酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别4学时.doc

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实验一 酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别

预习内容：

1.光学显微镜的使用（参见周德庆，微生物学实验教程第3版，23-27页）

2.酵母菌的美蓝染色观察（参见周德庆，微生物学实验教程第3版，91-95页）

预习思考题：

1.随着物镜放大倍数的增加，视野的亮度是增强还是减弱？

应如何调节？

视野范围是如何变化的？

2.制作水浸片时如何避免产生气泡？

3.影响活菌数目的因素有哪些？

染液浓度、染色时间及染色时的pH等因素对死活细胞数目比例有什么影响？

4.如何测定酵母菌死亡率？

简述其原理。

5.标本片上的某一物象，第一次看到后如何再次找到它?

一、实验目的与要求

1.了解普通光学显微镜的构造及原理，正确掌握使用显微镜的方法；

2.观察酵母菌的形态及出芽生殖方式；

3.学习区分酵母菌死活细胞的实验方法；

4.掌握酵母菌的一般形态特征及其与细菌的区别。

二、实验原理

1.酵母菌

酵母菌是不运动的单细胞真核微生物，其大小通常比常见细菌大几倍甚至十几倍，不必染色即可用显微镜观察其形态。

但由于细胞个体大，采用涂片的方法制片有可能损伤细胞，一般通过美蓝染液水浸片或水-碘液浸片法来观察酵母细胞。

大多数酵母以出芽方式进行无性繁殖，有的分裂繁殖；有性繁殖是通过接合产生子囊孢子。

本实验通过美蓝染液水浸片和水一碘液水浸片来观察酵母的形态和出芽生殖方式，并对酵母细胞进行死活染色鉴别。

2.美蓝染液

美蓝是一种无毒性的染料，它的氧化型呈蓝色，还原型无色。

用美蓝对酵母活细胞染色时，由于细胞的新陈代谢作用，细胞内具有较强的还原能力，能使美蓝由蓝色的氧化型变为无色的还原型，而对代谢作用微弱或死细胞，无此还原能力或还原能力极弱，而被美蓝染成蓝色或淡蓝色。

因此，不仅用此法可观察酵母细胞形态，也可用来鉴别酵母菌的死细胞和活细胞。

图1：

酵母菌美蓝浸片观察3min（10×40）图2：

酵母菌美蓝浸片观察30min（10×40）

三、实验设备及材料

1.菌种 酿酒酵母（Saccharomycescerevisiae）或卡尔酵母（Saccharomycescalsbergensis）培养2天左右的豆芽汁液体培养物（需稀释）。

