细胞培养与染色体技术教案.docx
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细胞培养与染色体技术教案
细胞生物学技术（细胞培养）
实验课主要内容
1.细胞培养总论
2.细胞培养实验准备
3.胎鼠大脑皮层神经元培养
4.细胞株传代培养
5.细胞计数
6.MTT法检测细胞活力
7.细胞的分裂指数
8.细胞冻存
9.细胞复苏
10.FCM法测定细胞周期
11.真核细胞转染
实验一细胞培养总论
（一）介绍细胞培养的定义
细胞培养（cellculture）是在体外（invitro）模拟体内（invivo）生理环境使从体内取出的细胞生存、生长繁殖的技术方法。
广义的体外培养包括三个层次：
细胞培养、组织培养、器官培养，本课程主要介绍细胞培养。
细胞培养现已成为一种各学科广泛采用的实验技术，利用细胞培养法建立的各种细胞系（cellline）和细胞株（cellstrain）达万种以上。
介绍细胞系（cellline）和细胞株（cellstrain）的概念区别
（二）介绍细胞培养的发展简史
细胞培养技术已有百年历史，
1907年，悬滴培养标志着细胞培养的开始
二十世纪40年代始，大多数培养工作都过渡到用瓶子培养。
培养基由天然动物血浆改进为应用人工合成培养基（或称限定培养基）；促细胞生长物质从胎汁改用动物血清。
与此同时，培养技术方法的革新进展也非常迅速。
二十世纪50年代起，培养操作技术方法、培养容器和培养液三个方面得到很大改进，在卡氏瓶原理的启示下，出现了用试管培养，并设计出多种类型的培养瓶。
1957年Dulbecco等采用胰蛋白酶消化，获得了单层（细胞〕培养（singlelayerculture），单层培养法的出现，对组织培养的发展起了很大的推动作用。
此后单层培养便成了组织培养普遍应用的技术。
用单层培养法得以建立了很多细胞系（cellLine）。
1948年Sanford创建了单细胞分离培养法，应用这一技术可以建立遗传性状相同的克隆细胞株（clone或ce11Strain）。
1951年Pomerat设计了灌流小室，使细胞生活在不断更新的培养液中，便于做显微摄电影和细胞代谢等研究。
自二十世纪50年代末，组织培养技术的应用进入了一个繁盛的阶段。
生物科学和技术科学相互渗透、遗传学和生物化学相互结合的结果，出现了分子遗传学、分子生物学、细胞工程等新兴科学。
这些新科学的形成和发展都与组织培养有密切关系。
当前，组织培养技术已广泛用于生物学和医学研究各个领域。
而且通过应用又促进了组织培养技术的发展。
出现了用各种理化措施诱发出遗传缺欠细胞株、应用细胞杂交瘤技术制备单克隆抗体、用培养细胞检测环境中可疑致癌物、癌基因转染和细胞转化等各种新技术。
组织培养技术不仅是用于研究生命科学理论的重要技术方法，也日益成为生物工程和基因工程的生产手段。
如新的中空纤维培养法一次可培养细胞1.2×1011个，能用于生产多种生物制品。
近年来，供细胞培养用的各种条件，如瓶皿、培养基和血清等都已商品化和系列化，使细胞培养工作方便可行。
低温冷冻技术把已建立的多种细胞系和细胞株长期冻存起来，并建立了统一冻存细胞的细胞库或中心，如美国的ATCC（AmericanTissueCultureCollection）；HGMR（HumanGeneticMutantRepository），CAR（CellAgingRepository）等。
在英国和日本等也有类似的机构。
我国在上海和昆明也建立了小规模储存细胞的实验室。
现在全世界储存细胞的数量已难以计算。
这些设施为开展组织培养技术和应用培养细胞进行研究工作提供了极大的方便。
（三）介绍培养细胞的特点
细胞培养不仅是一种技术，也是一种科学，被用于培养的细胞或组织是非常好的实验对象，具有很多优点，但也有些不足。
优点：
1.能长时间直接观察活细胞的形态结构和生命活动；可用于细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科的研究工作。
2.便于使用摄影、摄像和闭路电视等方法进行记录，能直接观察活细胞变化。
3.可供研究的细胞种类极其广泛，从低等生物到高等动物以及人类；从胚胎到成体；从正常组织到肿瘤细胞，皆可用于培养。
