超声萃取多糖及生化鉴定 2.docx

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超声萃取多糖及生化鉴定2

毕业设计（论文）外文资料翻译

题目:

超声波萃取虫草头孢菌丝体多糖的理化特性

院系名称：

生物工程专业班级：

F1002

学生姓名：

李新乐学号：

201046850618

指导教师：

翟丹丹教师职称：

讲师

起止日期：

2014、2—2014、3地点:

9133实验室

附件：

1.外文资料翻译译文；2.外文原文。

指导教师评语：

由于该生经过大量地查阅虫草类真菌的活性物质提取工艺相关的国内外文献，较好地掌握了该研究领域的专业知识，从而较准确地翻译了该外文文献，语句通顺，层次分明，译文符合汉语表达习惯。

译文字数符合翻译数量要求。

签名：

年月日

超声波萃取虫草头孢菌丝体多糖的理化特性

摘要：

本文介绍了超声波萃取（USE）虫草头孢菌丝体多糖法并与热水浸提法进行对比。

对粗多糖进行了形态和热力学性质的研究。

对两个主要组分（USEP70USEP40-1-1）进行了纯化，并研究红外光谱、分子量、单糖组成和抗氧化活性。

结果表明，USE法由于其更强的提取工艺可获得更高的提取效率。

USEP40-1和USEP70-1的红外光谱在大约1746cm−1不同。

USEP40-1和USEP70-1的分子量分别为61.4kDa和25.1kDa。

USEP40-1和USEP70-1分别是由D-甘露糖，D-葡萄糖，D-半乳糖，L-鼠李糖，和L-阿拉伯糖以用摩尔比为分别为11.52:

5.54:

8.75:

2.45:

2.59和11.50:

6.74:

5.75:

4.46:

2.39组成的。

从USEP40-1和70-1USEP中可以观察到不同ABTS和羟自由基的清除活力。

关键词：

多糖、虫草头孢菌丝体、超声波萃取

1、引言

冬虫夏草（Berk.）SACC，是一种生长在干的毛虫幼虫体内的真菌[1]，在中国数百年来已被作为一种有利的的进补草药使用。

然而，由于地理分布局限和近年来的过度开发，人们现在只能依靠发酵法规模化生产，以满足日益增长的消费需求。

虫草头孢菌丝体（CCM），是一种从冬虫夏草中分离的菌株（头孢冬虫夏草CHEN）的深层发酵的产品，与天然虫草具有相似活性[2]。

在众多的生物活性成分中，多糖由于其更高的含量[3]和显着的药理活性吸引了更多的关注，如免疫学刺激[4-6]，抗肿瘤作用[7,8]，和抗氧化剂活力[9,10]。

目前，热水浸提法（HWE）是从CCM中提取多糖最常见的方法。

然而，由于HWE法需要较高的提取温度，所以相当耗时。

近年来，超声提取法（USE）广泛使用在天然产物的提取过程中，它是一种一直在开发的有效的替代传统提取法的技术[11,12]。

然而，超声波法从CCM中提取胞内多糖，仅有相当有限的研究调查。

在本次超声波法从CCM中提取的多糖研究中。

对粗多糖的形态和热力学特性与热水提取法提取的粗多糖进行比较，红外光谱、分子量、单糖组成和体外抗氧化活性的主要纯化组分均有影响。

2、材料与方法

2.1、材料和仪器

CCM由杭州雪域生物科技有限公司提供（中国、镇江），在使用前用石油醚回流。

ABTS（2,2-连氮基-双（3-乙基苯并噻唑-6-磺酸））是从Amresco公司获得。

不同分子量的SephadexG-100和葡聚糖由Pharmacia有限公司提供。

标准的单糖（D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖和L-岩藻糖）均购自中国药品生物制品研究所。

本实验中使用的所有其它化学试剂均为在当地购买的分析纯试剂。

在实验过程中使用的超声波处理器（D100，20千赫，兴隆生物科技有限公司，北京，中国）。

本设备配备了超声波探头（直径15mm），

一个温度传感器，一个喇叭容器及其设置范围从100到1300W的可调电源。

热水提取在控制的恒温水浴中进行（DK-8D，奕亨技术有限公司，上海，中国）。

2.2、粗多糖的制备

热水提取（HWE）和超声波萃取（USE）进行了一定的条件优化。

HWE工艺：

提取温度为95摄氏度，水料比为45:

