人乳头瘤病毒假病毒制备方法的优化以及高通量中和实验检测系统的汇总.docx
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人乳头瘤病毒假病毒制备方法的优化以及高通量中和实验检测系统的汇总
厦门大学
硕士学位论文
人乳头瘤病毒假病毒制备方法的优化以及高通量中和实验检测
系统的建立
姓名：
郑舟
申请学位级别：
硕士
专业：
细胞生物学
指导教师：
张军
20080701
摘要
摘要
人乳头瘤病毒（ＨＰＶ）能够引起包括宫颈癌在内的多种生殖道疾病，严重危害人类健康。
ＨＰＶ具有严格的宿主特异性和组织分化依赖性，难以通过常规组织培养方法扩增，也难以从病变组织中分离获得足够的病毒。
因此建立简便、高效的ＨＰＶ体外感染模型是发展ＨＰＶ预防疫苗与治疗药物的迫切需要。
近来研究发现ＨＰＶ假病毒可用于在体外有效模拟ＨＰＶ的感染，以此基础建立的中和实验方法具有较突出准确、便捷的优点，在ＨＰＶ预防疫苗、中和抗体研究中显示出巨大的应用潜力。
ＨＰＶ假病毒中和实验方法的广泛使用需要进一步提高假病毒构建效率，同时能够满足高通量检测的需要。
本实验室已应用磷酸钙多质粒共转染方法在２９３ＦＴ细胞中建立了构建ＨＰＶ假病毒的方法，本研究以此为基础，进一步对ＨＰＶ假病毒构建体系进行系统改进和优化，建立了更为高效且适合高通量检测的ＨＰＶ中和实验方法。
建立简便高效、高通量的假病毒中和实验检测方法对提高实验效率，满足大规模抗体检测的需要具有十分重要的意义。
同时，建立多个型别的ＨＰＶ假病毒中和实验模型为具有高保护力的多价疫苗的开发提供了全面的中和抗体评价体系。
本研究首先探讨了在ＨＰＶ假病毒构建体系中优化质粒转染比例以及磷酸钙转染条件对假病毒构建效率的影响。
结果显示，在该体系中不同的ＨＰＶ结构蛋白表达质粒转染比例对于假病毒构建效率有显著影响，ＨＰＶ主要结构蛋白Ｌｌ的表达水平是影响构建效率的主要因素，Ｌ２表达质粒的用量过高或过低均不利于假病毒的构建。
报告质粒的用量对假病毒构建效率的影响相对较小。
综合比较显示，在该体系中Ｌｌ和Ｌ２表达质粒和报告质粒以合适比例（１：
１／１０：
１／２）进行共转染可获得较理想的构建效率。
同时通过优化磷酸钙转染试剂的用量和ＤＮＡ在磷酸钙溶液中浓度获得了较优的转染条件。
通过优化改进，本研究建立了更为高效的ＲＰＶ假病毒大量制备方法，在ＨＰＶｌ６、ＢＰＶｌ８、ＨＰＶ６、ＨＰＶｌｌ假病毒构建中的应用结果显示相比原方法可显著提高构建效率１０～２０倍。
为ＨＰＶ假病毒中和实验的规模化应用提供了有利条件。
为适应高通量检测的需要，本研究通过改进报告基因及检测方法建立了新型的ＨＰＶ假病毒中和实验体系。
本研究选择半乳糖苷酶作为报告基因，构建了携带
摘要
优化后的半乳糖苷酶表达元件的ＨＰＶ假病毒，研究结果显示，假病毒感染后的细胞加入显色底物后可呈现显著的蓝色，并且该标记可为酶联免疫图像分析系统（Ｅ１ｉｓｐｏｔ）所检测。
酶联免疫图像分析系统可对显色后的９６孔细胞培养板进行连续快速的自动扫描并计数，满足了高通量检测的需要。
本研究进一步对显色方法进行优化，提高了检测效率。
通过综合应用优化的半乳糖苷酶报告基因表达元件与酶联免疫图像分析系统，本研究建立新型的可满足高通量检测要求的ＨＰＶ假病毒中和实验方法。
本研究应用该方法对四型ＨＰＶ中和单抗的鉴定结果表明，半乳糖苷酶假病毒中和实验方法与目前应用的ＥＧＦＰ假病毒中和实验方法的检测灵敏度相当，同时新方法还具有可自动连续检测、操作简便、结果显示直观的优点，可更好地满足大规模中和抗体检测实验的需要。
本研究应用该方法鉴定获得了２株ＨＰＶｌ６中和单抗，３株ＨＰＶｌ８中和单抗，以及ＨＰＶ６和ＨＰＶＩｌ中和单抗各５株；同时对本中心生产的ＨＰＶｌ６、ＨＰＶｌ８、ＨＰＶ６和ＨＰＶｌｌ四价ＶＬＰ疫苗的抗体保护性进行了评价，为临床实验阶段所需疫苗的合适剂量提供了参考。
ＨＰＶ５８和ＨＰＶ５２是中国较为流行的高危ＨＰＶ型别，但一直以来研究较少。
建立ＨＰＶ５８和ＨＰＶ５２假病毒中和实验模型对于研究ＨＰＶ５８和ＨＰＶ５２以及预防疫苗的开发具有重要意义。
