7O香叶基槲皮素及IGF1RsiRNA对乳腺癌细胞MDAMB231的作用研究临床医学.docx
《7O香叶基槲皮素及IGF1RsiRNA对乳腺癌细胞MDAMB231的作用研究临床医学.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《7O香叶基槲皮素及IGF1RsiRNA对乳腺癌细胞MDAMB231的作用研究临床医学.docx（28页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
7O香叶基槲皮素及IGF1RsiRNA对乳腺癌细胞MDAMB231的作用研究临床医学
阳离子脂质体共载7-O-香叶基槲皮素及IGF-1R-siRNA对乳腺癌细胞MDA-MB-231的作用研究
摘□□要
目的：
以肽头部阳离子脂质体CDO14为载体，构建荷载7-O-香叶基槲皮素（GQ）和IGF-1R-siRNA（siIGF）的纳米共转运系统CDO14/GQ-siIGF，考察其体外抗乳腺癌细胞MDA-MB-231作用。
方法：
（1）用阳离子脂质体CDO14包载GQ构建载药脂质体CDO14/GQ，将脂质体CDO14及CDO14/GQ分别与siIGF复合，构建基因复合物CDO14-siIGF及共转运系统CDO14/GQ-siIGF；采用激光粒度仪检测基因复合物、载药脂质体和共转运系统的粒径及Zeta电位；
（2）采用CCK-8法检测载药脂质体、基因复合物及共转运系统对人乳腺癌细胞MDA-MB-231增殖的影响；采用AO/EB和AV/PI染色法检测载药脂质体、基因复合物及共转运系统对人乳腺癌细胞MDA-MB-231的促凋亡作用；采用Westernblot法考察载药脂质体、基因复合物及共转运系统对人乳腺癌MDA-MB-231细胞中IGF-1R蛋白以及凋亡相关蛋白Bcl-2、Bax、Caspase-3表达的影响。
结果：
（1）所构建的载药脂质体、基因复合物及共转运系统的粒径均在100~200nm之间；空白脂质体及载药脂质体的Zeta电位在40-50mV之间，与siIGF复合后降至30mV左右。
（2）CCK-8法检测表明，siIGF和GQ均能抑制人乳腺癌细胞MDA-MB-231的增殖，二者合用后抑制作用增强；AO/EB和AV/PI染色结果表明，siIGF和GQ均能促进人乳腺癌细胞MDA-MB-231凋亡，二者合用后促凋亡作用增强；Westernblot分析表明，CDO14/GQ-siIGF能下调IGF-1R蛋白表达，上调促凋亡蛋白Bax和Caspase-3的表达，下调抑凋亡蛋白Bcl-2的表达，作用强于单用CDO14/GQ或CDO14-siIGF。
结论：
纳米共转运系统CDO14/GQ-siIGF荷载的GQ与siIGF具有协同抗乳腺癌作用。
关键词：
乳腺癌7-O-香叶基槲皮素siIGF纳米共转运系统脂质体
Effectsof7-O-geranylquercetinandIGF-1R-siRNAcodeliveredbyacationicliposomeonbreastcancercelllineMDA-MB-231
TuYanan
ABSTRACT
Objective:
Toconstructananosystemfortheco-deliveryof7-O-geranylquercetin（GQ）andIGF-1R-siRNAusingthepeptidecationicliposomeCDO14asavectorandinvestigatetheirsynergisticeffectstobreastcancercelllineMDA-MB-231invitro.
Methods:
（1）Drug-carryingliposomeCDO14/GQwasconstructedbyloadingGQwithcationicliposomeCDO14.LiposomesCDO14andCDO14/GQwerecombinedwithsiIGFtoformthecomplexCDO14-siIGFandco-deliverysystemCDO14/GQ-siIGF,respectively.ParticlesizeandZetapotentialofthethecomplex,drug-carryingliposomesandco-deliverysystemwerecharacterizedbylaserparticlesizeanalyzer.
（2）CCK-8assaywereusedtodetecttheeffectofthecomplex,drug-carryingliposomeandco-deliverysystemontheviabilityofMDA-MB-231cells.AO/EBandAV/PIstainingwereusedtodetectthepro-apoptosiseffectofthecomplex,drug-carryingliposomeandco-deliverysystemonMDA-MB-231cells.WesternblotassaywasusedtodetecttheexpressionofIGF-1Rproteinandapoptosis-relatedproteinsBcl-2,BaxandCaspase-3inMDA-MB-231cells.
