶K不敏感，可能不属于线性蛋白。

　　3结论与讨论

　　植物根际微生物群体存在多样性，它们在植物病害防治、促进植物生长等方面发挥了重要作用。

溶杆菌作为其中的重要类群之一，也显示多种生物功能。

据Christensen和Cook报道，溶杆菌对真菌、革兰氏阴性和阳性细菌及病原线虫都有一定的拮抗作用[10]。

目前关于溶杆菌的研究多集中于产酶溶杆菌[3，11]，对其它种类溶杆菌的研究相对较少。

本研究通过培养特征及分子生物学分析，将分离自小麦根际土的菌株X2-3鉴定为辣椒溶杆菌（Lysobactercapsici）。

通过抗菌作用分析，发现该菌株对多种真菌、卵菌有较强的抑菌活性，但对革兰氏阴性植物病原细菌没有拮抗活性。

　　许多研究表明，溶杆菌可通过分泌胞外酶、产生表面活性物质和抗生素等多种机制，破坏病原物的细胞结构或抑制病原物生长[2]。

研究发现，L.enzymogenes可产生不止一种抗菌物质，据Lou等报道，L.enzymogenes菌株OH11和C3都可产生大环内酰胺类抗真菌成分，该成分具有抗菌谱广和热稳定等特征[12]。

本研究初步分析发现，辣椒溶杆菌X2-3产生的抗真菌物质也具有耐热性，并且对蛋白酶K不敏感，表明该抗菌物质可能是一种环形肽，但与L.enzymogenes产生的抗菌物质在结构上是否有相同之处，有待进一步研究。

　　参考文献：

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