我们将ＨＰＶ５８和ＨＰＶ５２的衣壳蛋白表达序列进行密码子人源化优化后，克隆到表达载体上，与报告质粒分别共转染２９３ＦＴ获得了感染性的ＨＰＶ５８和ＨＰＶ５２假病毒。
将质粒通过尾静脉高压注射方式免疫小鼠，成功在小鼠体内诱导了高滴度的ＨＰＶ５８和ＨＰＶ５２的中和性抗体。
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｔｉｎｇ结果显示这两型假病毒在约５５ＫＤ处均具有Ｌ１蛋白活性。
多抗血清交叉中和实验表明ＨＰＶ５８和ＨＰＶ５２、ＨＰＶｌ６和ＨＰＶ５８之间存在一定水平的抗体交叉保护，而ＨＰＶｌ６和ＨＰＶ５２之间没有可检测的抗体交叉保护性。
关键词：
人乳头瘤病毒；假病毒；中和实验
ＡＢＳＴＲＡＣＴ
ＩｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆＨｕｍａｎ
ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ（ＨＰＶ）ｉｓ
ｃａｎｃｅｒ，ｗｈｉｃｈ
ｔｈｅｃａｕｓｅｏｆｖａｒｉｏｕｓｄｉｓｅａｓｅｓｏｆ
ｃａｎｃｅｒ
ｇｅｎｉｔａｌｔｒａｃｔ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｃｅｒｖｉｘ
ｉｓｔｈｅｓｅｃｏｎｄｍｏｓｔｃｏｍｍｏｎ
ｌｅａｄｉｎｇｔｏｄｅａｔｈｉｎｗｏｍｅｎ．ＨＰＶ’Ｓｉｎｆｅｃｔｉｏｎｈａｓｈｏｓｔｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｃｏｍｐｌｅｔｅｄｌｉｆｅｃｙｃｌｅｏｆＨＰＶｒｅｌａｙｓ
ｏｎ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｏｆｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｓ．Ａｂｓｅｎｃｅｏｆａｐｐｌｉｃａｂｌｅ
ｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｓｙｓｔｅｍｓｆｏｒｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｖｉｒｕｓａｎｄｌｉｍｉｔｅｄｖｉｒｕｓｐａｒｔｉｃｌｅｓｏｂｔａｉｎｅｄｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓ’ｔｉｓｓｕｅｓＣｏｎｖｅｎｉｅｎｔ
ｒｅｓｔｒｉｃｔ
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ｉｎ
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ｉｎｆｅｃｔｉｏｎｍｏｄｅｌｓｏｆＨＰＶ
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ＨＰＶ
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ｃｏｎｓｔｒｕｃｔ
ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ
ｔｏ
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ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎ
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ｅｎｏｒｍｏｕｓ
ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｙｓ
Ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔｈａｓ
ａｎｄ
ｗｉｔｈ
ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃｖａｃｃｉｎｅ．ｃｏｎｄｏｎ－ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ
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ｉｓ
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ｈｉｇｈｅｒ－ｙｉｅｌｄｉｎｐｒｏｄｕｃｉｎｇｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎ
ｏｕｒ
ｔｈａｎｏｔｈｅｒｓｙｓｔｅｍｓ，ｗｈｉｃｈ
ｂｅｅｎｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｉｎ
ｌａｂ．Ｔｏｅｖａｌｕａｔｅ
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ｔｈｅｐｒｏｔｅｃｔｉｏｎｐｒｏｖｉｄｉｎｇｂｙＨＰＶ
ｐｒｏｐｈｙｌａｃｔｉｃｖａｃｃｉｎｅｔｏａｎｉｍａｌｓｈｕｍａｎ，ａｇｒｅａｔｄｅａｌｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎ
ａｎｄ
ａ
ｒａｐｉｄ，
ｓｉｍｐｌｅａｎｄｃｏｎｖｅｎｉｅｎｔ，ｈｉｇｈ－ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｓｓａｙｉｓｒｅｑｕｉｒｅｄ．ＴｏｓａｔｉｓｆｙｎｅｅｄｏｆｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｍｕｌｔｉｖａｌｅｎｔＨＰＶｖａｃｃｉｎｅ，ｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒｏｔｈｅｒＨＰＶｔｙｐｅｓｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙ．
Ｉｎｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓｂｙｌｏｗｅｒｉｎｇ
ｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｉｏｎｏｆｐｌａｓｍｉｄｓ，ａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｌｙ
ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ
ｍｏｌｅｒａｔｉｏｏｆＬ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐｌａｓｍｉｄａｎｄｒｅｐｏｒｔｅｒｐｌａｓｍｉｄ
ｅｎｈａｎｃｅｓｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＬ１，ｗｈｉｃｈｉｓｐｏｓｉｔｉｖｅｃｏｒｒｅｌａｔｉｖｅｔｏｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓｕｎｄｅｒｃｅｒｔａｉｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ．Ｔｈｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄ１：
１／１０：
１／２ｏｆＬｌ、Ｌ２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｓ
ｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｒａｔｉｏｍａｙ
ｂｃ
ａｎｄ
ｒｅｐｏｒｔｅｒｐｌａｓｍｉｄ．Ｍｏｄｉｆｉｅｄｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄ
ｍｏｌｅｒａｔｉｏｓｏｆｐｌａｓｍｉｄｓ、ｏｐｔｉｍａｌＤＮＡｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｉｎｃａｌｃｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｔｉｏｎ
ａｎｄａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｈｉｇｈｅｒ
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ｏｆｃａｌｃｉｕｍｐｈｏｓｐｈａｔｅｓｏｌｕｔｉｏｎｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｔｏ
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１０－２０ｔｉｍｅｓａｎｄ
ＨＰＶ１１
ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ
ｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎＨＰＶ１６、ＨＰＶ１８、ＨＰＶ６
ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎ．
Ｔｏ
ｓａｔｉｓｆｙ
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ｈｉｇｈ—ｔｈｒｏｕｇｈｐｕｔ
ｏｕｒ
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ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ，
ｃｏｎｓｉｄｅｒｒｉｎｇｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓｉｎｂａｓｅｄ
ｏｎ
ｌａｂ，ｗｅｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄ
ｎｅｗｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｓｓａｙ
ｐｓｅｕｄｏｖｉｄｏｎｅｎｃａｐｓｉｄａｔｉｎｇ
Ｂ・ｇａｌｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄ．ＷｅｕｔｉｌｉｚｅｄＥｌｉｓｐｏｔ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
ｒｅａｄｅｒｔｏｓｃａｎ９６ｗｅｌｌｓｃｅｌｌｃｕｌｔｕｒｅｐｌａｔｅｓａｎｄｄｉｓｐｌａｙａｕｔｏｍａｔｉｃｃｏｕｎｔｉｎｇｒｅｓｕｌｔｏｆｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｄｕｃｔｅｄｂｙｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎｅｖｅｒｙｗｅｌｌ，ｗｈａｔｒｅｍａｒｋａｂｌｙｅｎｈａｎｃｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒＨＰＶ．Ｔｈｅｍｅｔｈｏｄｏｆｘ－ｇａｌｓｔａｉｎｎｉｎｇＷａｓｉｍｐｒｏｖｅｄｔｏｆｕｒｔｈｅｒｅｎｈａｎｃｅｔｈｅｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ．ＴｈｅｎｅｗｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｓｓａｙｆｏｒＨＰＶｈａｓｈｉ曲ｓｐｅｃｉｆｉｃｉｔｙ，ａｗｉｄｅｄｅｔｅｃｔｉｏｎｒａｎｇｅａｎｄｓｉｍｉｌａｒｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙｃｏｍｐａｒｉｎｇｔｏｔｈａｔｏｆＥＧＦＰｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ－ｂａｓｅｄｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｓｓａｙ，ｍｏｒｅｏｖｅｒ，ｉｔ’Ｓｌｏｗ—ｃｏｓｔｉｎｒｅａｇｅｎｔｓａｎｄｅａｓｙｔｏｏｐｅｒａｔｅ．
ＴｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙｏｆＨＰＶＩ６，ＨＰＶ１８，ＨＰＶ６
ｏｕｒａｎｄＨＰＶＩＩｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｇｅｎｅｒａｔｅｄｉｎｌａｂｗｅｒｅｔｈｅｎｅｖａｌｕａｔｅｄｂｙｔｈｅｎｅｗｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ—ｂａｓｅ
ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｓｓａｙ．ＡｌｌｔｈｅｓｅｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｍＡｂｓＣａｎｂｅｕｓｅｄｔｏｔｈｏｒｏｕｇｈｌｙｅｌｕｃｉｄａｔｅｔｈｅｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｅｐｔｉｔｏｐｅｓｏｆＨＰＶａｎｄｅｖａｌｕａｔｅｔｈｅ
ｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅａｑｕａｌｉｔｙｏｆＨＰＶｖａｃｃｉｎｅｓ．ＴｏｓｕｉｔａｂｌｅｄｏｓｅｏｆｃａｎｄｉｄａｔｅＶＬＰ—ｍｉｘｅｄｖａｃｃｉｎｅｏｆＨＰＶ１６／１８／６／１１，ｓｉｘｔｙｍｉｃｅｗｅｒｅｖａｃｃｉｎａｔｅｄｗｉｔｈｓｅｒｉａｌｄｉｌｕｔｅｄＨＰＶｌ６／１８／６／ｌｌＶＬＰｍｉｘａｎｄｔｈｅＥＤ５０ＷａｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｄｔｏｂｅＨＰＶｌ６０．０１７１，ｔｇ／ｍＬ、ＨＰＶｌ８Ｏ．０１７１上ｇ／ｍＬ、ＨＰＶ６０．０２５ｌｘｇ／ｍＬ、ＨＰＶｌ１０．０６７ｐ．ｇ／ｍＬ，ｗｈｉｃｈｗｉｌｌｇｕｉｄｅ
ｏｆｍｉｘｖａｃｃｉｎｅｉｎｃｌｉｎｉｃａｌｔｒｉａＩｓｔｕｄｉｅｓ．
ＨＰＶ５８ａｎｄＨＰＶ５２ａｒｅＵＳｉｎｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆａｎａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅｄｏｓｅｐｏｐｕｌａｒｈｉｇｈ—ｒｉｓｋＨＰＶｉｎＣｈｉｎａ，ｐｏｐｕｌａｒｉｔｙｏｆＨＰＶ５８
ｉｓｓｅｃｏｎｄｔｏｔｈａｔｏｆＨＰＶ１８，ｂｕｔｌｉｔｔｌｅｈａｓ
ａｌｗａｙｓ．ＣｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎｏｆＨＰＶ５８
ＨＰＶ５２ｂｅｅｎｓｔｕｄｉｅｄａｂｏｕｔｔｈｅｔｗｏｔｙｐｅｓｓｉｎｃｅｏｎａｎｄＨＰＶ５２ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎｈｅｌｐｔｏｒｅｓｅａｒｃｈＨＰＶ５８、ａｎｄｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇｖａｃｃｉｎｅ．Ｃｏｄｏｎ－ｏｐｔｉｍｉｚｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｓｏｆｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｒｅｐｏｒｔｅｒｐｌａｓｍｉｄａｒｅｃｏｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｔｏ２９３ＦＴｃｅｌｌｓ，ｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｇｅｎｅｒａｔｉｎｇｈｉｇｈｔｉｔｅｒｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓｐｓｅｕｄｏｖｉｒｉｏｎｏｆＨＰＶ５８ａｎｄＨＰＶ５２
ｂｌｏｔｔｉｎｇ．
ｉｎｄｕｃｅｄｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ５８Ｌ１ａｎｄ５２Ｌ１ｉｎｃｅｌｌｓＷａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎＩｍｍｕｎｉｚｉｎｇ
ｎｅｕｔｒａｌｉｚｉｎｇｃｏｄｏｎ・ｏｐｔｉｍｉｚｅｄ５８Ｌ１ａｎｄＣａｎ５２Ｌ１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐｌａｓｍｉｄｓａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｍｉｃｅｗｈｉｃｈｎｅｕｔｒａｌｉｚｅｉｎｆｅｃｔｉｏｎｏｆｐｓｅｕｄｏｖｉｆｉｏｎ
ＨＰＶＩ６ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｗｅｆｏｕｎｄｃｒｏｓｓｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎｐｈｅｎｏｍｅｎａｅｘｉｓｔｓ
ＨＰＶ５２ｂｅｔｗｅｅｎａｎｄＨＰＶ５８，ＨＰＶ５８ａｎｄＨＰＶ５２，ｂｕｔｎｏｔｂｅｔｗｅｅｎａｎｄＨＰＶｌ６．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：
ＨｕｍａｎＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ；Ｐｓｅｕｄｏｖｉｒｕｓ；Ｎｅｕｔｒａｌｉｚａｔｉｏｎａｓｓａｙ４
Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎ（缩略词）
ＡＢＢＲＥＶＩＡＴＩＯＮ（缩略词）
ＰＶ：
Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，乳头瘤病毒ＨＰＶ：
ＨｕｍａｎＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，人乳头瘤病毒
ＲａｂｂｉｔＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，棉尾兔乳头瘤病毒ＣＩ冲Ｖ：
Ｃｏｔｔｏｎｔａｉｌ
ＢＰＶ：
ＢｏｖｉｎｅＰａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，牛乳头瘤病毒
Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，犬口腔乳头瘤病毒Ｒｅｇｉｏｎ，长控制区
Ｆｒａｍｅ。
开放阅读框ＣＯＰＶ：
ＣａｎｉｎｅＯｒａｌＬＣＲ：
ＬｏｎｇＣｏｎｔｒｏｌＯＲＦ：
ＯｐｅｎＲｅａｄｉｎｇ
ＶＬＰ：
ＶｉｒｕｓＬｉｋｅＰａｒｔｉｃｌｅ，类病毒颗粒
Ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ，硫酸乙酰肝素蛋白聚糖Ｓｉｇｎａｌ，核定位信号ＨＳＰＧ－ＨａｐａｒａｎＳｕｌｆａｔｅＮＬＳ．－ＮｕｃｌｅａｒＬｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ
ＰＭＬ－ＰｒｏｍｏｎｏｃｙｔｉｃＬｅｕｋｅｍｉａＰｒｏｔｅｉｎ，急性早幼粒白血病蛋白ＣＩＮ：
ＣｅｒｖｉｃａｌＩｎｔｒａｅｐｉｔｈｅｌｉａｌ
Ｅ６ＡＰ：
Ｅ６ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＮｅｏｐｌａｓｉａ，宫颈上皮内瘤变ｐｒｏｔｅｉｎ，Ｅ６相关蛋白ｐＲｂ－ＲｅｔｉｎｏｂｌａｓｔｏｍａＴｕｍｏｒＳｕｐｐｒｅｓｓｏｒＧｅｎｅ，抗癌抑制因子
Ｋｉｎａｓｅ，细胞周期蛋白激酶ＣＤＫ：
Ｃｙｃｌｉｎ・ｄｅｐｅｎｄｅｎｔ
ＣＡ：
Ｃｏｎｄｙｌｏｍａ
ＤＣ：
ＤｅｎｔｒｉｔｉｃＡｃｕｍｉｎａｔｕｍ，尖锐湿疣Ｃｅｌｌ，树突状细胞ＣＴＬ：
ＣｙｔｏｔｏｘｉｃＴＬｙｍｐｈｏｃｙｔｅ，杀伤性Ｔ淋巴细胞ＩＳＣＡＲ：
ＩｍｍｕｎｏｓｔｉｍｕｌａｔｏｒｙＣａｒｒｉｅｒ，免疫刺激载体ＬＡＭＰ—ｌ：
Ｌｙｓｏｓｏｍａｌ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＭｅｍｂｒａｎｅＰｒｏｔｅｉｎＴｙｐｅｌ，溶酶体相关Ｉ类膜蛋白ＡＡＶ：