4.便于使用各种不同的技术方法，如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、组织化学、同位素标记等方法观察和研究细胞。
5.培养细胞携带有与体内细胞同等的基因组（Genome），也是分子生物学和基因工程学的研究对象；细胞培养技术已是分子生物学和基因工程的重要组成部分。
6.易于施用物理、化学和生物因素等进行实验研究。
7.可同时提供大量生物性状相似的实验对象，耗资少，比较经济。
8.已成为生物制品、单克隆抗体生产和基因工程制品等的生产手段。
缺点:
组织和细胞离体以后，独立生存在人工培养环境中，即使当前模拟体内技术发展很快，但与体内环境相比，仍有很大差异。
因此在利用培养细胞做实验对象时，不应视为与体内细胞完全一样，不应把实验结果外推至体内，而轻易做出与体内等同的结论。
（四）介绍细胞培养的培养基
除有些特殊需要的细胞培养仍使用天然培养基外，但是绝大多数的体外细胞培养已使用合成培养基。
合成培养基成分丰富、使用方便、重复性好，适用于不同细胞的培养可选用不同配方的合成培养基，主要依文献和实验效果而定。
1．合成培养基（media）的成分主要有：
糖、氨基酸、维生素、促生长因子以及多种其他物质。
（各种均详细分述作用）
2．除了人工合成的营养丰富的培养基之外，在细胞培养中还要添加不同来源和浓度的血清（serum），如胎牛血清、新生小牛血清、马血清、人AB型血清等。
详细阐明血清的作用和存在问题。
因此，在购买血清时特别注意产品批号，最好一次性购买实验所需全部血清，以减少血清对实验的误差。
鉴于上述问题，近十几年来各国都在研究细胞的无血清培养基，取得了很大的进展，现已有数种无血清培养基商品问世。
无血清培养被认为是细胞培养技术发展方向之一。
3．无血清培养基，早在二十世纪50年代，一些细胞生物学家就开始进行无血清细胞培养的研究，设计了NCTC109、135、MB752等成分较为复杂的培养基。
还有一些无血清的特殊培养基MCDB109问世，可培养较多种类的细胞，如人成纤维细胞、肿瘤细胞和淋巴母细胞等。
近年来无血清培养研究获得很大进展，已有各种比较好的配方问世，可用于培养多种细胞，但总的来看尚未达到完全代替血清的程度，因此大多数研究还要使用血清。
介绍无血清培养基的成分，包括：
基础培养基和附加成分。
重点在附加成分中的促贴壁因子、促增殖生长因子。
特别强调，在使用无血清培养基培养细胞时，如需胰酶消化，不能使用血清中的灭活因子来灭活胰酶，而要使用大豆胰蛋白酶抑制剂。
（五）介绍细胞培养的温度、气体和培养介质
1．温度：
培养细胞的最适温度应为取材机体的正常温度，随不同物种不同而异，如哺乳类应为37℃。
培养过程中对温度的要求较严格，不仅要求准，且要求波动要小（不超过±0.5℃）。
注意，细胞对低温的耐受性比高温强。
2．气体：
气体也是细胞生存的必需条件之一，所需气体主要有氧气和二氧化碳。
O2参与三羧酸循环，产生能量供给细胞生长、增殖和合成各种所需成分，多数细胞缺氧不能生存。
一般要把细胞置于95％空气加5％二氧化碳混合气体环境中。
O2含量过高对细胞有害。
CO2是细胞代谢产物，也是细胞所需成分，它的主要作用在于能维持培养基的pH值。
大多数细胞的适宜pH为7.2～7.4，偏离此范围对细胞将产生有害的影响。
各种细胞对pH的要求不完全相同。
原代培养细胞一般对pH的变动耐受差，永生性细胞系和恶性细胞耐力强。
注意，细胞对酸的耐受性比对碱强，在偏酸性环境中更利于生长。
细胞在生长过程中随细胞数量的增多和代谢活动的加强，不断释放CO2，培养基变酸，pH发生变动。
重点讲解磷酸盐缓冲液在调节培养基pH中的作用。
3．培养介质：
常用的培养介质有玻璃、塑料、微载体和饲细胞。
分别讲述它们的优缺点和适用范围。
（六）介绍细胞培养的基本设备
细胞培养过程中涉及的仪器设备很多，有些可以与其他常规实验通用，有些需要特殊添置，如超净工作台、CO2培养箱、水纯化装置、灭菌装置、倒置显微镜等。
分别介绍这些设备的使用特点和要求。
（七）介绍细胞培养的一般过程
1．准备工作：
准备工作对开展细胞培养异常重要，工作量也较大，应给予足够的重视，准备工作中某一环节的疏忽都会导致实验失败或无法进行。
