单细胞藻轮虫培养技术要点.docx
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单细胞藻轮虫培养技术要点
单细胞藻、轮虫培养技术要点
陈世杰
（福建省水产研究所，厦门361012）
福建省水产技术推广总站
福建省水产饲料研究会
二OO四年三月·厦门
1、单细胞藻培养实用技术要点
1.1单细胞藻选用对象
1.2培养单细胞藻器具的清毒
1.3小球藻的分级培养
1.4营养及接种
1.5管理工作要点
1.6PVC透明塑袋培养
1.7敌害生物防控
1.8防治三例
1.9单细胞藻的浓缩与冷藏
2、轮虫培养实用技术要点
2.1轮虫个体的大小
2.2生态习性
2.3繁殖特点
2.4食性与食料
2.5培养方式
2.6投饵密度
2.7营养强化
2.8轮虫的收获
2.9“饥饿轮虫”问题
单细胞藻、轮虫培养技术要点
陈世杰
（福建省水产研究所，厦门361012）
“兵马未动，粮草先行”，“手中有粮，心里不慌”。
在饵料浮游动物（轮虫、卤虫、桡足类、枝角类等）的培养中，单细胞藻类作为最重要的基础性生物饵料来讲，在很大程度上是最优质而又不可或缺的；同时，单细胞藻在水产养殖中的作用日益凸显，其大量培养和生产不仅为鱼、虾、贝类等各种水产经济动物的苗种生产提供饵料，而且有些还可作为鱼虾配合饲料的重要添加物，起到营养平衡与强化效果，利于培育健壮的苗种。
单细胞藻作为培养轮虫的优质饵料，其关系更加密切，最重要的一点，是可以使轮虫摄食后，富有高度不饱和脂肪酸（HUFA）,大大提高轮虫的营养价值。
1、单细胞藻培养实用技术要点
1.1单细胞藻选用对象
有句俗话——“绿水养鱼、褐水养虾”，就是说，养鱼池水中以适量绿藻、养虾池水中以适量硅藻为宜，而贝类幼体在浮游期以金藻和绿藻为宜，在匍匐期则以底栖硅藻为宜。
常用的绿藻类如小球藻（Chlorella）、微绿球藻（Nanno-
chloropsisoculata）、盐藻（Dunaliella）、亚心形扁藻（Platymo-nassubcordiformis）、青岛大扁藻（P.helgolandicavar.tsing-
taoensis）、四肩突四鞭藻（Tetraselmistetrathele）；常用的硅藻如牟氏角毛藻（Chaetocerosmuelleri）、简单角毛藻（Chaet.
simplex）、新月菱形藻（Nitschiaclosterium）、三角褐指藻
（Phaeodactylumtricornutum）、中肋骨条藻（Skeletonema
costatum）。
常用的金藻类如绿光等鞭金藻（Isochrysisgarbana）、湛江叉鞭金藻（Dicrateriazhanjiangensis）、绿色巴夫藻（Pavlovaviridis）、鲁兹帕夫藻（P.lutheri）；常用的底栖硅藻如舟形藻（Navicula）、卵形藻（Cocconeis）、双眉藻（Amphora）、弯杆藻（Achnanthes）。
目前，在应用中，微绿球藻、骨条藻和金藻类巴夫藻更显现优点。
单细胞藻作为饵料培养轮虫及水产动物幼体苗种饵料，有以下特点：
①个体小（苗种、幼体之口径约为其体长的1/10），而细胞藻又应是其口径的√2/2或<4/5。
②运动速度、分布情况与幼体活动习性一致，便于摄食即摄食的机会更多。
③营养丰富，尽量选取无坚硬外壁的，适于消化吸收。
④本身及其代谢产物无毒，不影响幼体、苗种的正常生长。
⑤繁殖快，对环境的适应性强，容易大量培养和生产。
1.2培养单细胞藻器具的消毒
①在水中煮沸，5～15分钟；或在高压蒸气灭菌锅中，以1kg/cm2压力、121℃高温蒸煮15～20分钟，此法是加温80℃以上使敌害微小生物的蛋白质凝固而死。