1，原料萃取两次（每次3小时）。

UAE工艺：

超声波探头浸渍到水下20毫米，10.0克原料，用35倍的去离子水混合，输入超声功率为330W，提取时间为29分钟，提取温度为62摄氏度。

萃取后，将粗萃取液以5000g离心分离15分钟。

向溶液中加入4倍体积的95％乙醇，并保持在4摄氏度下进行12小时。

通过在5000g离心分离15分钟收集沉淀物，并命名作为USEP和HWEP。

提取率表示为干重下每克原料的多糖含量。

2.3、形态分析

将样品冷冻干燥，固定在样品架上铝带上，然后使用EMITECHK500X溅射涂布机溅射金的薄涂层。

在高真空加速电压为5.0千伏条件下，使用冷场发射扫描电子显微镜（JSM6700F）对样品进行分析。

2.4热力学分析

用热重分析/差示扫描量热法（SimultaneousTGA/DSC,STA-499F3,NETZSCH）来确定粗多糖的热力学特性。

以空铝盘作为参考，将干燥的样品（4-5毫克）分别放置在铝盘中。

铝盘以速率为10◦C/min加热从10度C至600◦C，同时不断地用氮气以60毫升/分钟的流速冲洗装置。

记录下每一个过渡阶段的峰值温度（Tp）和结论温度（TC）。

焓（H）是用来表示每一克样品在过渡期间吸收或释放的能量，可以由仪器直接计算和显示出来。

2.5纯化分数

用HWE和USE法得到的粗提取液使用Sevage法脱蛋白8次，然后预先依次使用不同梯度浓度的乙醇（40％和70％）纯化处理。

在5000g下离心15分钟后收集的沉淀物，分别命名为HWEP40，HWEP70，USEP40和USEP70，将它们分别溶解于0.5毫升的去离子水（15毫克/毫升）和加入到葡聚糖凝胶G-100凝胶过滤柱（1.0厘米×30厘米）内。

2.6、红外光谱仪分析

将冷冻干燥的样品与KBr磨成粉。

用尼科莱特傅里叶变换红外（FTIR）光谱仪（FTIR-660此外，JASCO）来进行实验和进行记录，取值范围为400〜4000cm-1处。

2.7、分子量测定

对主要的纯化组分分的分子量测定，通过ShimadzuHPLC装置凝胶渗透色谱（GPC）使用TSK凝胶G2000色谱柱，折光检测器（RID）为2031模式。

用0.9％NaCl溶液在0.5毫升/分钟的流速25摄氏度下洗脱该柱。

用浓度为5.0mg/mL的标准葡聚糖和样品以注入体积20L.通过0.45微米膜过滤。

用不同分子量的葡聚糖制作校准曲线（4320，12,600，60,600，110,000，289,000Da）。

2.8、单糖组成分析

取主要的纯化组分（5毫克）溶解在2毫升的4mol/L的三氟乙酸水溶液（TFA）中，在110度下水解6小时。

通过用甲醇反复蒸馏除去过量的酸。

在50◦C，以0.005mol/L的H2SO4作为流动相，流速为0.5毫升/分钟，进样体积为20uL的条件下在HPX-87H柱（Bio-Rad公司）上对单糖进行分析。

在这项研究中以D-甘露糖，D-半乳糖，D-葡萄糖，L-鼠李糖，L-阿拉伯糖，和l-岩藻糖作为参考。

2.9.1、体外抗氧化活性

羟基自由基清除测定的方法是Bao[14]进行一些修改：

1.0毫升不同浓度的样品（0.05，0.10，0.25，0.5，1.0，1.5，和2.0毫克/毫升）用0.2mmol/L的龙胆紫（1.0毫升），1mmol/L的硫酸亚铁（1.0毫升），0.12％过氧化氢（1.0毫升）和6.0毫升磷酸钠缓冲液（pH4.5）混合30分钟。

