油用牡丹凤丹白中SAD基因的克隆.docx

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油用牡丹凤丹白中SAD基因的克隆

油用牡丹“凤丹白”中SAD基因的克隆

摘要

牡丹种子产量高，含油量高达27%，且籽油中含有大量的不饱和脂肪酸（>90%），其中油酸约占21%，亚油酸（ω-6脂肪酸）约占26%，α-亚麻酸（ω-3脂肪酸）高达45%。

牡丹籽油可以作为一种可持续利用的食用油新资源。

尽管如此，大多数的牡丹研究者都致力于牡丹的花芽发育、休眠、二次开花以及切花保鲜等研究，而对不饱和脂肪酸合成机制的研究才刚刚起步。

油用牡丹的优良品种“凤丹白”生长繁殖快，且种子含油率和亚麻酸含量均较高。

因此，本研究以牡丹“凤丹白”为材料，提取了牡丹不同发育期种子的RNA，经DNase消化后逆转录合成cDNA。

根据文献报道的牡丹种子转录组序列设计引物，以种子cDNA为模板，克隆了SAD基因并测序鉴定。

本论文的研究结果将为研究油用牡丹不饱和酸合成的分子机理奠定了基础。

关键词：

油用牡丹，凤丹白，SAD基因，克隆

CloningofSADgenefrompeony"FengDanBai"inoil

ABSTRACT

Peonyhighseedyield,oilcontentofupto27%andoilcontainingalargeamountofunsaturatedfattyacids（90%）,whichaccountsforabout21%ofoleicacid,linoleicacid（omega-6fattyacid）accountedforabout26%,alphalinolenicacid（omega-3fattyacids）ashighas45%.Peonyseedoilcanbeusedasanewresourceforsustainableutilizationofedibleoil.Inspiteofthis,mostofthepeonyresearchersaredevotedtothestudyoftheflowerbuddevelopment,dormancy,thetwofloweringandthepreservationofcutflowers,andthestudyonthemechanismofthesynthesisofunsaturatedfattyacidsisjuststarted.Oilwithfinevarietiesofpeony"FengDanBai"fastgrowthandreproductionandseedoilcontentandlinolenicacidcontentwerehigher.

Therefore,theresearchtopeony"FengDanBai"asthematerialextractedRNAofpeonyseedsatdifferentdevelopmentalstages,theDNasedigestedcDNAwassynthesizedbyreversetranscription.Accordingtothereportofthetreepeonyseedtranscriptiongroup,theprimersweredesigned,theSADgenewasclonedandsequencedandidentifiedwiththeseedcDNAasthetemplate.Theresearchresultsofthispaperwilllaythefoundationforthestudyofthemolecularmechanismofthesynthesisofunsaturatedacidinoil.

KEYWORDS:

OilWithPeony，FengDanBai，SADgene，Clone

目　录

前　言1

第1章综述2

1.1油用牡丹“凤丹白”的概述2

1.1.1油用牡丹（PaeoniasuffruticosaAndr）2

1.1.2凤丹白2

1.1.3牡丹籽油3

1.1.4牡丹籽油提取工艺的研究3

1.1.5油用牡丹的产业发展4

1.2脂肪酸的简介4

1.2.1脂肪酸4

1.2.2脂肪酸的生理功能5

1.2.3多不饱和脂肪酸5

1.2.4多不饱和脂肪酸的来源6

1.3植物中脂肪酸的合成途径6

1.4脂肪酸脱氢酶8

1.5脂肪酸脱氢酶基因的研究现状9

第2章实验材料与方法10

2.1实验材料10

2.1.1菌株和载体10

2.1.2植物材料10

2.1.3试剂和药品10

2.1.4仪器和设备12

2.1.5培养基及溶液13

2.2实验方法14

2.2.1引物设计14

2.2.2CTAB-LiCl法提取RNA14

2.2.3DNase消化RNA15

2.2.4逆转录成CDNA并按照cDNA的PCR扩增体系进行基因克隆16

2.2.5载体的连接16

2.2.6大肠杆菌感受态的制备和转化16

2.2.7琼脂糖凝胶电泳16

2.2.8PCR产物的回收与纯化17

第3章实验结果与分析18

3.1“凤丹白”中SAD基因的克隆18

3.1.1“凤丹白”种子中RNA的提取和质量分析18

3.1.2目的基因的克隆18

3.1.3菌落PCR的鉴定19

3.2目的基因测序结果20

3.2.1SAD基因序列20

结　论21

谢辞22

参考文献23

前　言

所谓“有需求就有市场”，近年来中国食用油消费量显著增加，从1996年的人均植物油消费量8.2kg上升到2012年的20.1kg，十六年里植物油消费量增加了2.5倍[1]。

随着我国城市化进程的进一步加快，预计中国食用植物油消费总量还会持续快速增加。

实际上，就全世界围来看，食用植物油的总体仍处于一种供不应求的局面。

全球植物油的消费总量由2002年的9576万吨增加到2012年的15723万吨，增加了6147万吨，增长率为64.2%[1]。

目前，国内主要以种植草本油料作物为主，在土地资源有限的情况下，种植面积和产量的增长空间较小。

因此，发展新的高产优质油料作物势在必行。

近年研究发现，牡丹籽的含油率可达到24.12％~37.83％，牡丹籽油的主要成分为亚麻酸、油酸、亚油酸等17种脂肪酸，其中亚麻酸含量可以达到31.56％~66.85％[2]。

因此牡丹有望成为一种具有中国特色的潜在油料作物，从而使牡丹成为集观赏、药用和油用为一身的重要经济作物。

其中“凤丹白”牡丹极具开发牡丹籽油价值。

本研究将通过分子生物学相关技术，对油用牡丹“凤丹白”的油脂代谢途径的相关基因（SAD基因）展开探究。

第1章综述

1.1油用牡丹“凤丹白”的概述

1.1.1油用牡丹（PaeoniasuffruticosaAndr）

油用牡丹是一种多年生落叶灌木植物，是中国传统名贵花卉，观赏价值和药用价值极高。

牡丹被誉为“国花”，属于芍药科芍药属牡丹组。

其根部（丹皮）是中国传统中药材；而牡丹籽油富α-亚麻酸。

亚麻酸是ω-3系列不饱和脂肪酸，是二十二碳六烯酸（DHA，俗称脑黄金）和二十碳五烯酸（EPA，是鱼油的主要成分）的前体物质，也是一种人体必需脂肪酸，它具有增强记忆力、提高智力、降低血脂、促进胰岛素分泌、预防心肌梗塞等多种功效[1]。

我国卫生部于2011年3月正式批准牡丹籽油为新资源食品，牡丹由此有望成为一种集观赏价值、药用价值和油用价值为一身的油料植物资源，极富开发价值[2]。

与其他油料作物相比较，油用牡丹产油量高，其含油率高达22%以上；而且牡丹籽油富含钙、锌、氨基酸以及多种不饱和脂肪酸等等[1]。

其中不饱和脂肪酸的含量高达92%以上（α-亚麻酸占42%）[2]；甚至不饱和脂肪酸的含量等营养价值优于被誉为“液体黄金”的橄榄油。

目前用于生产中的油用牡丹主要有“凤丹”和“紫斑”两个品种群，本毕业设计主要研究“凤丹白”。

1.1.2凤丹白

“凤丹”属于江南牡丹品种群，最适宜生长在长江流域，但全国有20多个省市地区适合栽植。

该系列的主要特点是开花量大、结籽多、生存适应性强。

其中“凤丹白”极具代表性，花瓣是白色，为单瓣层花，花瓣少，花径11~13cm，花态直上，花期一周左右，群体花开一个月左右，雌蕊和雄蕊无瓣化现象。

凤丹白植株的根系发达，尤其是主根比较粗壮。

其种子含有大量不饱和脂肪酸，油用价值极高[3]。

1.1.3牡丹籽油

2009年，由多家权威油脂部门共同鉴定发现，牡丹籽油中超过90%的是不饱和脂肪酸，在牡丹籽油的不饱和脂肪酸中，有一种多不饱和脂肪酸——亚麻酸，属于ω-3系列脂肪酸，该脂肪酸含量约占其多不饱和脂肪酸含量的一半，是橄榄油中亚麻酸含量的140倍之多。