②用70%酒精擦洗玻璃器具、工具的表面，此法是使敌害微小生物的蛋白质脱水变性。
③用300mg/L高锰酸钾浸泡5分钟以上，或泼洒水槽、水池，之后应用洁净海水冲洗，此法是因为高锰酸钾是强氧化剂，杀灭敌害生物。
④用1～5%漂白粉浸泼，方法与功能同③。
⑤用10%盐酸（1份盐酸：
9份水）浸擦玻璃工具，但金属器物和水泥池不宜用。
⑥用紫外线照射，在20℃、以250～260nm照射20分钟，杀菌效果较佳，但也应注意照射距离和时间的调整。
照射量较低时即能使病毒失活力，较高时使细菌失活力；杀灭酶菌丝需更高、杀灭原生动物还要高。
1.3小球藻的分级培养
一级培养（小型）目的为提供二级培养用，因此要求较严格：
一定选不混杂藻的单种（最好是无菌的纯种），密度高、不老化，没原生动物污染，培养中的用水经严格过滤与消毒，培养器具（主要是玻璃瓶）煮水待凉或用10%稀盐酸擦拭消毒；
二级培养（中型）是未来大量培养的基础，依然是需要比较严格的要求，但藻种密度及操作管理中的严密程度较弱，时有老化或极少量的原生动物污染；
三级培养（大量培养）是最终产品，基本上是单种，或混有少量杂藻，藻种密度不可能太浓，用水、器具均用次氯酸钠液或漂白粉（精）消毒，杀灭原生动物，8或4小时后用硫代硫酸钠中和。
1.4营养及接种
一、二级培养时，用营养盐母液调节，大面积培养则先溶解再泼洒。
如以N:
P:
Si:
Fe各为10:
1:
1:
0.1所配母液量为：
试剂
1/千母液
（克/500毫升）
1/万母液
（克/500毫升）
大面积
（克/吨）
硫酸铵（NH4）2SO4
24
240
47
硝酸铵NH4NO3
15
145
29
尿素NH2CONH2
11
110
22
磷酸二氢钾KH2PO4
2.1
21
4.2
磷酸氢钠Na2HPO
2.5
25
5
硅酸钠Na2SiO3（粉状）
2.2
22
4.4
硅酸钠Na2SiO3•9H2O（结晶）
5
50
10
三氯化铁FeCl3·6H20
0.24
2.4
0.2（1%50ml）
柠檬酸铁FeC6H5O7·3H2O
0.27
2.7
0.3（1%6ml）
施加营养盐时，每1000ml水用1/千母液1ml，每万ml水用1/万用母液1ml，各种营养元素肥只用其中一种试剂即可；除硅藻外，其他绿藻、金藻类不必施用硅酸钠。
接种量：
一级（1:
1）；二、三级（1:
10～20倍）
在每天上午接种好，阴天也应接种，尽量争取扩大采光及增加光照；藻密度小时，接种量宜小不宜大（1:
1～2），而藻密度大时，接种量宜大不宜小；同一天接时，先接不耐污种，后接耐污种，接种操作中的两个公式，公式A是指仔鱼基本摄食完了轮虫时，应加的藻量（L）
公式A：
加藻量（L）=×1000
公式B：
水泵运行时间（min）=
1.5管理工作要点
①在注意控温、调光、摇动（搅拌）和调节pH值、镜检方面，后两者一般会被忽视，但要加强各方面的管理措施，最适生态条件是保障。
②保持单细胞藻的种群优势，有利于抑制原生动物的繁生，以保持较高的藻类现存量。
藻类现存量=（接种量+净生长量）-收获量
③满负荷运转培养中，采收一半，又加一半，即加大接种量、加大光照和充气（充气量及增加池底面的充气气石）；另外，采用指数生长期的藻液，应重视光照强度、添加营养和充入含CO2（5%）的混合空气，待藻类密度上升稳定后再取用。
1.6PVC透明塑袋培养
①PVC透明塑袋或较厚的农用聚乙烯薄膜袋，优点是透光、韧性、无毒、价廉，以插入一根气石的充气管与另一根在袋中离开水面的出气管即可。
亦可当作营养盐导入及藻种输出用。