准备工作的内容包括器皿的清洗、干燥与消毒，培养基与其他试剂的配制、分装及灭菌，无菌室或超净台的清洁与消毒，培养箱及其他仪器的检查与调试等。
2．取材：
在无菌环境下从机体取出某种组织细胞（视实验目的而定），经过一定的处理（如消化分散细胞、分离等）后接入培养器血中，这一过程称为取材。
如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程。
机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养。
理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养，实际上幼体组织（尤其是胚胎组织）比成年个体的组织容易培养，分化程度低的组织比分化高的容易培养，肿瘤组织比正常组织容易培养。
取材后应立即处理，尽快培养，因故不能马上培养时，可将组织块切成黄豆般大的小块，置4℃的培养液中保存。
取组织时应严格保持无菌，同时也要避免接触其他的有害物质。
取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌，为减少污染可用抗菌素处理。
3．培养：
将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养。
如系组织块培养，则直接将组织块接入培养器皿底部，几个小时后组织块可贴牢在底部，再加入培养基。
如系细胞培养，一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数，按要求以一定的量（以每毫升细胞数表示）接入培养器皿并直接加入培养基。
细胞进入培养器皿后，立即放入培养箱中，使细胞尽早进入生长状态。
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次，观察的内容包括细胞是否生长良好，形态是否正常，有无污染，培养基的pH是否太酸或太碱（由酚红指示剂指示），此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查。
一般原代培养进入培养后有一段潜伏期（数小时到数十天不等），在潜伏期细胞一般不分裂，但可贴壁和游走。
过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期。
细胞长满瓶底后要进行传代培养，将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养。
每传代一次称为“一代”。
二倍体细胞一般只能传几十代，而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去。
转化细胞可能具有恶性性质，也可能仅有不死性（Immortality）而无恶性。
培养正在生长中的细胞是进行各种生物医学实验的良好材料。
4．冻存及复苏：
为了保存细胞，特别是不易获得的突变型细胞或细胞株，要将细胞冻存。
冻存过程中保护剂的选用、细胞密度、降温速度及复苏时温度、融化速度等都对细胞活力有影响。
（八）培养细胞的细胞生物学特性
1．离体后培养细胞的差别：
细胞离体后，失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响，生活在缺乏动态平衡的相对稳定环境中，日久天长，易发生如下变化：
分化现象减弱；形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡；或发生转化获得不死性，变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系。
因此，培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体，它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能，也有一些不同于体内细胞的性状。
实际上从细胞一旦被置于体外培养后，这种差异就开始发生了。
虽然体外细胞与机体细胞存有差异，但并不是说失去研究的意义，且不论其有许多性状仍与体内相同（如体外培养的心肌细胞仍可博动），只从细胞遗传学（cytogenetics）的角度看，离体细胞仍带有全套的二倍体基因。