截至目前，人们研究发现，与其他食用的植物油相比，牡丹籽油是最适合人类食用的植物油，它不仅仅营养价值奇高，结构成分也比其他食用油更为合理。

而且，除了在食用方面的价值，牡丹籽油在人类医疗保健方面同样具有重要价值——增强记忆力、提高智力、降低血脂、促进胰岛素分泌、预防心肌梗塞等，因此牡丹籽油被称做世界上营养价值最好的植物油[3]。

牡丹籽油中含有一种特殊的基因，这种基因能够在某种程度上让人的寿命延长。

亚油酸是细胞的重要成分，亚油酸在细胞内线粒体和细胞膜上磷脂合成过程中发挥着至关重要的作用，人体内的脂质代谢和亚油酸的联系十分密切。

例如：

人体内的胆固醇要想进行正常的代谢反应，就必须与脂肪酸结合后才能在机体中发生正常代谢；假如缺乏亚油酸就可能会导致胆固醇转送无法正常进行，而在人体内大量积累，导致疾病。

而我们所研究的牡丹籽油中就含有大量亚油酸（约占23.34%），能够补充人体所缺乏的亚油酸，以维持人体代谢反应正常进行。

在健康保健方面，α-亚麻酸对于人类抗衰有着十分重要的作用，食用α-亚麻酸之后，体内的谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）及超氧化物歧化酶（SOD）活性都会明显增加，相反的是丙二醛（MDA）的生成则减少。

许多科学家研究证明：

癌症、心脑血管疾病是由于人体吸收太多的反式脂肪酸或者是人体存在大量的饱和脂肪酸，如果增加α-亚麻酸的摄入量，能够很有效的改变很多疾病的发生。

α-亚麻酸具有调节血脂、预防心脑血管病、降血脂等功效。

[4]

1.1.4牡丹籽油提取工艺的研究

目前，最为常见的提取方法是通过超临界CO2萃取工艺提取牡丹籽油。

其中，通过单因素和正交试验法对萃取过程中的萃取温度、压力、时间及CO2流量因素等进行优化，获得的油脂萃取率最高（30.7%）。

采用提取时间较短、工艺更为简便的超声波和微波辅助提取法出油率分别为24.89%和24.52%[3]。

另外，在牡丹籽油的精炼方面采用活性白土二次脱色效果较好，并且可降低氧化物和磷脂的含量。

采用1,1-二苯基-2-三硝基苯肼法和亚铁离子诱导的过氧化体系法，以油酸为对照，研究压榨法和超临界CO2萃取法两种工艺提取的牡丹籽油分别清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基和抗脂质过氧化能力的差异。

相关结果表明，超临界油清除1,1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基的能力明显高于压榨油，而经亚铁离子诱导的脂质过氧化程度则低于压榨油，说明超临界CO2提取的牡丹籽油品质优于压榨油[5]。