②塑袋培养的优点是：
（1）受光率可达99%，而水泥池受光率才28.6%（受光率=受光面积/表面积×100%）；
（2）藻类质量可保持在一、二级培养水平；（3）框架式设置可充分利用空间，水泥池则为平面布局，占用地面，很受限制；（4）设备简单、成本低；（5）一次性培养，防止原生动物污染。
科威特以直径30cm的容量200L的半透明直管培养藻类，光周期为12:
12，pH为6.5，可培养藻类密度达8700×104细胞/ml，产量达136g/m3·d。
1.7敌害生物防控
①常见单胞藻培养中的敌害生物有：
原生动物的游仆虫、急游虫、尖鼻虫、变形虫、鞭毛虫、小白虫等，还有颤藻、纤毛虫、钟形虫等，后者的出现，表现水质已相当不好了。
②敌害生物的危害机制与途径是，与单胞藻处于相同环境条件，且对环境变化的适应力更强，其危害途径是捕食、竞争饵料藻类及分泌有害物质的有毒虫种、藻种的毒害作用，单一或两者兼有的危害作用。
1.8防治三例
当藻液混入少量原生动物及轮虫该怎么办？
①利用原生动物比单胞藻耐受含氯氧化剂能力差的特点，在培养四肩突四鞭藻时，充分充气，10L藻液以8L/min充气量；在氯浓度分别是4.4～4.5、5.9～9、10.4～10.5mg/L以下的情况下，对藻类的繁殖分别是无影响、弱和不增长，但是当氯浓度为0.75-1mg/L时，轮虫就已先死亡了。
（冈内正典，1991）
②在藻类小型培养中，提高藻液盐度，如培养亚心形扁藻时，加盐使其比重升至1.056-1.060，然后再稀释一、二次，使之复原，使敌害生物因盐度改变而死去。
（陈明耀，1995）
③改变藻液的pH值，也是藻类小型培养中消除敌害生物的一种方法。
即每升藻液加1mol/L盐酸3～4ml，搅拌使其pH值接近3，经0.5～1小时后用1mol/L的氢氧化钠中和并复原pH值。
（李庆彪等，1999）
1.9单细胞藻的浓缩与冷藏
藻液浓缩或至膏状，于运输和储存均较方便。
浓缩藻类三例：
①明矾Al（OH）3用20～100mg/L，在低光下可浓缩950倍，浓缩菱形藻和三角褐指藻达到20～50亿细胞/ml；②氢氧化钠NaOH用15～25mg/L，（藻稀时用15，藻浓时用50）；③KMnO4用1.5～4mg/L，菱形藻和三角褐指藻达到1.2～1.6亿细胞/ml。
低温冷冻：
采用冰箱为4至-40℃范围，先用-28℃至-30℃速冻，再用-16℃至-18℃冷藏，藻类半个月复原；采用干冰为-79℃；采用液氮为-196℃。
防冻剂的添加各为：
甘油（5～10%）、葡萄糖（4～5%）、二乙醇（2.5%）等。
藻类在-20℃冷藏可存一周至一季度；在-70℃冷藏则可存一年。
2、轮虫培养实用技术要点
随着鱼、虾、蟹等苗种的规模化生产，轮虫（Rotifer）显现出作为主要饵料动物的优势，而且已成为专业化生产的重要饵料生物种，进行市场经济交易。
然而，大量培养要获得稳产高产，并且提高其营养价值，在培养中，需要了解和掌握一些技术要点。
2.1轮虫个体的大小
目前，在海水养殖鱼虾的育苗中，比较通用的是褶皱臂尾轮虫（Brachionusplicatilis），这是暖温、热带种类，适于半咸水至海水水域生长，其被甲长约196～250μ、宽150～202μ，在人工培养中，水温<5℃死亡，<10℃不摄食，适宜温度25～30℃，适宜盐度16～30。
“L型”轮虫（Brachionusplicatilistypycus），被甲长200～360μ，适于10℃以上水温，最适为18～25℃；
“S型”轮虫（Brachionusplicatilsrotundiformis），被甲长150～220μ，适于20℃以上水温，最适为25～35℃；
