3T3L1细胞实验操作.docx

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3T3L1细胞实验操作

3T3-L1细胞实验操作

3T3-L1小鼠胚胎成纤维细胞（前脂肪）

培养基配制（准备1L高压过的超纯水）

1、DMEM粉倒入1L放旋子的烧杯，加灭菌水1000ml，盖锡纸磁力搅拌40分钟。

2、擦净，加入3.7gNa2CO3，盖锡纸磁力搅拌10分钟。

3、称2.38gHEPES（4℃保存），盖锡纸磁力搅拌20分钟。

4、拿过滤嘴、针筒，用针筒吸配好的培养基，通过滤嘴过滤至高压过的100ml瓶分装，4℃保存，用时加10ml血清配成10%FBS。

顺便先配诱导液：

配好的培养基分装入100ml瓶中，90mlDMEM。

准备好FBS、IBMX、DEX、insulin（2μg/ml）

先配两瓶100ml10%FBS，

A液：

IBMX1ml+DEX100μl+insulin250μl入100ml10%FBS

B液：

insulin250μl入100ml10%FBS（先过滤）

细胞冻存（全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）

1、准备DMEM（分装好的）*1瓶，50ml瓶*2，针，过滤器*1，DMSO试剂，冻存管。

2、配冻存液（10ml）：

按5：

4：

1比例→培养基5ml：

血清4ml：

DMSO1ml，混匀。

3、拿出一个新的、标记好用针筒把过滤器弄在瓶口用针筒吸新配的冻存液，把针头摘掉，经过滤器把新配的冻存液滤到新瓶。

4、PBS清洗细胞，加完盖盖子，加在壁上，然后吸弃，换枪头吸（一对一）。

5、吸胰酶500μl（吸匀再用），放显微镜观察，消化完毕即吸弃（一对一）。

6、大皿加入2~3ml冻存液，打圈吹散，分装1ml至冻存管，勿离心。

7、-4℃30min，-20℃1h，-80℃2h，最后液氮冻存。

一、细胞复苏（准备10%FBS、晚上复苏）

1、将从液氮取出冻存管放入37℃恒温水箱搅拌解冻。

2、将细胞悬液软管吸取至培养皿中，加入5~6ml10%FBS，混匀。

3、培养过夜后进行换液。

二、细胞传代（全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）

10%FBS即90mlDMEM+10ml血清半个月内用完

1、缓慢吸走旧培养基，换枪头，用2mlDMEM清洗，后吸弃。

2、加500μl胰酶，在显微镜观察细胞形态，大部分消化成方形即可吸弃胰酶。

3、加入2ml10%FBS，打圈混匀，吸1ml，每皿大概5~6滴入新的培养皿（大皿10滴~1ml），其余弃掉，后加3ml10%FBS（大皿8ml），大概可2天传代。