测量578nm处的吸光度并记录，作为Ax，用1.0mL水代替样品测吸光度并记录，

作为Ab，1.0毫升的水代替过氧化氢溶液测吸光度记录为A0。

羟自由基的清除效果计算如下：

清除活性（%）=（Ax−Ab）/（A0−Ab）X100

（1）。

抗氧化能力，表示为IC50（将反应混合物中羟自由基清除50％的多糖的量）。

2.9.2、ABTS自由基清除法

ABTS自由基清除活性的测定根据做出一些修改的Yang[15]的方法。

2.5ml,7mMABTS二铵盐与0.5ml15mM的过硫酸钾混合。

存储在黑暗中24小时后，将溶液用蒸馏水稀释，得到在734nm处的吸光度为0.700。

取稀释后的溶液（2mL）向溶液中加入0.1毫升样品溶液（1，2，3，4，5mg/mL）。

然后在20◦C温浴6分钟后将该溶液在734nm处测量吸光度，以去离子水作为空白。

根据下面的公式计算样品的清除活性：

清除活性（%）=（A0−Ax）/A0X100

（2）其中AX代表6分钟后，样品的吸光度，A0代表空白对照的吸光度。

抗氧化剂电位表示为IC50（在反应混合物中需要清除50％的ABTS自由基的多糖的量）。

表1、提取的UAEP和HWEP产量和化学成分

样品

中性糖（%）

糖醛酸（%）

还原糖（%）

蛋白质含量（%）

提取率（%）

UAEP

45.24±1.57

10.31±1.25

1.5±0.60

10.33±0.78

3.77±0.17

HWEP

50.34±1.70

11.37±0.72

Trace

8.26±0.82

3.07±0.14

3、结果与讨论

3.1、USE的提取效率

UAEP和HWEP萃取率和化学成分示于表1。

USEP纯度略低于HWEP。

然而，USEP和HWEP的提取产量分别为3.77±0.17％和3.07±0.14％;因此，USE的提取率比HWE高23％提取时间也从6小时减少到一个半小时。

为了进一步了USE解提取效率较高的原因，SEM的提取残渣图像示于图1。

在所有测试的放大倍率下进行观察其尺寸和形状有显着的差异。

HWE的残留物在低（50×）和高放大倍数（500倍）下出现不规则的小颗粒（图1（a）和（b）段）。

USE的残余物在低（50×）和高放大倍数（500倍）（图1（c）及（d））表现为粘接的紧凑的片材形状。

这种差异可以解释其不同的提取的过程。

超声空化气泡可以诱发冲蚀，在撞击点附近的固-液界面的崩溃[16]，这样就造成了菌丝体更容易被打断和破坏。

裂缝的菌丝体，在超声波随机振动作用下发生碰撞，重新排列，并聚集在提取后的片状形状上。

由于在这过程中激烈的搅拌和摩擦使得界面的接触面积大幅增加，从而得到更好的传质速率和更高的提取效率。

然而，在HWE过程中提取物经受了更温和的扩散力，在原料中不引起显着的变化，从而导致提取过程效率低的情况。

3.2、粗多糖的形态和热力学分析

USEP和HWEP的SEM图像和TGA-DSC曲线示于图2。

可以看出，HWEP显示为一个立体多孔结构，小环和螺旋圈（图2（a））。

虽然USEP的微妙的结构和发生大范围的聚集的原因还不清楚（图2（b））。

USEP和HWEP的TGA和DSC曲线列于图2（c）。

在两个样品中检测到了三个过渡阶段。

在样品被加热时，第一个吸热过程，由于水分的散失使得重量减少7.05％。

在73.4◦CHWEP得到了第一吸热峰，此时的H值为196.3J/g，而当温度达到86.4◦CUSEP具有更高的H值205.3J/g。

第2个放热的过渡阶段主要体重减轻（52.41％），它可能是由于多糖的解聚和氧化的降解反应[17]。

在这个过程中，USEP的Tp和Tc比HWEP的更高，这个转变阶段的ΔH分别为-1934J/g和-1585J/g。

吸热过程的最后阶段，由于样品中的无机材料的分解反应，USEP的Tc和Tp比HWEP要低。

正如报道的那样，多糖结晶区的扩展比例，导致除去水分和降解时的峰值温度和热焓值增加[18,19]。

USEP的热力学以及形态特征的变化，可能是由于多糖通过超声波处理诱导的更紧凑的结构。

3.3、纯化分数

USEP和HWEP用梯度浓度的乙醇（40％和70％）进行了初步纯化。

得到HWEP40HWEP70，USEP40，USEP70再通过的交联葡聚糖G-100柱进一步纯化。

亚组分获得的两种提取方法在葡聚糖凝胶G-100凝胶柱上表现出相似的的分布。

HWEP40USEP40都得到了三个峰，它们分别命名为HWEP40-1，HWEP40-2，HWEP40-3，USEP40-1，USEP40-2分别为USEP40-3（图3）。