Results:
（1）TheparticlesizesofliposomeCDO14,complexCDO14-siIGFandco-deliverysystemCDO14/GQ-siIGFwere100~200nm,theZetapotentialofCDO14andCDO14/GQwere40-50mVwhichthendecreasedtoabout30mVaftercombiningwithsiIGF.
（2）CCK-8assayshowedthatbothCDO14-siIGFandCDO14/GQcouldinhibittheproliferationofcells,andtheinhibitoryeffectwasenhancedaftertheircombination.AO/EBandAV/PIstainingsindicatedthatbothCDO14-siIGFandCDO14/GQcouldpromotetheapoptosisofcells,andthepro-apoptosiseffectofCDO14/GQ-siRNAwasmoreremarkablethanthatofCDO14/GQandCDO14-siIGF.WesternblotassaydemonstratedthatCDO14/GQ-siIGFmoresignificantlydown-regulatedtheexpressionofIGF-1RandBcl-2,up-regulatedtheexpressionofBaxandCaspase-3comparedwithCDO14/GQandCDO14-siIGF.
Conclusion:
GQandsiIGFintheco-deliverynanosystemshowedsynergisticeffecttobreastcancercellMDA-MB-231.
Keywords：
7-O-geranylquercetinIGF-1R-siRNAco-deliverynanosystemliposome
前言
近些年来，由于我国工业化程度的不断加深、人口老龄化的日益严重、生活环境愈发恶劣以及不健康的现代生活方式，中国居民患癌率逐年上升。
根据最新的统计数据，癌症已经成为威胁中国居民生命健康的主要疾病之一。
其中乳腺癌发病率是所有类型癌症的前五名，女性发病的首位，而且乳腺癌致死约占女性全部死因的五分之一[1]。
乳腺癌源于乳腺的腺上皮组织细胞的癌变，而且乳腺癌细胞非常松散，容易脱落并随着血管或者淋巴管播散至全身，对生命造成巨大威胁。
目前针对乳腺癌的治疗，一般是根据患者的身体条件和癌细胞的发展程度，酌情采取手术切除、放疗这类局部疗法或化疗这种全身疗法。
但是这些传统的疗法存在较大的局限性，比如化疗会造成比较严重的全身毒性，而且容易使癌细胞产生抗药性，严重影响治疗效果。
基因治疗具有高疗效、强靶向作用和低毒性的特点，是一种极具潜力的治疗乳腺癌的手段。
基因治疗是通过基因载体将治疗基因传递到靶细胞，然后通过治疗基因作用于靶点基因，起到治疗的效果。
基因沉默是基因治疗的一种常见的手段，它通过将小干扰RNA（smallinterferenceRNA,siRNA）传递到靶细胞，与靶mRNA结合成双链RNA，然后被RNA诱导沉默复合体（RNA-inducedsilencingcomplex,RISC）水解，从而抑制靶细胞内靶基因的表达，达到治疗目的[2,3]。
因为RNA具有很高的特异性，所以基因沉默有效的避免了全身毒性，且具有很高的疗效，远远优于传统的化疗[4-6]。
但是RNA在人体中很容易被降解，这一缺陷导致该疗法很难用于临床，而开发一种高效、靶向的基因载体是解决这一问题的重要方法。
胰岛素样生长因子（Insulin-likegrowthfactors,IGFs）信息系统能够调控细胞的增殖、分化、成熟和凋亡[7,8]。
IGFs信息系统由IGFs，胰岛素样生长因子受体（Insulin-likegrowthfactor1,2receptor,IGF-1R,IGF-2R）和胰岛素样生长因子结合蛋白（Insulin-likegrowthfactor-bindingproteins,IGFBP）这三部分组成。
该系统对机体的调控机制是在IGFBP的调控下，不同类型的IGFs与IGFs受体结合，释放不同信号，诱导下游细胞进行增殖、迁移、凋亡等活动[9]。
