2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究.docx
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2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究
2型糖尿病中医湿热困脾证的基因表达研究
作者:
柴可夫黄晓玲钱俊文马纲
【摘要】目的]从分子水平探讨2型糖尿病湿热困脾证的中医证候实质。
[方法]抽取2型糖尿病气阴两虚证患者静脉血,检测血糖,血脂及电解质,分离血液中的白细胞,提取总RNA,化学发光方法检测基因芯片,用ScanAlyze软件采集图像,GEArrayAnalyzer软件分析数据。
对部分差异表达基因进行RTPCR和Westernblotting方法验证。
[结果]2型糖尿病湿热困脾证患者血糖,血脂,电解质与健康人有显着差异,基因芯片检测发现和健康人差异表达基因共38条,其中上调的基因有24条,下调的基因有14条。
并发现湿热困脾证的特异性基因。
通过RTPCR和Westernblotting方法反向验证IRS2和FOXC2基因,证实2型糖尿病湿热困脾证患者和健康人白细胞中存在IRS2和FOXC2存在差异表达。
[结论]应用基因芯片筛选2型糖尿病湿热困脾证的差异表达基因,为2型糖尿病辨证论治提供新思路。
【关键词】2型糖尿病;基因芯片;辨证分型
糖尿病是一组由遗传和环境因素相互作用而引起的慢性疾病。
因胰岛素分泌绝对或相对不足以及靶组织细胞对胰岛素敏感性降低,引起糖、蛋白质、脂肪、水和电解质等一系列代谢紊乱为主要共同标志。
本研究观察糖尿病湿热困脾证的基因表达差异,探讨2型糖尿病湿热困脾证的证候实质。
1临床资料 研究对象对浙江中医药大学附属第二医院糖尿病防治中心400例糖尿病患者进行中医辨证分型,随机选取6例湿热困脾证患者,其中男性3例,女性3例,年龄30岁至65岁之间,年龄岁。
另选取年龄与性别相匹配的健康人6例作对照,平均为岁。
健康对照组皆通过血糖检查排除糖尿病,通过病史调查和体检、血象、肝肾功能、胸透、心电图等检查,排除其它内分泌疾病和各系统器质性疾病。
2现代医学诊断标准根据1999年WHO专家咨询报告诊断标准,空腹血糖≥/L(126mg/dl);或糖耐量试验中服糖后2小时血糖≥/L(200mg/dl);或随机血糖≥/L(200mg/dl)。
3中医辨证标准参照2002年版《中药新药临床研究指导原则》中“中药新药治疗糖尿病的临床研究指导原则”,湿热困脾证,主症:
胸脘腹胀,或食后饱满,头身困重。
次症:
体形肥胖,心胸烦躁,四肢倦怠,小便黄赤,大便不爽。
舌脉:
舌红苔黄腻,脉滑而数。
4病例纳入和排除原则凡符合现代医学诊断标准和中医辨证标准,可纳入试验病例。
排除①有糖尿病急性并发症;②经确诊为1型糖尿病,其它类型糖尿病及妊娠糖尿病者;③年龄在40岁以下或70岁以上,妊娠或哺乳期妇女;④有严重心、肝、肾等并发症,或合并有其它严重原发性疾病,精神病患者。
⑤中医辨证症状不典型,或者两型三型并见证型复杂者。
2实验方法
一般情况测量身高,体重。
计算体重指数/身高。
生化检测所有受试对象均于上午8时前空腹抽取肘静脉血10ml,用于测空腹血糖、血脂、糖化血红蛋白、胰岛素抵抗指数、血钙、血钾等生化检测。
基因芯片检测
白细胞的提取与RNA的纯化随机选取其中3名湿热困脾证糖尿病患者和3名健康人抽取静脉血5ml,用红细胞裂解液分离白细胞,采用Trizol一步法抽提总RNA,用分光光度计在260nm和280nm分别测定吸光度,A260/A280比值在~为较纯的RNA,可用于芯片检测。
芯片杂交经检测合格后的总RNA可用于合成双链DNA进行纯化。
然后进行化学发光检测的AmpoLabelingLPR标记,变性的cDNA探针全部加入预热的GEAprehyb中,混匀,放在60°C待用。
弃去杂交管中的GEAprehyb溶液,加入含探针的GEAhyb混合液至杂交管中,60°C下6rpm杂交。
化学发光检测洗膜后加入链亲和素偶联的碱性磷酸酶,再洗膜4次,加入CDPStar化学发光底物至杂交管中,室温孵育2min。
用滤纸去除多余的CDPStar溶液,用X射线胶片曝光。
图像采集和数据分析运行ScanAlyze软件,将灰度TIFF格式图片的点阵转化为数字型数据,使用芯片配套软件GEArrayAnalyzer对原始数据进行去背景计算以及比较运算。
逆转录聚合酶链反应方法验证部分差异表达基因。
引物设计将RNA反转录合成CDNA,用Primer5软件设计,由上海生物工程技术有限公司合成。