“SS型”轮虫，一般指比“S型”更小的轮虫，其中之一种，如“斐济小轮虫”，是日本栽培渔业协会松冈玳良在（18°S，178°E）的斐济虾场获得，抱卵个体150μ、未抱卵个体120μ，适宜温度23～27℃，若先用小球藻1170～2720万细胞/毫升、后并用面包酵母，则密度可达35～516个/毫升，产量达0.498亿个/日•m3。
2.2生态习性
①、水温：
<5℃停止活动，<10℃为繁殖临界，适宜水温25～35℃、最适30～35℃，如果高温超过40℃，几天内即死亡；②盐度：
<2（ppt）轮虫停止活动，适宜盐度10～30、最适15～25，若>50则死亡；③pH值：
<5停止活动，适宜范围6～9、最适8～8.2，若>10则死亡；④光照强度：
适宜于4400～10000（Lux），但在较弱光照条件下繁殖生长就比较缓慢；⑤溶解氧在0.07～0.38（mg/L）时死亡，适宜范围为2～7、最适为4～5；⑥COD：
适宜于20～100（mg/L）、最适为100，如果>100,则轮虫密度下降；⑦轮虫对总氨氮（NH3+NH4）可耐6～10mg/L，生活环境中的非离子氨不超过1mg/L。
2.3繁殖特点
轮虫行两性生殖：
一是无性生殖（即孤雌生殖，各代均为雌体），产“夏卵”（非需精卵），卵长径96～130μ、宽48～56μ；二是有性生殖（即产生混交雌体），产“冬卵”（需精卵），卵径130×88μ，如不受精则发育成小雄虫。
轮虫的繁殖特点还在于：
①饵料突然不足，或种群过密、或温度、盐度、pH值发生突变，则繁殖受阻；②在饵料充足、于20～22℃时，雌虫均活10.5天，繁殖维持均6.7天，产后代均21只；③仔轮虫（<100μ）在20～25℃时，2天发育为成虫（140μ），条件适宜时最初间隔4小时即抱卵，抱卵数多数为2～3个，也有少量可抱9～14个，一般7天内每个轮虫均总抱卵20个；④繁殖速度在22～24.5℃、盐度22～25、饵料充足时，轮虫密度由3只/ml经10天繁殖到610～980只/ml，平均仔虫800只/ml；另例43只/ml，经7天可繁殖到4256只/ml。
2.4食性与食料
①滤食性：
几乎不间歇的滤食行为，一般若密度达100只/ml时，能在12小时内将水中饵料滤食过半、24小时后滤食彻底；滤食颗粒粒径<25μ，尤以<15μ为宜；②食料——酵母菌、细菌、单细胞藻、原生动物、有机碎屑、乳化油（粒）；③单一用单细胞藻培养轮虫，一般大面积培养时，轮虫密度限于40～60只/ml；④各用啤酒酵母、面包酵母、活性干酵母培养的轮虫密度，可达到400～600只/ml甚至1000只/ml，但缺乏n-3系列的高度不饱和脂肪酸（HUFA），⑤二次培养的“面包酵母轮虫”，6小时后，其所含n-3（20:
5）（EPA）才含1～2%；而二次培养的“小球藻轮虫”，6小时后，其（EPA）可含27～28%；⑥鱼油或乌贼肝油乳化剂：
以水95：
鱼油或乌贼肝油5：
蛋1的成份组成，充分乳化成1～20μ的小油粒；⑦微生物絮团也可作为轮虫饵料，是以酵母等有益细菌为主，葡萄塘、尿素、磷酸钾为辅的碎屑悬粒。
2.5培养方式
1、粗养（Extensiveculture），50m3～1亩以上；
2、精养（Intensiveculture），0.5～1m3至<10～20m3。
又可分为：
①一次性培养（Batchculture），即一个小池，培养4～7天后，全池采收，清池重接，或多个小池换池轮培（利于清池）；②半连续培养（Semi-continuousculture），即半精养，属于土池间收法培养，一个大池，每天采收多少即补充藻水多少，可操作培养15～25天；③连续培养（Continuousculture），即室内封闭式培养，自动化控制采收。