据已有研究表明，IGFs信息系统与癌症的产生和发展有着密切联系，因此IGFs系统是基因治疗的理想靶点[10,11]。
利用IGFs系统作为靶点治疗癌症有三种方式，分别是抑制IGFs的产生、抑制IGFs受体的活性、调节IGFBP的功能。
阳离子脂质体（cationiclipsome）是目前应用最多的非病毒基因载体，具有易制备、低毒性、易代谢、不易引发免疫排斥、转染效率高的优点[12]。
其基本结构类似于磷脂双分子层，并带有正电荷，能够与靶基因上的负电荷作用，可以延长治疗基因或药物在体内的存留时间，提高治疗效果。
本研究中使用本课题组自主开发的肽头部阳离子脂质体CDO14，前期研究证明，这种阳离子脂质体比市面上的商品脂质体更加高效、安全、毒副作用小[13,14]。
槲皮素是一种广泛分布于植物体内的类黄酮复合物，具有抗炎、抗过敏、抗菌、抗病毒、保护心脑血管等多种效用，而且有研究表明，槲皮素是已知的最强抗癌药物之一，在极低的浓度就能够抑制癌细胞的增殖[15-17]。
7-O-香叶基槲皮素（7-O-geranylquercetin,GQ）是本课题组自主研发的一种槲皮素的氧烃化衍生物。
根据之前研究结果，发现相比于槲皮素，该衍生物的脂溶性更好，抗癌效果更明显[19]。
综合疗法是癌症治疗的一个重要治疗手段，基因治疗与化疗联用以提高治疗效果是当前研究的热点。
本研究以自主开发的肽头部阳离子脂质体CDO14为载体，负载抗肿瘤药物7-O-香叶基槲皮素和IGF-1R-siRNA，构建纳米共载药系统，并研究该系统对人乳腺癌MDA-MB-231细胞的体外抗肿瘤效果，以期开发一种治疗乳腺癌的有效手段，并为肿瘤的协同疗法开拓思路。
一、材料
1.1细胞株
人乳腺癌MDA-MB-231细胞，购于中科院上海细胞生物学研究所。
1.2药品及主要试剂
肽型阳离子类脂质CDO14、7-O-香叶基槲皮素为本实验室自主设计、合成，结构经质谱和核磁共振鉴定；经过柱层析、重结晶等方法纯化，经过HPLC测定，纯度大于98%。
DMEM培养基：
Gibco，美国
胎牛血清：
Gibco，美国
二甲亚砜（DMSO）：
Solarbio，西班牙
胰酶：
Gibco，美国
PBS：
中杉金桥，北京
CellCountingKit-8（CCK-8）：
biotool，中国
AO/EB双染试剂盒，Solarbio，北京
AnnexiinV-FITC凋亡试剂盒：
三箭生物，天津
甲醇（色谱纯）：
TEDIA，美国
siRNA：
Invitrogen，美国
96孔细胞培养板、24孔细胞培养板购自中国NestBiotechnology公司
RIPI裂解液（强）：
碧云天，上海
BCA蛋白浓度测定试剂盒：
碧云天，上海
2×loadingbuffer：
Takara，日本
丙烯酰胺：
Solarbio，北京
SDS：
Solarbio，北京
过硫酸铵：
Solarbio，北京
TEMED：
Sigma，美国
Tris：
Solarbio，北京
ECL化学发光自显影试剂盒：
碧云天，上海
兔抗人IGF抗体：
Proteintech，美国
兔抗人Bcl-2抗体：
Proteintech，美国
兔抗人Caspase-3抗体：
Proteintech，美国
兔抗人Bax抗体：
Proteintech，美国
兔抗人actin抗体：
Proteintech，美国
HRP-羊抗兔IgG抗体：
Proteintech，美国
彩虹Marker：
Thermo，美国
脱脂奶粉：
BD，美国
1.3实验仪器
超净工作台
上海博迅实业有限公司医疗设备，上海
二氧化碳培养箱
Thermo公司，美国
超纯水装置
Cascada公司，美国
XQ-LS-S2高压灭菌锅
上海博迅实业有限公司医疗设备厂，上海
H-1650离心机
湘仪，长沙
酶标仪
倒置显微镜TE200-U
Thermo公司，美国
Nikon公司，日本
HC-3081R高速冷冻离心机
中科中佳科学仪器有限公司，安徽
微量移液器
Eppendorf公司，德国
AL104电子天平
Mettler-Toledo公司，美国
荧光显微镜TE2000-U
Nikon公司，日本
流式细胞仪
BectonDickinson公司，美国
激光散射粒度仪
DYY-6C型湿转电泳仪
脱色摇床
凝胶成像仪
Horiba公司，日本
北京六一仪器厂，北京
六一仪器厂，北京