细胞在培养中的表现，只不过是相应基因关闭／开启引起的现象，这并非是绝对缺陷。
恰恰相反，在培养的细胞中某些特定功能的丧失，可为该基因的表达与调控提供线索。
体外培养的细胞分化能力并未完全丧失，只是环境的政变，细胞分化的表现和在体内不同。
细胞是否表现分化关键在于是否存在使细胞分化的条件，如Friend细胞（小鼠红白血病细胞）在一定的因素作用下可以合成血红蛋白，血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构，杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体，这些均属于细胞分化行为。
2．体外培养细胞的分型
大多数培养细胞贴附生长，成为贴附型细胞，离体培养的细胞形态标准不同于体内组织学标推，仅按细胞形态大致分成以下四型：
成纤维细胞型，上皮型细胞，游走细胞型，多型细胞型。
分别图示讲述各型特征
少数特殊的细胞呈悬浮生长，称为悬浮型细胞，如某些类型的癌细胞及白血病细胞，胞体呈圆形，不贴于支持物上，这类细胞容易大量繁殖。
（九）培养细胞的生长和增殖过程
体内细胞生长在动态平衡环境中，而组织培养细胞的生存环境是培养瓶、皿或其它容器，生存空间和营养是有限的。
当细胞增殖达到一定密度后，则需要分离出一部分细胞和更新营养液，否则将影响细胞的继续生存，这一过程叫传代（Passage或Subculture）。
每次传代以后，细胞的生长和增殖过程都会受一定的影响。
1．培养细胞生命期（LifeSpanofCultureCells）
所谓培养细胞生命期，是指细胞在培养中持续增殖和生长的时间。
体内组织细胞的生存期与完整机体的死亡衰老基本相一致。
组织和细胞在培养中生命期如何？
这要看细胞的种类、性状和原供体的年龄等情况。
如人胚二倍体成纤维细胞培养，在不冻存和反复传代条件下，可传30～50代，相当于150～300个细胞增殖周期，能维待一年左右的生存时间，最后衰老凋亡（Apoptosis）。
如供体为成体或衰老个体，则生存时间较短；如培养的为其它细胞如肝细胞或肾细胞，生存时间更短，仅能传几代或十几代。
只有当细胞发生遗传性改变，如获永生性或恶性转化时，细胞的生存期才可能发生改变。
正常细胞培养时，不论细胞的种类和供体的年龄如何，在细胞全生存过程中，大致都经历以下三个阶段：
原代培养期、传代期和衰退期。
分别讲解各期特征，并说明原代培养细胞和体内细胞性状相似性大，是检测药物很好的实验对象，为保持二倍体细胞性质，细胞应在初代培养期或传代后早期冻存。
当前世界上常用细胞均在不出十代内冻存，因为反复传代有可能导致细胞失掉二倍体性质或发生转化。
在细胞生命期阶段，少数情况下，在以上三期任何一点（多发生在传代末或衰退期），由于某种因素的影响，细胞可能发生自发转化（SpontaneousTransformation）。
转化的标志之一是细胞可能获得永生性（Immortality）或恶性性（Malignancy）。
细胞永生性也称不死性，即细胞获持久性增殖能力，这样的细胞群体称无限细胞系（InfiniteCellLine），也称连续细胞系（ContinuousCellLine）。
细胞获不死性后，核型大多变成异倍体（Heteroploid）。
细胞转化亦可用人工方法诱发，转化后的细胞也可能具有恶性性质。
细胞永生性和恶性性非同一性状。
2．组织培养细胞一代生存期
所有体外培养细胞，包括初代培养及各种细胞系，当生长达到一定密度后，都需做传代处理。
传代的频率或间隔与培养液的性质、接种细胞数量和细胞增殖速度等有关。
接种细胞数量大、细胞基数大、相同增殖速度条件下，细胞数量增加与饱和速度相对要快（实际上细胞接种数量大时细胞增殖速度比稀少时要快）。
连续细胞系和肿瘤细胞系比初代培养细胞增殖快，培养液中血清含量多时细胞增殖比少时快。
以上情况都会缩短传代时间。
一代时间与细胞世代（Generation）或倍增〔Doubling）、换液时间是不同的，要注意区分；在细胞一代中，细胞能倍增3～6次。