4、换液时需缓慢吸弃旧培养基，DMEM清洗细胞（注意换枪头杜绝污染）后吸弃，10%FBS贴壁加入3ml。

三、细胞接板（全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）

24孔板：

560μl细胞+6ml10%FBS（12个样）【600μl分化1.2ml增殖】

12孔板：

1400μl细胞+11ml10%FBS

用25ml瓶一板对一瓶装

1、准备好12孔板、24孔板各两份（两皿细胞）、DMEM、血清、25ml瓶4个、软管。

2、配10%FBS90mlDMEM+10ml血清

3、第一二瓶各6ml10%FBS，第三四瓶各11ml10%FBS

4、吸弃旧培养基，加2mlDMEM摇晃清洗，吸弃，500μl一皿细胞胰酶消化，显微镜观察细胞分散开来即停止消化。

5、每皿加入2ml10%FBS，1ml枪头打圈吹散。

6、将两皿细胞集中在一个培养皿，打圈吹散。

7、560μl细胞分别加入一二瓶混匀，1400μl细胞分别加入三四瓶混匀。

8、一二瓶对应加500μl细胞进24孔板（加12个孔）摇晃混匀，

三四瓶对应加1ml细胞进12孔板，摇晃混匀。

放培养箱，第二天进行转染。

四、细胞转染（无酶EP管、无酶小管、全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）

1、准Opti-MEM，灭菌水，mic（inhibitor），NC，Lipo3000，无酶EP管、无酶小管，96孔枪头板，12孔板、24孔板各2板（工具照紫外）

2、NC、mic（inhibitor）4℃1500r1.5min离心

3、分装Lipo3000tube管150μl一管（轻混），mic（inhibitor）、NC小管（换枪头加灭菌水稀释，按说明书要求），标记好

4、分装Opti-MEM20ml入瓶待用

5、计算好体系：

（n为样品数量，N为总样品数量）

Mic：

①45μl+600μlOpti-MEM（12孔板）---3.75μlMic*n+50μlOpti-MEM*n；

②22.5μl+300μlOpti-MEM（24孔板12个样）---1.875μlMic*n+25μlOpti-MEM*n

NC：

③45μl+600μlOpti-MEM（12孔板）---3.75μlNC*n+50μlOpti-MEM*n；

④22.5μl+300μlOpti-MEM（24孔板12个样）---1.875μlNC*n+25μlOpti-MEM*n

LP：

⑤84μl+1200μlOpti-MEM（12孔板）---3.5μlLP*N+50μlOpti-MEM*N；

⑥36μl+600μlOpti-MEM（24孔板12个样）---1.5μlLP*N+25μlOpti-MEM*N

Inhibitor：

①90μl+600μlOpti-MEM（12孔板）---7.5μlinh*n+50μlOpti-MEM*n；

②45μl+300μlOpti-MEM（24孔板12个样）---3.75μlinh*n+50μlOpti-MEM*n

NC：

③90μl+600μlOpti-MEM（12孔板）---7.5μlNC*n+50μlOpti-MEM*n；

④45μl+300μlOpti-MEM（24孔板12个样）---3.75μlNC*n+50μlOpti-MEM*n

LP：

⑤84μl+1200μlOpti-MEM（12孔板）---3.5μlLP*N+50μlOpti-MEM*N；

⑥36μl+600μlOpti-MEM（24孔板12个样）---1.5μlLP*N+25μlOpti-MEM*N

6、标记好tube管：

①mic45μl+600μl；②mic22.5μl+300μl；

③NC45μl+600μl；④NC22.5μl+300μl；

⑤LP84μl+1200μl；⑥LP36μl+600μl。

①in90μl+600μl；②in45μl+300μl；

③NC90μl+600μl；④NC45μl+300μl；

⑤LP84μl+1200μl；⑥LP36μl+600μl。

注意：

LP需轻轻混匀，⑤平均分至①③；⑥平均分至②④，加后轻轻混匀。

静置5min，拿出接板后的12孔板、24孔板细胞观察。

7、将旧培养基吸弃，12孔板每孔1mlOpti-MEM+100μl转染液；24孔板每孔500μlOpti-MEM+50μl转染液（12个孔）

8、加完晃匀，6h后换10%FBS，放培养箱42h后换诱导液开始进行诱导。

五、细胞诱导分化（全程灭菌、双手消毒、枪头勿乱碰、瓶口灭菌）

配置储备液：

IBMX（异丁基-甲基-黄嘌呤）:

分子量：

222.2g/mol（Sigma:

I5879）-20℃保存（难溶最后溶）

用二甲基亚砜DMSO配制111.1mg/ml（0.5mol/L）储存液

即：

0.0115gIBMX+940ulddH2O+60ulKOH

需用滤嘴过滤至新瓶子

终浓度为0.5mmol/L。

（现配现用）

DEX：

分子量：

392.5g/mol（Sigma:

D4902）-20℃保存

用无水乙醇配制1mg/ml（2.5mmol/L）储存液

即：

0.2mgDEX+0.5ml无水乙醇

终浓度为1umol/L。

Insulin：

25mgInsulin+12.5mlHCl

溶解后过滤，PCR小管分装，终浓度为2ug/ml，-20℃保存。

1、待3T3-L1细胞在24孔板，毎板100μl原细胞体积+400μl10%FBS养2天长满，配制诱导液诱导3T3-L1分化。

（先配好10%FBS两瓶100ml的）

2、将旧培养液软管吸弃，PBS清洗，吸弃PBS，加入配制好的诱导液I每孔500μl于24孔板中，培养2天。

3、将培养液软管吸弃，PBS清洗，吸弃PBS，用200ul的枪头慢慢加入配制好的诱导液II每孔500μl于24孔板中，培养2天。

4、将旧培养液软管吸弃，PBS清洗，吸弃PBS，用10%FBS培养基培养2天。

5、细胞油红O染色的操作步骤：

①、10%中性甲醛的配制

材料：

中性甲醛（多聚甲醛）密封瓶。

方法：

称取1g中性甲醛粉末，加入10ml的超纯水中，密封，在60度水浴中过夜才能溶解。

配好的溶液1个星期内有效，最好4度保存。

②、染色液的配制

材料：

油红染料、棕色可密封瓶、异丙醇、针筒、滤嘴

方法：

称取预先研磨粉碎的0.5g油红干粉，溶于少量异丙醇中，然后加异丙醇至100ml，60℃水浴溶解，棕色瓶密封（或锡箔纸包裹避光）4℃保存，为储存液，可长期保存。

用时取6ml加超纯水4ml混匀，滤嘴过滤，稀释后数小时内用完。

1、吸弃培养基，用PBS洗2遍，加入10％的甲醛固定30min~1h（贴壁加），期间过滤油红

2、吸弃10%甲醛，用超纯水洗2遍，60%异丙醇孵育5min

3、吸弃60%异丙醇，均匀覆盖oilredO染20min（6孔板2ml，12孔板1ml，24孔板500μl）

4、吸弃oilredO后，用超纯水洗2~5遍，直至无污点

5、加苏木精孵育细胞1min，吸弃苏木精，超纯水2~5遍

6、在细胞上加超纯水观察

若转染诱导成功，重新转染诱导一批细胞，进行一系列实验：

流式细胞术：

（无酶枪头、1.5mltube管）注意用前灭菌

1、准备接板好的12孔板细胞、无酶枪头、tube管、96孔板。

2、摆好12个tube管，把原来1ml10%FBS培养基吸至tube管，一组一枪头，吸1mlPBS清洗细胞（悬空加）。

吸弃PBS，一组一枪头，吸100~150μl胰酶消化细胞（两排两排消化），显微镜观察第一个，吸弃胰酶，将原培养基从tube管一一对应吸回去12孔板，并吹匀细胞，轻轻吹打。

显微镜观察是否吹匀。

3、将消化并吹匀的细胞悬液吸回去tube管，一对一，3000g离心5min。

4、吸上清，留沉淀，大概留50μl，调950μl吸弃上清。

5、悬空加入4℃冷却的PBS1ml，吹匀细胞，3000g离心5min，吸弃PBS（950μl+50μl两次小心吸弃）。

6、加300μl4℃冷却的PBS，吹匀细胞，避免成团。

7、缓慢悬空加入700μl预冷的70%无水乙醇，轻轻吹打均匀，4℃保存（可一周）。

PI染色：

1、准备好染色剂、25ml用锡箔纸包好的小瓶、24孔板、锡箔纸。

算好体系，多配一个样，加入小瓶备用。

现配现用，当天使用，4℃保存：

染色缓冲液（n+1）*0.5ml

-20℃碘化丙啶染色液（20x）（n+1）*25μl

保存RNaseA（50x）（n+1）*10μl避光配制

Total（n+1）*0.535ml先加多后加少容易混匀

2、将样品5000g离心6min，沉淀细胞。

小心吸除上清，850μl+50μl吸弃上清，预留50μl左右的乙醇，以免吸走细胞。

3、加入4℃PBS，洗涤一次，离心5000g5min，沉淀细胞，小心吸除上清，850μl+50μl吸弃上清，预留50μl左右的PBS，以免吸走细胞。

4、轻轻弹击tube管底，使细胞分散，避免成团。

5、染色：

每管样品中加入0.535ml染色液，缓慢并充分重悬细胞，37℃避光（样品放入24孔板用锡箔纸包好）温浴（放烘箱）30min，随后4℃或冰浴避光（样品垂直插入携带冰箱内冰）存放。