HWEP70USEP70获得了两个峰，它们分别被命名为HWEP70-1，HWEP70-2和USEP70-1，USEP70-2，分别（图4）。

USEP的两个主要组分（USEP40-1和USEP70-1）收集作进一步调查。

HWEP40-1和HWEP70-1也被收集和IR红外光谱测试来说明不同提取工艺获得的主要组分是否表现出不同的IR的特征。

图1、HWE残余物在放大系数为50×（a）和500×（b）的SEM图像;USE残余物在放大系数为50×（c）和500×（d）的SEM图像。

表2、USEP40-1和USEP70-1的单糖组合物

图2、HWEP（a）和USEP（b）以倍率30000倍的SEM图像（a）×;USEP和HWEP（c）的TGA-DSC曲线的。

3.4、红外光谱特征

USEP70的USEP40-1-1，HWEP40-1和HWEP70-1的红外光谱显示的多糖的特征吸收峰（图4）。

在3600-3200cm-1处广泛而强烈的峰值是羟基的特征吸收。

一道微弱CH伸缩振动峰出现在约2920cm-1处。

在1665至1660CM-1的相对较强的吸收峰，为C=O基的特征峰。

由图发现1200至1000cm-1处是C-O-C和C-O-H特征吸收范围[20]。

在大约810cm-1处弱的吸收峰表示，所含的多糖β-D-吡喃半乳糖[21]。

与USEP70-1HWEP70-1相比，USEP40-1和HWEP40-1在1746.2cm−1处具有超强C=O吸光度。

由于多糖结构的复杂性，在这里只能确定有限的结构信息。

多糖的详细结构有待通过二维NMR和甲基化分析来进一步研究[22]（图5）。

总的来说，usep40-1和hwep40-1之间的吸收光谱曲线很相似，usep70-1和hwep70-1之间也一样，这表明超声波处理并没有造成多糖的主要组成的改变。

在约1746cm-1处的强吸收峰可用于从USEP70-1中区分USEP40-1。

为进一步的调查，进行usep40-1和usep70-1的分子量、单糖组成的分析。

图3、USEP40和HWEP40的SephadexG-100柱色谱图

USEP70和HWEP70的SephadexG-100柱色谱图

3.5、分子量和纯化组分的单糖组成

GPC分析表明，usep40-1和usep70-1平均分子量分别约61.4kDa和25.1kDa的。

它们的单糖组成列于表2。

结果表明，这两个部分是由甘露糖，葡萄糖，半乳糖，鼠李糖，阿拉伯糖组成的。

甘露糖，半乳糖和葡萄糖是usep40-1的主要单糖成分，而usep70-1主要由甘露糖，葡萄糖，半乳糖，鼠李糖组成的。

图5、usep40-1，usep70-1hwep40-1，和hwep70-1的红外光谱

图6、usep40-1和usep70-1的羟基自由基的清除能力

3.6、体外抗氧化活性

3.6.1、羟基自由基的清除能力

usep40-1和usep70-1的清除羟基自由基的活性的测试结果如表6所示。

自由基清除活性的浓度依赖性在所有被测试的浓度都能观察到。

在所有被测试的浓度中USEP40-1比USEP70-1具有更高的羟自由基清除活性，在浓度为2.0毫克/毫升时自由基清除率最高（91.9％）。

USEP40-1和USEP70的IC50的值为376克/毫升和524克/毫升，羟自由基清除活性均表现出较高的水平。

图7、usep40-1和usep70-1的ABTS自由基清除活性。

3.6.2、ABTS自由基清除活性

对USEP40-1和USEP70-1的ABTS自由基清除活性进行了测试，结果列于图7。

自由基清除活性的浓度依赖性也被观察到。

在所有测试的浓度中USEP70-1比USEP40-1表现出较高的ABTS自由基清除活性，并且在5毫克/毫升的浓度时获得了80.0％的自由基清除率。

USEP70-1和USEP40-1的IC50值分别为1.77毫克/毫升和2.82mg/mL。

USEP40-1和USEP70-1在不同的评价体系的不同的自由基清除活性，可能表明，CCM的多糖在不同的情况下进行着ABTS羟自由基的清除活动，而且其性能受多糖的组成的影响。

4、结论

在这项研究中，进行了从CCM中超声波提取多糖，并与热水浸提法的提取工艺进行比较。

扫描电镜（SEM）和差示扫描量热（DSC）结果表明，USE在粗多糖中形成了一个更紧凑的结构。

（USEP40-1和USEP70-1）的主要纯化组分，得到通过乙醇沉淀和SephadexG-100凝胶柱得到。

在1746cm−1附近USEP40-1和USEP70-1的红外光谱是不同的。

USEP40-1和USEP70的分子量和单糖组成被弄清楚，他们表现出不同的羟基和ABTS自由基的清除活性。

探讨其完整的体制和抗氧化活性的机制需要进一步研究，在体内的生物活性多糖作为功能性食品和潜在的治疗剂开发的目的。

感谢：

这项工作的财政支持中国科学院西部计划的高新项目（KGCX2-YW-509）。