2.溶液或试剂：

0.1%和0.05%吕氏碱性美蓝溶液（或0.01%美蓝水溶液），革兰氏染色用碘液等。

3．器材：

显微镜，擦镜纸，吸水纸，盖玻片、酒精灯、接种环、镊子、胶头滴管、小烧杯、洗瓶等等。

四、实验步骤与内容

1．美蓝浸片的观察

（1）在载玻片中央加一滴0.1%吕氏碱性美蓝染色液，然后按无菌操作接种环挑取少量酵母菌放在染液中，并用接种环将其混合均匀，酒精灯上灼烧清洗接种环。

注：

染液不宜过多或过少，否则，在盖上盖玻片时，菌液会溢出或出现大量气泡。

用接种环将菌体与染液混合时，不要剧烈涂抹，以免破坏细胞。

（2）用镊子取一块盖玻片，先将一边与菌液接触，然后慢慢将盖玻片放下使其盖在菌液上，用吸水纸吸取多余的液体。

注：

盖玻片不宜平着放，以免产生气泡。

（3）将制片放置约3min后镜检，先用低倍镜然后用高倍镜观察酵母的形态和出芽情况，并根据颜色来区别死活细胞，绘图。

（4）染色约0.5h后再次观察并绘图，注意死细胞数量是否增加。

（5）用0.05%吕氏碱性美蓝染色液重复上述操作。

（6）清洗载玻片，整理实验台。

2．水-碘液浸片的观察（选做）

在载玻片中央滴一滴革兰氏染色用碘液（卢戈氏碘液），然后在其上加3小滴水，取少许酵母菌苔放在水-碘液中混匀，盖上盖玻片后镜检。

五、实验结果

绘图说明你所观察到的酵母菌的形态特征、出芽情况及死活细胞数量变化。

图1：

酵母菌0.1%美蓝浸片观察3min（10×10）图2：

酵母菌0.1%美蓝浸片观察3min（10×40）

图3：

酵母菌0.1%美蓝浸片观察30min（10×40）图4：

酵母菌0.05%美蓝浸片观察3min（10×10）

图5：

酵母菌0.05%美蓝浸片观察3min（10×10）图6：

酵母菌0.05%美蓝浸片观察30min（10×40）

注意：

显微镜的放大倍数=目镜放大倍数×物镜放大倍数。

物镜倍数（低倍镜10倍，高倍镜40倍，油镜100倍）

六、思考题

1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同，对酵母菌死细胞数量有何影响？

试分析其原因。

美蓝浓度越大，作用时间越长则视野中死菌比例越大。

原因：

要点一：

渗透压增大→细胞失水；要点二：

还原力有限，浓度高或时间较长都会对细胞结构造成破坏。

2.在显微镜下，酵母菌有哪些突出的特征区别于一般细菌？

要点：

（1）细胞大小及形态；

（2）液泡；（3）出芽生殖；（4）鞭毛；（5）细胞核及细胞器

实验一酵母菌的形态观察及死活细胞鉴别练习题

一、名词解释

1.假菌丝：

酵母生长旺盛时，出芽形成的芽细胞尚未脱离母细胞又长出了新芽，容易形成成串的细胞。

如果各细胞之间连接处面积小于细胞直径，形成的这种藕节状的细胞串称为假菌丝。

二、填空题

1.高倍镜头的数值孔径通常为，放大倍数为。

2.油镜头的数值孔径通常为，放大倍数为。

3.低倍镜头的数值孔径通常是，放大倍数为。

4.使用显微镜低倍镜观察时，聚光器应该，使用显微镜高倍镜观察时，聚光器应该适当。

5.显微镜的微动螺旋每转一圈升降距离为。

6.显微镜的光学系统由、、和组成。

7.显微镜的机械部分包括等九部分组成。

8.简单染色的操作程序是

9．酵母菌通过0.1%美兰染色1~2分钟后，活细胞呈色，死细胞呈色；

10.在其它条件相同的情况下，物镜放大倍数越大，焦距，其工作距离，所需光量。

11.用日光灯作光源时，通常用反光镜，用自然光作光源时，通常用反光镜。

12.显微镜的倍数越大，焦深越，调焦应该越。

三、选择题

1.对光学显微镜观察效果影响最大的是：

（）

A目镜B物镜C聚光器D总放大倍数

2.目镜头上的"K"字母表示：

（C）

A.广视野目镜B.惠更斯目镜C.补偿目镜；

3.目镜头上的"P"字母表示：

（A）

A.平场目镜B.广视野目镜C.平场补偿目镜

4.物镜头上的"PL"字母表示：

（A）