染色完成后宜24h内或当日完成检测，最好当天完成。

CV变异系数CV越低，峰值越好，越尖锐，5%左右效果较好，一般＜10%即可。

提RNA的收样（无酶枪头、1.5mltube管）注意用前灭菌

①一组组分好不同枪头吸弃培养基，加入500μlRNAiso放5min。

②标记好无酶1.5mltube管，反复刮取、吸取细胞，将细胞移至tube管（不同组必须换枪头，移完盖好）。

③收样存放-80℃。

RNA提取（无酶枪头、1.5mltube管）

①从-80℃冰箱取出样品

↓静置5min后12000r，4℃离心10min

②上清移至新的1.5mltube管并标记好

↓加入

RNAisoPlus等体积的氯仿（一般为100μl）震荡摇匀

③室温静置5min

↓12000r，4℃离心15min

④将上清转移至新的tube管并标记好（150~200μl）

↓加与上清液等体积的异丙醇，颠倒混匀

⑤室温静置10min

↓13000r，4℃离心10min

⑥弃上清，向沉淀加入1ml的75%乙醇颠倒清洗沉淀

（离心时以管头朝内侧，则沉淀会附于管外侧，加入乙醇时从内侧，勿触沉淀，设阴性对照，即横板为dH2O）

↓13000r，4℃离心10min

⑦弃上清，留沉淀

↓14000r，4℃离心3min

⑨吸走多余的75%乙醇

↓操作台风干2min

⑩各加入8μlDEPC溶解

检测纯度：

打开软件→按“Acid”→按“否”→选RNA

↓每次吸2μlDEPC先洗3遍，用滤纸弄干

用2μlDEPC每洗1次按Blank，Measure

↓洗到

0.5为止

每个样品吸2μl，Measure（每测完一次都要擦干）

↓

保存（Report）

RNA稀释：

（mRNA定量C统一为200miRNA定量C统一为500）

（V剩=6μl）

miRNA定量（冰上操作、无酶离心管、无酶枪头）

①取已稀释的RT引物5μl，加入45μlRNA-Free水。

准备好96孔板，引物RT，U6RT，放在冰上。

②多配一个体系：

miRNA-RT引物2μl（n+1）

U6RT2μl（n+1）

RNA不少于1500ng（1500ng/C统一=3μl）

无菌ddH2O4μl（n+1）

总体积11μl（n+1）

注意：

RT引物用前稀释；

配②体系时，RT引物和U6RT的量是固定的，模板和水的量是浮动的；

只在一个引物里面加内参；

下游引物是通用的；

不够的体系用无菌ddH2O配平；

做完样品后保存至-20℃；

如果接下来要做miRNA定量，则放在4℃备用。

样品1

样品2

样品3

样品4

样品5

样品6

↑

11μl体系②

③后对应加入模板（1500ng/C统一=）3μl，标记好，放入小型离心机，离心一下，再放入PCR仪

70℃10min，冰上2min（程序：

000）

④放一管无酶tube管，多配一个体系，加入体系：

5xbuffer5μl（n+1）

Mix1μl（n+1）

无菌ddH2O8μl（n+1）

总体积：

14μl（n+1）

样品1

样品2

样品3

样品4

样品5

样品6

↑

14μl体系④

即总体积：

25μl

42℃1h，37℃15min，98℃5min（程序：

0000）

⑤多配一个体系（n+1），混匀，引物瞬时离心：

SYBR10μl（n+1）

F0.8μl（n+1）

R（通用）0.8μl（n+1）

ddH2O6.4μl（n+1）

除去模板2μl，总体积18μl（n+1）

⑥在冰上铺一次性手套，按96孔板在冰里，放好定量小管，标记好

⑦每个小管对应加18μl体系⑤，每个样都要有U6作为参照：

cDNA

miR

miR体系⑤

U6体系⑤

盖上盖子，注意勿污染，用一次性手套隔着按紧定量管盖子，用镊子轻轻撬松定量小管，离心一下。

⑧去杨老师那，打开Real-time机，桌面miRNApcrd，然后OK→Next→选第三个→OpenLid，放样品，用一次性手套按一下，最后CloseLid→StarRun，选择文件夹命名好保存，直到机器绿灯亮起，登记好走人。