Thermo公司，美国
1.4所需溶液
1.4.1PBS缓冲液（pH7.2）
NaCl8.00g，KCl0.20g，Na2HPO4·12H2O3.58g，KH2PO40.27g，溶解于0.8L三蒸水中，调pH值至7.2，定容至1L。
121℃高压灭菌30min，4℃保存。
1.4.2胰蛋白酶的配置
精密称取0.25g胰蛋白酶粉末和0.02gEDTA-2Na，用PBS缓冲液充分溶解并定容至100mL，用0.22μm微孔滤膜滤过除菌，无菌分装后至4℃冰箱保存。
二、实验方法
2.1siRNA的合成
siRNA由上海吉马公司合成。
IGF-1R-siRNA以下简称siIGF，阴性对照siRNA以下简称siN.C（此序列不与人类基因序列同源），序列见表1。
表1siRNA的序列
siRNA名称
siRNA序列
siIGF
Sense5´-UAGAUAUCUCGCGUCAUACdTdT-3´
Antisense3´-GUAUGACGCGAGAUAUCUAdTdT-5´
siN.C
Sense5´-CACAAGUAGGAAGUUCGGAdTdT-3´
Antisense3´-UCCGAACUUCCUACUUGUGdTdT-5´
2.2共载药系统的构建
2.2.1CDO14/GQ载药脂质体的构建
称取GQ0.1mg、类脂CDO141mg、10mg/mLDOPE80.4μL和甲醇1mL混匀，用旋转蒸发仪蒸发5-10min，取1mL三蒸水水化。
储存于冰箱4℃，备用。
2.2.2纳米共转运系统的构建
将载药脂质体CDO14/GQ经超声处理后取25µL加入无血清培养基至体积达500µL，混匀，即得到脂质体稀释液；取siIGF1µg/µL母液1µL，加入无血清培养基至体积达500µL，混匀，即得到siIGF稀释液；最后将siIGF稀释液缓慢加入脂质体稀释液中，混匀并避免出现沉淀，混合液室温静置20min，形成脂质体基因复合物。
2.3脂质体及共转运系统的物理性质表征
用激光散射粒度仪，于25℃，光散射角度90°条件下检测制备的载药脂质体的粒径及Zeta电位。
具体实验步骤如下：
打开仪器和软件，让仪器预热30min，载药脂质体超声10min，用移液枪取20μL制备的载药脂质体稀释于1mL三蒸水中，分别检测粒径和Zeta电位。
2.4细胞培养
将人乳腺癌MDA-MB-231细胞接种于装有含10%胎牛血清的DMEM培养基的细胞培养瓶中，于37℃、5%CO2、100%湿度的培养箱中培养24h。
待细胞生长至单层汇合时，吸取并弃去细胞培养液，用已经于37℃水浴中预热的PBS洗2遍，用0.25%胰蛋白酶（含0.02%EDTA）消化，适时吸弃胰蛋白酶，待所有细胞收缩呈圆形时，立即加入培养基以终止胰酶的消化作用。
后反复轻轻吹打，以制成细胞悬液，1200rpm离心5min，弃上清，重悬后按适当的比例传到新的培养瓶中继续培养。
2.5肿瘤细胞增殖测定
取人乳腺癌MDA-MB-231细胞，以4000-5000个细胞/孔的密度接种于96孔板中，使每孔最终细胞悬液体积为100μL。
将细胞培养于37℃、5%CO2、100%湿度的培养箱中，孵育18-22h后使细胞密度达到约50%。
用脂质体CDO14荷载siIGF，其中CDO14：
siIGF=25：
1，使CDO14与siIGF复合，室温下静置20min，形成复合物。
设置空白组、Control组、CDO14-siN.C组、CDO14-siIGF组、CDO14/GQ组及CDO14/GQ-siIGF组，每组6个复孔。
每孔中siIGF用量为0.1μg，CDO14用量为2.5μg，GQ终浓度为5µM。
给药后的培养板置于37℃、5%CO2、100%湿度的培养箱中继续培养24h。
然后用CCK-8法进行细胞增殖测定。
用在37℃水浴下预热后的PBS洗涤细胞培养板3次，每次100µL。
在避光条件下每孔加入空白培养基100µL和CCK-8溶液10µL，再继续在CO2培养箱中孵育1-2h。
后用酶标仪测定450nm下的吸光度，利用OD值计算出细胞增殖率（（ODtreatment-OD空白）/（ODcontrol-OD空白）×100%）。
2.6AO/EB双染法色检测凋亡
将人乳腺癌MDA-MB-231细胞以2-3×104个/孔的密度接种于24孔细胞培养板中，使每孔最终细胞悬液体积达1mL。