细胞传一代后，一般要经过潜伏期（LatentPhase）、指数增生期（LogarithmicgrowthPhase）和停滞期（StagnatePhase）三个阶段，重点讲解三个阶段的特点。
介绍细胞系或细胞株的概念和建立要求
各种已被命名和经过细胞生物学鉴定的细胞系或细胞株，都是一些形态比较均一、生长增殖比较稳定的和生物性状清楚的细胞群。
因此凡符合上述情况的细胞群也可给以相应的名称，即文献中常称之为已鉴定的细胞（certifiedcells）。
已鉴定的细胞可用于各种实验研究和生产生物制品。
当前世界上已建的各种细胞系（株）已难胜数，我国也建有百种以上，并在不断增长中。
3．体外培养细胞的种类和命名
体外培养细胞的名称，随培养细胞技术的发展和细胞种类的增多而演变，需要注意区分。
初代培养，又称原代培养，即直接从体内取出的细胞、组织和器官进行的第一次的培养物。
一旦已进行传代培养（Subculture）的细胞，便不再称为初代培养，而改称为细胞系。
细胞系，指初代培养物开始第一次传代培养后的细胞。
如细胞系的生存期有限，则称之为有限细胞系（FiniteCellLine）；已获得无限繁殖能力能持续生存的细胞系，称连续细胞系或无限细胞系（InfiniteCellLine）。
区分永生性（或不死性）和致瘤性（或恶性性）的区别。
还有亚系（subline）和亚株（substrain）的区别。
克隆细胞株，从一个经过生物学鉴定的细胞系用单细胞分离培养或通过筛选的方法，由单细胞增殖形成的细胞群，称细胞株（strain）。
由原细胞株进一步分离培养出与原株性状不同的细胞群，亦可称之为亚株（substrain）
二倍体细胞，细胞群染色体数目具有与原供体二倍细胞染色体数相同或基本相同（2n细胞占75％或80％以上）的细胞群，称二倍体细胞培养。
如仅数目相同，而核型不同的即染色体形态有改变者为假二倍体。
二倍体细胞属有限细胞系，但随供体年龄和组织细胞的不同。
遗传缺陷细胞，从有先天遗传缺陷者取材（主要为成纤维细胞）培养的细胞，或用人工方法诱发突变的细胞，都属遗传缺欠细胞。
这类细胞可能具有二倍体核型，也可呈异倍体。
肿瘤细胞系或株，是现有细胞系中最多的一类，多由癌瘤建成，具不死性和异体接种致瘤性。
对已建成的各种细胞系或细胞株习惯上都给以名称，如HeLa：
为供体患者的姓名（来源于宫颈癌）；CHO：
中国地鼠卵巢细胞（ChineseHamsterOvary）；宫-743：
宫颈癌上皮细胞，1974年3月建立；NIH3T3：
美国国立卫生研究所（NationalInstituteofHealth）建立；每3天传代，每次接种3×105细胞／毫升。
（十）介绍建立细胞系（或株）和对于已有细胞系（或株）的鉴定、管理和使用的要求
对于新细胞系或株的建立有一系列的要求，总得来说有以下这些：
1．组织来源：
应说明细胞供体所属物种，来自人体，动物或其它；供体的年龄、性别、取材的器官或组织；如系肿瘤组织，应说明临床病理诊断，组织来源，以及病例号等。
2．细胞生物学检测：
应了解细胞一般和特殊的生物学性状，如细胞的一般形态、特异结构、细胞生长曲线和分裂指数、倍增时间、接种率；特异性，如为腺细胞有否特殊产物包括分泌蛋白或激素等；如为肿瘤细胞，应力求证明细胞确系来源于原肿瘤组织而非其它，并仍保持性性，为此需做软琼脂培养、异体动物接种致瘤性和对正常组织浸润力等实验。
3．培养条件和方法：
各种细胞都有自己比较适应的生存环境，因此应指明使用的培养基、血清种类、用量以及细胞生存的适宜pH等。
对于已建立好的细胞系或株的鉴定、管理和使用也有一系列要求，以美国标准细胞库（AmericanTissueCellCollection，ATCC）为例说明接纳入库细胞标准，如下：
培养简历：
组织来源日期、物种、组织起源、性别、年龄、供体正常或异常健康状态、细胞已传代数等
冻存液：
培养基和防冻液名称
细胞活力：
融解前后细胞接种存活率和生长特性
培养液：
培养基种类和名称（一般要求不含抗生素）、血清来源和含量
细胞形态：
类型，如为上皮或成纤维细胞等，融解后细胞生长特性
核型：
二倍体或多倍体，标记染色体的有无
无污染检测：
包括细菌、真菌、支原体、原虫和病毒等
物种检测：
检测同工酶，主要为G6PD和LDH，以证明细胞有否交叉污染以及反转录酶检测
免疫检测：
一两种血清学检测
细胞建立者：