1.1.5油用牡丹的产业发展

目前，我国油用牡丹产业仍处于起步阶段，主要的油用牡丹种植地仅仅分布在河南、山东和安徽等地区。

究其根本，油用牡丹的大规模开发需要国家和政府的大力支持。

油用牡丹籽含油量高，油质好，易于种植且占用耕地少，因此建议政府能够尽早出台相关优惠政策，鼓励油用牡丹的规模化开发。

油用牡丹无论在品种选择、栽培方式或是生产经营方面都与传统牡丹产业有着很大的不同。

因此，如何探索出适合我国油用牡丹产业发展的新思路和新模式，是产业发展中亟待攻克的课题[2]。

目前，油用牡丹精深加工和综合利用技术水平仍处于初期阶段，急需加强科技和资金支撑力度，加快相关技术流程的深入开发和完善。

与此同时，社会各界也应该对油用牡丹产业予以高度重视，尤其是农户和相关企业要及早认识到油用牡丹产业的发展前景和意义。

1.2脂肪酸的简介

1.2.1脂肪酸

脂肪酸（FA,FattyAcid）是一种具有长烃链的羧酸，是结构十分简单的脂，是多种复杂的脂的组成成分。

脂肪酸分为两种：

饱和脂肪酸和不饱和脂肪酸，饱和脂肪酸的一般通式为C（n）H（2n+1）COOH。

一般情况下级别高的脂肪酸是蜡状固体且没有气味，而级别低的脂肪酸为无色液体，有刺激性气味。

脂肪酸可发生氧化还原反应（存在大量氧气时），分解为CO2和H2O，并且释放出大量能量，所以脂肪酸是机体主要能量来源之一[6]。

脂肪酸是一种羧酸化合物的总称，它是水和天然油脂在一起分解而成的化合物，该化合物属于脂肪族。

脂肪酸与氨基酸、蛋白质、维生素、矿物质一样，也是人体不可缺少的营养素[6]。

脂肪酸是组成磷脂、糖脂等的重要成分，它是由碳、氢、氧三种元素组成而成的一类化合物。

脂肪酸通常以酯的形式存在于各种脂质中，生物体内的脂肪酸很大一部分是以结合的形式存在，所以游离形式的脂肪酸在自然界是很罕见的。

动物自身能够合成所需的饱和脂肪酸和只含有1个双键的单不饱和脂肪酸，如油酸，含有2个或2个以上双键的多不饱和脂肪酸则主要是从植物、动物以及低等生物中获取[7]，故后者称为必需脂肪酸，其中亚麻酸和亚油酸最重要。

花生四烯酸是人体中含量最大、分布最的不饱和脂肪酸，是一种人体必须的重要脂肪酸，是合成人体前列腺素的前提物质，在生理和药理方面，具有非常重要的作用[7]。

1.2.2脂肪酸的生理功能

脂肪酸对生物体具备十分重要的生理性能，是生物体的组成部分。

脂肪酸除了是细胞膜脂的主要成分外，还是一些信号分子的前提物质，能和其他物质结合在一起分布在细胞的表面，减少机体的热量散失、保护机体免受机械损伤[16]。

近些研究发现脂肪酸在植物的各种抗病过程中发挥着非常重要的作用，脂肪酸及其衍生物不只是参与植物的一些系统免疫和基础免疫，也会参与植物的经典免疫，比如抗病基因（R基因）介导的一些免疫抗病过程[17]。

脂肪酸与植物的抗寒性也密切相关。

研究发现细胞膜的稳定对于植物抵抗低温环境的伤害具有决定性作用，低温情况下，细胞膜的稳定性主要取决于细胞膜上脂肪酸的不饱和性，其不饱和度越高，稳定性越强，抗寒性也越强[18]。

1.2.3多不饱和脂肪酸

多不饱和脂肪酸通常分为ω-3和ω-6两种类型，且多不饱和脂肪酸对人体的健康有很重要的作用。

其中ω-3类的多不饱和脂肪酸，例如DHA、EPA等是对细胞膜的磷脂中不可或缺的组成部分，它们能够保持生物细胞膜的通透性和流动性[7]。

ω-3类脂肪酸能够促进心血管健全，因为这一类型的脂肪酸能够降低血液中的低密度脂蛋白中的不良胆固醇和甘油三酯的量，同时能够提升高密度脂蛋白中良性胆固醇的量；使血管更健康且有弹性。