将细胞于37℃、5%CO2、100%湿度的培养箱中培养24h后，分别加入不同药物，设置Control组、CDO14-siN.C组、CDO14/GQ组、CDO14-siIGF组和CDO14/GQ-siIGF组。
再于CO2培养箱中培养24h，去掉培养基，用已于37℃水浴预热的PBS洗2遍，按照1mLPBS中加入20μL工作液的比例配制染色液，再每孔加入500µL前述染色液，室温放置2-5min后于荧光显微镜下观察。
2.7AV/PI双染法检测细胞凋亡
将人乳腺癌MDA-MB-231细胞以0.5-2×105个/孔（每孔细胞悬液2mL）的密度接种于6孔板，孵育培养24h。
设置Control组、CDO14-siN.C组、CDO14/GQ组、CDO14-siIGF组和CDO14/GQ-siIGF组。
按照分组加药处理细胞，每孔中siIGF用量为2μg，CDO14用量为50μg，GQ终浓度为5µM。
培养24h后用PBS清洗一遍，加入适量0.25%胰酶消化液，1200rpm离心5min，弃上清，收集细胞。
将收集的细胞重悬于500µL结合缓冲液，加入5µLAnnexinV，于室温下避光孵育10min后加入5µLPI，避光室温孵育5min，加入500µLPBS，使用流式细胞仪1h内检测。
2.8Westernblot检测蛋白
2.8.1蛋白的提取
将人乳腺癌MDA-MB-231细胞以0.5-2×105个/孔（每孔细胞悬液2mL）的密度接种于6孔板，孵育培养24h。
设置Control组、CDO14-siN.C组、CDO14/GQ组、CDO14-siIGF组和CDO14/GQ-siIGF组。
按照分组加药处理细胞，每孔中siIGF用量为2μg，CDO14用量为50μg，GQ终浓度为5µM。
将6孔培养板放置于培养箱中继续培养24h。
弃去上清培养基，用PBS液洗涤细胞3遍。
每孔加入1mL的PBS，用细胞刮棒刮下细胞并收集于1.5mLEP管中，1000rpm离心5min，弃上清，每EP管加入100μL裂解液（含1%PMSF），冰上裂解20min，每5min将EP管中混合物进行混匀震荡，裂解完毕后于12000rpm、4℃离心5min，吸出细胞上清液，并移入另一个EP管中放置于-80℃冰箱保存备用。
2.8.2蛋白定量
用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定提取的蛋白浓度。
然后根据测定结果将各组蛋白浓度调整至实验所需的同一浓度备用。
2.8.3蛋白样品的处理
取调整浓度后的蛋白样品，分别加入适量的2×Loadingbuffer，等体积稀释至1×Loadingbuffer。
置于沸水浴中，100℃加热5min使其变性，冷却至室温后于-20℃保存。
2.8.4电泳及转膜
根据目标蛋白分子量配制适宜比例的SDS-PAGE分离胶，并制备5%的浓缩胶，待胶凝后加电泳缓冲液，用准备好的蛋白样品进行上样，保证每孔上样量、上样浓度均相同。
蛋白通过浓缩胶层时使用电压为80V，分离胶层电压120V，直到溴酚蓝指示剂到达分离胶层的底部，停止电泳。
根据相应分子量的蛋白Marker切取所需蛋白所在位置的凝胶，并剪取与凝胶大小相同的PVDF膜。
PVDF膜放入甲醇中活化10s后再放入转膜缓冲液中浸润1min。
在转膜仪的阳极一侧按顺序依次放入海绵垫、3张滤纸、PVDF膜、凝胶、3张滤纸、海绵垫，标记PVDF膜以了解蛋白顺序，尽量排除气泡，采用湿转法转膜。
2.8.5Westernblot抗体孵育
转膜完成后，取出PVDF膜，首先用5%的脱脂奶粉对PVDF膜进行封闭。
在室温下置于摇床慢摇封闭2h。
封闭后取出PVDF膜用TBST缓冲液清洗，之后将PVDF膜孵育特定一抗，4℃孵育过夜；次日，将PVDF膜从一抗中取出，用TBST洗膜3次，每次10min，之后弃去TBST。
将PVDF膜孵育至相对应的二抗中，室温下置于摇床慢摇2h。
之后，将PVDF膜从二抗中取出，继续用TBST洗膜3次，每次10min，之后弃去TBST。
表2蛋白的名称、分子量、分离胶浓度、转膜时间及抗体稀释比例
蛋白名称
分子量（kDa）
分离胶浓度
转膜时间（min）
抗体稀释比例
β-actin
43
12%
43
1:
3000
bax
20
30%
20
1:
3000
bcl-2
26
30%
26
1:
1500
casepase-3
32
12%
32
1:
1000
IGF-1R
100
12%
升级会员 