Ａｄｅｎｏ．ａｓｓｏｃｉａｔｅｄＶｉｒｕｓ，腺相关病毒ＭＶＡ：
ＭｏｄｉｆｉｅｄＶａｃｃｉｎｉａＶｉｒｕｓＡｎｋａｒａ，改造安卡拉痘苗病毒ＳＣＩＤ：
ＳｅｖｅｒｅＣｏｍｂｉｎｅｄＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＭｉｃｅ，严重联合免疫缺陷小鼠ＳＦＶ－．ＳｅｍｌｉｋｉＦｏｒｅｓｔ
ＥＧＦＰ：
Ｖｉｒｕｓ，塞姆利基森林病毒Ｐｒｏｔｅｉｎ。
增强型绿色荧光蛋白ＥｎｈａｎｃｅｄＧｒｅｅｎＦｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔＳＥＡＰ－ＳｅｃｒｅｔｅｄＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ分泌性碱性磷酸酶ＩＦＮ：
Ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ，干扰素Ｓ
Ａｂｂｒｅｖｉａｔｉｏｎｆ缩略词）
Ｋａｎ：
Ｋａｎａｍｙｃｉｎ，卡那霉素
Ａｍｐ．Ａｒｎｐｉｃｉｌｌｉｎ，氨苄青霉素ｂｐ：
ｂａｓｅｐａｉｒ，碱基对
ｐａｉｒ，千碱基对ｋｂ：
ｋｉｌｏｂａｓｅ
ｋＤ：
ｋｉｌｏＤａｌｔｏｎｓ，千道尔顿
ｍＡｂ－ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙ，单克隆抗体
Ｃｏｍｐｌｅｘ，主要组织相容性复合物ＭＨＣ－Ｍａｊｏｒ
ＭＯｈＨｉｓｔｏｃｏｍｐａｔｉｂｌｅＭｕｌｔｉｐｌｉｃｉｔｙｏｆＩｎｆｅｃｔｉｏｎ，感染复数ＭＷ：
ＭｏｌｅｃｕｌａｒＷｅｉｇｈｔ，分子量Ｏｒｉ：
Ｏｒｉｇｉｎ，复制起始位点
ｖｉｒｕｓ，猿空泡病毒４０ＳＶ４０－Ｓｉｍｉａｎｖａｃｕｏｌａｔｉｎｙ
ＦＢＳ：
ＦｅｔａｌＢｏｖｉｎｅＳｅｒｕｍ，胎牛血清ＦＣＭ：
ＦｌｏｗＣｙｔｏｍｅｔｒｙ，流式细胞仪ＨＲＰ：
Ｈｏｒｓｅｒａｄｉｓｈ
ＲＮＡ：
ＲｉｂｏｎｕｃｌｅｉｃＰｅｒｏｘｉｄａｓｅ，辣根过氧化物酶Ａｃｉｄ，核糖核酸ＨＬＡ．ＨｕｍａｎＬｅｕｃｏｃｙｔｅＡｎｔｉｇｅｎ，人类白细胞抗原ＲＬＵ－Ｒｅｌａｔｉｖｅｌｉｇｈｔｕｎｉｔｓ，相对光单位６
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）课题（组）经费或实验室的的研究成果，获得（聍霹Ｐ
资助，在（复宁四Ｆ）实验室完成。
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）
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襄附加影年７月弓ｆ日
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此声明栏不填写的，默认为公开学位论文，均适用上述授权。
）
声明人（签名）：
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１．ＨＰＶ的生物学
乳头瘤病毒（ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＰＶ）的宿主范围很广，几乎包括所有的哺乳动物和鸟类。
常见的ＰＶ包括人乳头瘤病毒（ｈｕｍａｎｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＨＰＶ）、棉尾兔乳头瘤病毒（ｃｏｔｔｏｎｔａｉｌｒａｂｂｉｔｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＣＲＰＶ）、牛乳头瘤病毒（ｂｏｖｍｅｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｍｓ．ＢＰＶ）、犬口腔乳头瘤病毒（ｃａｎｉｎｅｏｒａｌｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｕｓ，ＣＯＰＶ）等，同属于乳头瘤病毒科（Ｐａｐｉｌｌｏｍａｖｉｒｉｄａｅ）。