建立者姓名；检测者姓名
实验二原代培养
一、原理所谓原代培养就是将动物机体的各种组织从机体中取出，经各种酶（常用胰蛋白酶）、螯合剂（常用EDTA）或机械方法处理，分散成单细胞，置合适的培养基中培养，使细胞得以生存、生长和繁殖。
理论上讲，机体所有细胞组织都可以离体培养，但是取材机体越年幼细胞生存效果越好，所以我们选用胎鼠。
二、仪器、材料及试剂仪器：
培养箱（调整至37℃），培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱（37℃）材料：
胎鼠或新生鼠试剂：
DMEM培养基（含20%小牛血清），0.25%胰酶，Hank’s液，碘酒三、操作步骤
（一）胰酶消化法1、器材：
将孕鼠或新生小鼠拉颈椎致死，置75%酒精泡2—3秒钟（时间不能过长、以免酒精从口和肛门浸入体内）再用碘酒消毒腹部，取胎鼠带入超净台内（或将新生小鼠在超净台内）解剖取肝脏（或大脑皮层等），置平皿中。
2、用Hank’s液洗涤三次，并剔除脂肪，结缔组织，血液等杂物。
3、用手术剪将肝脏剪成小块（1mm2），再用Hank’s液洗三次，转移至小青霉素瓶中。
4、视组织块量加入5—6倍的0.25%胰酶液，37℃中消化20—40分钟，每隔5分钟振荡一次，或用吸管吹打一次，使细胞分离。
5、加入3—5ml培养液以终止胰酶消化作用（或加入胰酶抑制剂）。
6、静置5—10分钟，使未分散的组织块下沉，取悬液加入到离心管中。
7、1000rpm，离心10分钟，弃上清液。
8、加入Hank’s液5ml，冲散细胞，再离心一次，弃上清液。
9、加入培养液l—2ml（视细胞量），血球计数板计数。
10、将细胞调整到5×105/ml左右，转移至25ml细胞培养瓶中，37℃下培养。
上述消化分离的方法是最基本的方法，在该方法的基础上，可进一步分离不同细胞。
细胞分离的方法各实验室不同，所采用的消化酶也不相同（如胶原酶，透明质酶等）。
（二）组织块直接培养法自上方法第3步后，将组织块转移到培养瓶，贴附与瓶底面。
翻转瓶底朝上，将培养液加至瓶中，培养液勿接触组织块。
入37℃静置3—5小时，轻轻翻转培养瓶，使组织浸入培养液中（勿使组织漂起），37℃继续培养。
四、注意事项1、自取材开始，保持所有组织细胞处于无菌条件。
细胞计数可在有菌环境中进行。
2、在超净台中，组织细胞、培养液等不能暴露过久，以免溶液蒸发。
3、凡在超净台外操作的步骤，各器皿需用盖子或橡皮塞，以防止细菌落入。
五、无菌操作的几个注意事项1、操作前要洗手，进入超净台后手要用75%酒精或0.2%新洁尔灭擦试。
试剂等瓶口也要擦试。
2、点燃酒精灯，操作在火焰附近进行，耐热物品要经常在火焰上烧灼，金属器械烧灼时间不能太长，以免退火，并冷却后才能夹取组织，吸取过营养液的用具不能再烧灼，以免烧焦形成碳膜。
3、操作动作要准确敏捷，但又不能太快，以防空气流动，增加污染机会。
4、不能用手触已消毒器皿的工作部分，工作台面上用品要布局合理。
5、瓶子开口后要尽量保持45°斜位。
6、吸溶液的吸管等不能混用。
实验三细胞株传代培养
一、原理细胞在培养瓶长成致密单层后，已基本上饱和，为使细胞能继续生长，同时也将细胞数量扩大，就必须进行传代（再培养）。
传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。
同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。
悬浮型细胞直接分瓶就可以，而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。
二、材料和试剂1、细胞：
贴壁细胞株C6（脑胶质瘤细胞株）2、试剂：
0.25％胰酶、DMEM培养基（含10％小牛血清）3、仪器和器材：
倒置显微镜，培养箱、培养瓶、吸管、废液缸等三、操作步骤1、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。
2、加入0.5—1ml0.25％胰酶溶液，使瓶底细胞都浸入溶液中。
3、瓶口塞好橡皮塞，放在倒置镜下观察细胞。
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