3、培养例，以微绿球藻加上面包酵母培养“S型”轮虫，产量可达3亿只/日·m3。
增加适量的淡水，可以保持培养水盐度为23。
2.6投饵密度
1、用面包酵母，养100万只轮虫的投饵量，在25、30、35℃时分别投4、6～8、6g；而作为单投单细胞藻的补充饵料时，每100万只轮虫加投1g面包酵母。
2、用单细胞藻，如用小球藻，在20、25、30、35（℃）时分别投160、180、200、220（×104细胞/ml）；用扁藻，在20、25（℃）时分别投1～15、2.5～5（×104细胞/ml）；用硅藻，在20、25（℃）时分别投5～100、50（×104细胞/ml）。
3、怎样抽查轮虫的数量？
用1ml移液管，在轮虫分布均匀处抽查，用放大镜目测或在解剖镜下或墨盘下用碘液固定后再测计。
公式C：
加入仔鱼培育池的轮虫体积=
2.7营养强化
1、目的：
使轮虫增加携带EPA、DHA营养物质，使育苗对象摄食后更加健壮，增加存活率。
2、方法：
一般培养后，轮虫在育苗投饵前，再次以小球藻等二次培养，成为更富营养的轮虫。
3、方式：
①用面包酵母加上小球藻、微绿球藻以强化EPA，再加上用鱼油、乌贼肝油乳化以强化DHA；②用微粒（囊）配合饲料（粒径范围10～500μ），400只/ml，用强化剂50g/L，经3～4小时后，虫体收集洗净。
微粒（囊）饲料有三种：
微胶囊Micro-encapsulatedDiet,MED；微粘合Micro-boundDiet,MBD；微复膜Micro-coatedDiet,MCD。
已有各种市售商品。
③乳化鱼肝油：
颗粒细化，但漂于水中有影响，会使溶解氧和轮虫活力下降，而且要暗处理，以避免乳化物分解，强化轮虫时应有6～12小时或至少0.5～1小时。
④乳化物比例，鱼油:
蛋黄:
水为5ml:
1g:
95ml。
2.8轮虫的收获
培养轮虫到达密度100～300只/ml时，可以网目100μ的筛绢过滤捞取收获。
收获办法有：
①全收（一次性培养的），轮虫收获后，要用漂白粉（0.5%兑水泼洒）使之达到50ppm来清池，或是对旧池则用鱼藤精2～3ppm，有利于保护轮虫卵；②半收或部分收（半连续培养的），整个过程不能延长太久，半个月，三周左右就应彻底收完并清池；③土池轮虫的间收，实际上属上述②的做法，在轮虫繁殖到5～10只/ml，即可以泵水经300目筛滤来收集轮虫；④清池的具体操作：
漂白粉（含有效氯25～30%）60g/m3，或农用氨水（含有效氯15～17%）250ppm。
公式D轮虫收获总量=轮虫的密度×收获器皿的容积
公式E：
（投喂仔鱼）需加的轮虫液=
2.9“饥饿轮虫”问题
在生产性轮虫的培养和供应的各个环节中，必须特别重视轮虫的数量、质量和利于育苗对象苗种的健壮安全。
因此被称为“饥饿轮虫”的空腹轮虫，由于其处于饥饿状态，活力极差，直接投饵供水产苗种摄食显然是无效的，而且下水后漂浮于水面，被摄食的机会也少。
解决的办法是：
①在投喂育苗之前，先取样在白瓷碗中、观察轮虫群体色灰白者不宜，色灰青者才不致于是空腹；②在水表凝集成如蜡如絮的应捞取上来，重新以小球藻强化培养；③高密度携运到位，未马上启用的轮虫，应先扩散至较大的容器，控制条件使之相近似，不发生条件突变，加以投入新鲜小球藻暂养，使之恢复，改“饥饿轮虫”为实腹轮虫；④培养池中，见到多数轮虫不携卵、空腹、沉底、多死壳、活力差，均为培养轮虫的不良状态，就应采取积极措施，重新清池接种，扩种培养。
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