人们对于ＨＰＶ与宫颈癌以及湿疣等疾病的相关性认识始于１９世纪７０年代，后来随着分子生物学技术的不断发展，在１９８３和１９８４年成功地从宫颈癌组织中分离出ＨＰＶｌ６［１１和ＨＰＶｌ８【２Ｉ病毒株，之后对ＨＰＶ的研究进入了一个快速发展的时期。
至今，已被分离和鉴定的ＨＰＶ型别有１００多种【３ｌ。
１．１．ＨＰＶ的病毒结构
ＨＰＶ是一种无包膜的，小分子双链环状ＤＮＡ病毒，病毒衣壳由主要衣壳蛋白Ｌｌ和次要衣壳蛋白Ｌ２构成，在电镜下大小５５ｎｍ，呈二十面体结构。
图ｌ：
ＨＰＶｌ６基因组结构图Ⅲ
Ｆｉｇ．１：
ＳｃｈｅｍｅｏｆＨＰＶｌ６ｇｅｎｏｍｉｃｓｔｒｕｃｔｕｒｅ
刖舌
ＨＰＶ的基因组约８Ｋｂ。
其中较典型的ＨＰＶｌ６的基因组结构如图１所示，包括长控制区（１０ｎｇ
放阅读框（ｏｐｅｎｃｏｎｔｒｏｌｒｅａｄｉｎｇｒｅｇｉｏｎ，ＬＣＲ），编码早期非结构蛋白（Ｅｌ，－－Ｅ７）的开ｆｒａｍｅ，ＯＲＦ）和编码晚期结构蛋白（Ｌｌ和Ｌ２）的ＯＲＦ。
ＨＰＶ的早期蛋白负责基因组的复制、转录、翻译，细胞的转化以及病毒颗粒的组装等。
Ｅｌ以六聚体形式存在，是一种ＡＴＰ酶以及解旋酶【引，识别ＨＰＶ复制起始位点，在Ｅ２蛋白辅助下，与ＤＮＡ聚合酶Ｑ亚基结合并起始病毒基因的复制【６，７１。
Ｅ２以二聚体的形式存在，在病毒ＤＮＡ复制和基因转录调节方面发挥重要功能。
当细胞中Ｅ２浓度下降时，Ｅ２激活早期基因的表达；Ｅ２浓度升高时，通过抑制一些转录因子的作用可降低病毒蛋白表达，通过这种机制将细胞中的病毒拷贝控制在一定数量内ｌ引。
Ｅ６和Ｅ７是癌蛋白，分别与细胞内抗癌抑制因子ｐ５３、ｐＲｂ作用，诱导细胞癌变【９】。
Ｅ４、Ｅ５蛋白在病毒增殖期才开始表达，Ｅ５可以与细胞内多种生长因子受体结合，影响细胞信号途径和正常的细胞生活周期，促使细胞增殖，分化延缓【Ｉｏ】，Ｅ４蛋白与细胞周期的调控有关【ＩＩ，１２Ｉ。
Ｅ３的功能目前还不清楚。
ＨＰＶ衣壳是由７２个Ｌｌ蛋白五聚体构成的Ｔ－－７的二十面体结构，一个病毒粒子上含有３６０个Ｌｌ蛋白单体【１３，１４】，Ｌ１蛋白单体和五聚体结构如图２所示。
体外表达的Ｌｌ蛋白可自组装或与Ｌ２蛋白共组装成类病毒颗粒（ｖｉｒｕｓｌｉｋｅｐａｒｔｉｃｌｅ，ＶＬＰ），组装的过程可非特异的包裹小于８Ｋｂ的环状ＤＮＡ。
电镜下ＶＬＰ的大小、形状均与天然病毒颗粒相似【１５，１６１。
在溶液中存在Ｄ１ｖｒ、２一巯基乙醇或者低盐浓度的条件下，ＶＬＰ会重新解聚成五聚体，这说明五聚体组装成ＶＬＰ同时存在离子键和二硫键的作用【ｔ７，ｔｇｌ。
Ｌ２蛋白位于Ｌ１构成的ＶＬＰ上，每个病毒粒子上含有１２个或更多拷贝的Ｌ２蛋白【１９，２０】。
目前已鉴定出Ｌ２蛋白上存在两个与Ｌ１的作用位点，一个位于１２９＂－－２４６号氨基酸之间，另一个位于Ｃ末端，３８４－－－４６０号氨基酸之间，两个位点对于核酸包裹均有显著影响【２¨。
Ｃ末端的结合位点存在疏水作用区，这种强疏水作用使得Ｌｌ蛋白和Ｌ２蛋白结合在一起，若在该区域引入负电荷的氨基酸，则Ｌｌ与Ｌ２的相互作用将被阻蝌２２ｌ。
ｎ言
图２：
ＢＰＶｌ６Ｌ１蛋白单体和五聚体Ｉ。
Ｉ
Ｆｉｇ２：
ＨＰＶｌ６Ｌ１ｍｏｎｏｍｅｒａｎｄｐｅｎｔａｍｅｒ
１．２．ＨＰＶ的分类
历史上，由于缺乏支持ＰＶ复制的细胞培养模型，同时从组织中分离的病毒量很少，影响了Ｐｖ的血清学分型。
Ｐｖ基因组非常保守，由突变或重组造成序列改变非常罕见。
而Ｐｖ基因组中Ｌ１基因最保守，因此可以通过Ｌ１ＤＮＡ序列对叫进行分型。
新分离乳头瘤病毒的Ｌ１基因序列若与己知最接近的Ｌｌ基因序列的差异达到１０％以上，就认为是一个新型别；若差异在２％到１０％之间，则认为是一个新亚型，若差异小于２％，则是参比型别的突变抹口Ｊ。
根据ＨＰＶ基因型的不同，已经被分离和鉴定的ＩｌＰＶ型剐有１００多种，并按照发现顺序进行编号。
根据感染部位的不同，ＨＰＶ可分为肛门生殖器型和皮肤型。
肛门生殖器型的ＨＰＶ根据与宫颈癌的相关性又被划分为高危型和低危型，前者与诱发宫颈癌密切相关．包括ＨＰＶｌ６、１８、３ｌ、３３、３５、３９、４５
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