扩增引物PrimerbpIRS2FOXC2βactin上游5‘TTGAGGCGGCTAAGTCT3‘下游5‘TCCCAGgATgCTgTTgC3‘上游5‘CCTTCTACCgCGAGAACAAG3‘下游5‘CCGgGTCGAgCGTCCAGTAG3‘上游5‘ATGCCATCCTGCgTCTG3‘下游5‘ACTCCTgCTTGCTGATCC3‘393520566
扩增反应条件:
FOXC294℃5min;94℃30s;℃50s;72℃1min;72℃5min;共30个循环
IRS294℃5min;94℃30s;℃50s;72℃1min;72℃5min;共30个循环
βactin94℃5min;94℃30s;℃50s;72℃1min;72℃5min;共30个循环
扩增产物取10μl的βactin和10μl目的基因在%琼脂糖(含/ml)上电泳,紫外灯下观察结果并照相,吸光度扫描仪扫描后PCR条带用软件进行定量分析,结果为基因表达量对βactin内参的比值,以上结果重复3次,取平均值。
Westernblotting检测IRS2蛋白的表达抽提蛋白、制备PAGE胶、膜在5%BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准,室温孵育膜1小时。
KCTM化学发光试剂盒中两种试剂等比例混合为反应液,将膜置于反应液中室温孵育5min。
去除过量的溶液,将膜夹在两塑料薄膜之间,以X光胶片曝光。
图片扫描保存为电脑文件,并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值数字化。
统计学分析各组实验数据以(x±s)表示,采用SPSS软件处理,以OneWayANOVA方法进行方差分析,为统计学意义显着性标准。
3结果
糖尿病湿热困脾证临床基本资料间的关系湿热困脾证组BMI、HbAlc均高于健康对照组,其间差别有统计学意义(),湿热困脾证组ISI显着低于健康对照组()。
血脂情况观察发现湿热困脾证的TG水平高于健康对照组;HDLC水平低于健康对照组;LDLC水平明显高于健康对照组,差别有统计学意义。
湿热困脾证患者血清钙、血钾均低于健康对照组,见表1、表2、表3。
表1糖尿病湿热困脾证与健康对照组BMI、HbAlc、ISI的比较
与健康组比较,*,#
表2糖尿病湿热困脾证与健康对照组TG、HDLC、LDLC的比较
与健康组比较,*
表3糖尿病湿热困脾证与健康对照组BMI、HbAlc、ISI的比较
与健康组比较,*
基因芯片检测结果
总RNA提取结果总RNA紫外分光OD26/OD28在~之间,提取的总RNA28S、18SrRNA亮而浓条带清晰,RNA样品电泳条带清晰,28S比18S条带的亮度接近2∶1,质量符合分类表达谱芯片实验要求,总RNA质量完整无降解。
湿热困脾证糖尿病患者的基因表达研究 湿热困脾证糖尿病患者与健康对照组相比,共筛选出表达量改变比值大于2倍的基因38条,其中表达上调的基因有24条,包括受体、载体通道基因5条;分泌基因5条;信号转导基因2条;转录因子基因7条;代谢酶基因5条。
表达下调的基因有14条,包括代谢酶基因2条;信号转导基因6条;受体、载体通道基因3条;转录因子基因1条;未知基因1条,见图1、表4、表5。
湿热困脾组健康对照组
图1化学发光法SuperArrary芯片图
表4糖尿病湿热困脾证与健康对照组相比表达上调基因
表5糖尿病湿热困脾证与健康对照组相比表达下调基因
部分差异基因的验证
荧光定量PCR检测结果结果显示,两条基因表达均与芯片结果相符合,其中FOXC2在湿热困脾证中表达为上调;IRS2在湿热困脾证中表达为下调,见图2、图3、表6。
Westernblotting检测结果结果显示IRS2蛋白表达与基因芯片结果相一致,在湿热困脾证中表达减少,见图3。
Marker;1.健康对照组;2.湿热困脾组
图2糖尿病湿热困脾证与健康人IRS2、FOXC2和内参照基因βactinmRNA表达湿热困脾组2.健康对照组
图3糖尿病湿热困脾证和健康对照组IRS2蛋白表达
表62型糖尿病湿热困脾证与健康人IRS2、FOXC2mRNA及IRS2蛋白的表达
与糖尿病组比较,*
4讨论
2型糖尿病属于中医“消渴”的范畴。
病因为长期食用肥甘厚腻之品,而致湿热中阻,久而发为消渴。
肥胖是湿热困脾型2型糖尿病的重要因素,故湿热困脾证糖尿病患者体重指数较高,肥胖往往伴随胰岛素抵抗,本项研究显示:
湿热困脾证的ISI指数显着低于健康人,提示存在胰岛素抵抗。
湿热困脾证糖尿病患者的血糖、血脂及电解质水平均高于健康对照组;糖尿病患者基因表达与健康人比较,差异表达基因有38条,差异基因总体呈上调趋势。
这些基因与肥胖、胰岛素抵抗、早期糖尿病及糖尿病的各种并发症有关。
IFNγ属于分泌因子相关基因,是一种由活化T细胞产生,具有抗病毒、抑细胞生长及刺激中性粒细胞及血管内皮细胞生长的生理功能。