RT-PCR（冰上操作、无酶离心管、无酶枪头）

①按1：

50比例加1μlgDNARemover入50μl4xDNAmastermix

②标记、加样、低速离心，加2μlRNA进管，RNA热变性5min65℃，冰上冷却

③先配总4xDNAmastermix2μl（固定）

后分装dH2O4μl（根据样品而定）

C统一为200

RNA模板（样品）2μl（≤0.5μg）

Total8μl

37℃5min冰上冷却注：

n为样品数量

④上述反应液8μl

5xRTmixII2μl

Total10μl

37℃15min，50℃5min，98℃5min，4℃保存

⑤加ddH2O稀释40μl--即稀释5倍（换枪头混匀，4℃保存）

mRNA定量（冰上操作、无酶离心管、无酶枪头）

1、反应体系

试剂

体积

２×ＳＹＢＲ

10μL

上游引物

0.8μL

下游引物

0.8μL

灭菌水

5.4μL

RNA模板

3μL

总体积

20μL

2、冰上操作，准备好各种规格的无酶枪头、tube管、引物、定量管

3、计算体系，多配2个

4、摆好定量管、tube管，标记好，先加体系（加中间，勿碰壁）

5、加样一个对应一种引物

6、加盖盖紧，离心

7、打开Mrd_RT→StarRun→OpenLid按顺序摆好→CloseLid→StarRun选好文件夹，保存好，开始。

WesternBlot

细胞蛋白收样（冰上操作、无酶EP管、无酶枪头）

1、n个样，n*2个EP管（一式两份），实验前2-3分钟准备试剂（RIPA、PI），打冰。

2、把要收的样小心吸弃培养基，注意一组一枪头。

3、1ml冷冻的PBS清洗，吸弃，换组换枪头。

4、配蛋白裂解液：

六孔板每孔150μl/十二孔板每孔100μl，多配一点，RIPA：

PI=100：

1。

5、按体系算好，加入，晃匀，4℃冰箱孵育30min，打开4℃离心机。

6、用200μl枪头吸匀刮取后加入至tube管，12000x/g（即12000rcf）离心15min

7、移上清至新无酶小管（先吸上部分，下部分10μl枪头慢慢吸，维持140μl~150μl），收样完后-80℃保存。

蛋白浓度测定（冰上操作、无酶tube管、无酶枪头）

1、BCA法

BCA试剂：

取50份试剂A与1份试剂B混合均匀。

此试剂可稳定一周。

（需先计算体系，即

）

标准蛋白质溶液：

所买试剂浓度5mg/ml，用时稀释成1mg/ml的溶液。

（从5mg/ml的标准蛋白溶液吸取12.6μl加入50.4μl的RIPA共配63μl的1μg/μl的标准蛋白溶液）

实验操作：

绘制标准曲线

取96孔酶标板，按下表加入试剂。

标准曲线的绘制（表1）

管号

标准蛋白溶液（μl）

63μl

RIPA（μl）

BCA试剂（μl）

200

蛋白质浓度（mg/ml）

0.025

0.05

0.1

0.2

0.3

0.4

0.5

上述试剂加完后，准确吸取20μl样品（10μl样品+10μlRIPA）溶液于酶标孔中，加入BCA试剂200μl，轻摇，于37℃保温30-60min，冷却至室温后，以空白为对照，在酶标仪上590nm处比色---

打开酶标仪，把96孔板盖去掉放进酶标仪并合上，电脑打开Gen5，点击BCA.pot，点OK即可导出Excel。

以牛血清白蛋白含量为横坐标，以吸光值为纵坐标，绘制标准曲线。

以标准曲线空白为对照，根据样品的吸光值从标准曲线上查出样品的蛋白质含量----

保存Excel文件，选中测得标准蛋白溶液吸光度为横坐标，蛋白质浓度为纵坐标，插入XY散点图，右击表中的散点，添加趋势线，选择多项式，勾选显示公式以及R平均值。

将样品吸光值copy成列，将样品测得吸光值带入公式即可求得C所测样品稀释后浓度，由于所测20μl样品是10μl原样品+10μlPBS，即稀释2倍，所以C该样品实际浓度=2×C所测样品稀释后浓度，n该样品体系最小物质量=C最小所测体系浓度*V最小浓度体积，V所取体积=n该样品体系最小物质量/C该样品体系浓度，

，VSDS=V所取体积/4。

（V最小浓度体积为测得最小浓度的样品剩下体积；C所测样品稀释后浓度为代入公式后的浓度）

蛋白变性

在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。

使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。

上样体积：

5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液（LoadingBuffer）=4:

1，离心一下，沸水煮10分钟，以充分变性蛋白。

一、流程图

制胶（1h）→电泳跑胶（80V40min110V140min&90V30min）→转膜（80V50min&）→TBST清洗5次（每次5min）→封闭（1.5h）→TBST清洗5次（每次5min）→附Ⅰ抗（内参：

小鼠抗β-Actin，先摇床轻摇30min，再放冰箱4度过夜）→TBST清洗三次（5min/次）→附Ⅱ抗（内参：

山羊抗小鼠，轻摇1h）→TBST清洗三次（5min/次）→显影

二、物料及配制

1、电泳液：

一包电泳粉+1000ml双蒸水（可回收使用）

2、10%过硫酸铵：

1g过硫酸铵+10ml双蒸水

3、转膜液：

一包转膜粉+800ml双蒸水+200ml甲醇（可回收使用）

4、

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