A.正低相差物镜B.正高相差物镜C.负高相差物镜。

5.物镜头上的"UVL"字母表示：

（C）

A.无荧光物镜B.照相物镜C.相差物镜。

6.镜头上标有"对C"字母的镜头是：

（A）

A.相差调整望远镜B.摄影目镜C.相差目镜

7.物镜头上的"APO"字母代表（B）

A.消色差物镜B.复消色差物镜C.半消色差物镜

8．物镜头上的"Ach"字母表示（A）

A.平场物镜B.超平场物镜C.消色差物镜

9．物镜头上的“NH”字母表示：

（C）

A.正相差物镜B.负相差物镜C.负高相差物镜

10．物镜头上的“0.17”表示：

（A）

A.要求的盖玻片厚度B.要求的载玻片厚度C.镜头浸油的深度

11．镜头上标有“NK"字母的镜头是（A）

A.照相目镜B.荧光目镜C.相差目镜

12．目镜头上的“PK”字母表示（C）

A.平场目镜B.补偿目镜C.平场补偿目镜

13．物镜头上的"Splan"字母表示（A）

A.超平场物镜B.平场物镜C.消色差物镜

14．物镜头上的"SplanApo"表示（A）

A.超平场复消色差物镜B.超平场半消色差物镜C.超平场物镜

15.物镜头上的"Planapo"表示（C）

A.超平场物镜B.平场物镜C.平场复消色差物镜

16．物镜头上的"Plan"字母表示（A）

A.平场物镜B.消色差物镜C.超平场物镜

17．目镜头上的"W"字母表示（C）

A.广视野高眼点补偿目镜B.高眼点目镜C.广视野目镜

18．目镜头上的"SWK"字母表示（A）

A.超广视野目镜B.高眼点补偿目镜C.平场补偿目镜

19.目镜头上的"WHK"字母表示（B）

A.超广视野目镜B.广视野高眼点目镜C.平场补偿目镜

20.物镜头上的"错.L"字母表示（B）

A.消色差物镜B.半消色差物镜C.复消色差物镜

四、判断是非题

1.显微镜的放大倍数越高，其视野越大。

（）

2.浸油的油镜头可用软的卫生纸擦净。

（）

3.为了节省时间，可直接在染色涂片上滴加香柏油后，直接用油镜观察。

（）

4.使用油镜的正确操作步骤是：

低倍镜观察→高倍镜观察→转出高倍镜头，滴加香柏油后用油镜观察。

（）

5.在擦拭显微镜镜头时，应向一个方向擦拭。

（）

6.显微镜镜头的放大倍数越大,它的数值孔径值越大,其镜口角也越大。

（）

7.用油镜镜检时应将聚光器升至最高。

（）

8.使用高倍镜时，可将聚光器升至最高。

（）

9.显微镜的放大倍数愈高，其视野面积愈大。

（）

10.光学显微镜的分辨率与介质折射率有关，由于香柏油的介质折射率（约1.5）高于空气（1.0）。

因此使用油镜的观察效果好于高倍镜，目前科学家正在寻找折射率比香柏油更高的介质以改进光学显微镜的观察效果。

（）

五．问答题

1.吕氏碱性美蓝染液浓度和作用时间的不同对酵母菌死细胞数量有何影响?

试分析其原因。

美蓝浓度越大，作用时间越长则视野中死菌比例越大。

原因：

要点一：

渗透压增大→细胞失水；要点二：

还原力有限，浓度高或时间较长都会对细胞结构造成破坏。

2.显微镜下观察酵母菌的个体形态特征与细菌个体形态特征有何不同?

要点：

（1）细胞大小及形态；

（2）液泡；（3）出芽生殖；（4）鞭毛；（5）细胞核及细胞器

3.标本片上的某一物象，第一次看到后如何再次找到它?

4.简述酵母菌死亡率测定的原理。

答：

死亡率测定的原理：

活的微生物，由于不停的新陈代谢，使细胞内氧化还原值低，且还原能力强。

当某种无毒的染料进入活细胞后，可以被还原脱色；当染料进入死细胞后，这些细胞因无还原能力或还原能力差而被着色。

在中性和弱酸性条件下，活的细胞原生质不能被染色剂着色，若着色则表示细胞已经死亡，故可以此来区分活菌和死菌。

方法：

取0.05%美蓝液一滴，置载玻片中央，然后取酵母液少许加入美蓝液中混匀，染色2~3分钟，加盖片，于高倍镜下进行观察，并计数已变蓝的细胞（可计5~6个视野的细胞总数）。

计算公式：