过去已有多项研究表明:
自身免疫性疾病患者的血清干扰素(INF)反应异常。
淋巴细胞产生的IFNγ介导单核细胞与T淋巴细胞之间的对话。
目前认为不仅1型糖尿病是一种自身免疫性疾病,而且2型糖尿病的发病也与机体的免疫功能密切相关。
2型糖尿病是在遗传基础上由多因素促成的,患者有免疫异常,其胰岛细胞抗体(ICA)阳性者比ICA阴性者有更严重的β细胞损害[1]。
IFNγ能显着抑制胰岛素的分泌,促进胰岛β细胞凋亡[2]。
本研究中,基因芯片结果中糖尿病湿热困脾证患者的IFNγ表达上调,显着高于健康对照组,表达差异在2倍以上。
L选择素属于受体、载体及其通道基因,是黏附分子选择素家族的成员之一。
近年的研究显示L选择素与糖尿病血管病变的发生发展密切相关[3],L选择素介导的活化血小板与内皮细胞、白细胞的黏附,相互作用,释放活性物质,如血小板源性生长因子、血管内皮细胞生长因子、成纤维细胞生长因子等,促进血管平滑肌增生、结缔组织生成,最终导致动脉粥样硬化的形成[4]。
本研究中,糖尿病湿热困脾证患者的L选择素的表达显着高于健康对照组,可能与2型糖尿病患者伴有不同程度血管病变的并发症有关。
IRS2蛋白(Mr180000)最初是从骨髓组织中提纯分离,称为4PS,因与IRS1有高度保守结构和一些共同功能,后定名为IRS2[5]。
已证明IRS2的表达下降有助于2型糖尿病的形成。
造成IRS2表达下降的原因包括基因启动子或增强子的突变,这使转录速度减小;还包括造成mRNA稳定性或转录效率下降的突变等。
本项研究中发现有5条特异性下调表达基因,仅存在于湿热困脾证中,而在其他证型中未见有异常表达。
它们分别是:
CCR2、INPPL1、AKT2、CEACAM1、NFKB1,这些基因均与2型糖尿病的发生和发展有密切的联系,本项目研究结果进一步证实它们与湿热困脾证有内在的联系。
通过对糖尿病湿热困脾证的基因组学研究,深化了对“湿热困脾证”本质的理性认识,将宏观现象的研究与微观机理的探讨很好的结合,中医辨证施治侧重于宏观调控,对微观的揭示还不那么精确,诊断疾病的依据往往显得较为笼统,因而影响了“治未病”的普及运用。
基因表达谱是从mRNA水准反映了细胞或组织特异性表型和表达模式,与临床上出现的症状和体征有着必然的内在联系,根据基因芯片结果提供的依据,不难预见糖尿病的发生发展规律,从而给出确切的基因治疗方案,这些都将在一定程度上提高糖尿病的治疗效果。
【参考文献】
1]GonzalezAlvaroI,DominguezJimenezC,OrtizAM,etkin15andIFNγparticipateinthecrosstalkbetweennaturalkillerandmonocyticcellsrequiredfortumournecrosisfactorproduction[J].ArthritisResTher,2006,8(4):
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[2]Aiello factorinducedretinalpermeabilityismediatedbyanorallyeffectiveβisoformsdectioninhibitor[J].Diabetes,1997,40:
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[3]HafeziMoghadaA,ThomasKL,ProrockA,etselectinsheddingregulatesleukocyterecruitment[J].JexpMed,2001,193(7):
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[4]LIULH,LIJ,ZHANG betweenlevelsofcirculationICAM1,VCAM1,LselectinandcardiovasculardiseaseswithOSAS[J].ZhongguoXiandaiYixue,2002,12(7):
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[5]KIRSTENF,HOWLETT,KEISakamoto,et signalingafterexerciseininsulinreceptorsubstrate2deficientmice[J].Diabetes,2002,51
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479483.