其次还具有消炎作用，能够减轻肿痛，舒解关节不适的症状。

DHA是ω-3类多不饱和脂肪酸的一种。

DHA是构成脑细胞膜的重要成分。

它能够使化学信息顺利在脑细胞之间传送，使之有效率的进行沟通。

经常食用ω-3类多不饱和脂肪酸能够增强学习能力，记忆力和专注力，还能够舒解压力。

此外，它还具有消除偏头痛，降血糖预防糖尿病的功能[6]。

ω-6类型的多不饱和脂肪酸也能够促进生长发育。

哺乳动物中ω-6类多不饱和脂肪酸含量比较多一些，但是ω-3类的多不饱和脂肪酸的含量很少。

目前消耗的多不饱和脂肪酸中ω-6类和ω-3类的20多倍，而ω-6类和ω-3类脂肪酸为4:

1比例摄入是人体健康所必需的[8]。

1.2.4多不饱和脂肪酸的来源

通常情况下，人体通过日常饮食补充多不饱和脂肪酸，多不饱和脂肪酸在人体内经过一系列的生化反应，在多种酶的作用下衍生出DHA、EPA、DPA等。

但是人体自身合成这些物质的效率极低，只能从食物中直接获取。

主要来源于肉类、蛋类和奶类，还有深海鱼类[6]。

如今随着基因工程的发展，还有一种新的手段——通过基因工程使藻类生产多不饱和脂肪酸。

生物体内存在着大量的不饱和脂肪酸，如软脂酸、油酸、亚油酸、亚麻酸等，它们都是由饱和脂肪酸经过去饱和作用形成的。

动物体内最常见的两种不饱和脂肪酸是软脂酸和油酸，它们都是在Δ9位（C9,10）有一个双键，这个不饱和双键是在脂酰-CoA去饱和酶（fattyacyl-CoAdesaturase）催化下，经氧化反应引入的[7]。

但是哺乳动物体内缺少能在第九位碳原子以外引入双键的酶，因此不能合成亚油酸和亚麻酸，必须直接从食物中摄取，因此这些脂肪酸对哺乳动物和人类是必需脂肪酸。

1.3植物中脂肪酸的合成途径

植物中脂肪酸的合成途径比较复杂，其中涉及到乙酰-CoA羧化酶、脂肪酸合成酶、脂肪酸去饱和酶和脂肪酸延长酶等酶类。

尤其是近年，进行了大量关于脂肪酸的生物合成途径的研究，对脂肪酸的合成规律有了初步的认识[9]。

植物的脂肪酸合成是在叶绿体和前质体中进行的。

此途径通过两个酶系统催化可将乙酰-CoA转变成长链脂肪酸，即乙酰-CoA羧化酶和脂肪酸合酶复合体。

整个反应过程可分为三个阶段：

乙酰-CoA的穿梭、乙酰-CoA的羧化以及脂肪酸链的合成。

该途径合成的主要产物为十六碳的软脂酸。

而大部分的脂肪酸合成是在细胞质中，在脂肪酸的从头合成过程中，参与脂肪酸链的二碳单位的直接供体是乙酰-CoA的羧化产物（丙二酸单酰-CoA），脂肪酸合成起始于乙酰-CoA转化成丙二酸单酰-CoA，催化这一反应过程的酶为乙酰丙二酸单酰-CoA羧化酶，羧化酶反应是脂肪酸合成至关重要的一步。

以乙酰-CoA为基础，通过乙酰辅酶A羧化酶的作用，在ATP的分解过程中与CO2结合，产生丙二酸单酰-CoA；乙酰-CoA和丙二酸单酰-CoA形成后，在脂肪酸合酶复合体的作用下形成脂肪酸（软脂酸或硬脂酸）。

植物体内脱氢作用也是首先发生在饱和脂肪酸的9,10位碳原子上，生成单不饱和脂肪酸（如软脂酸，油酸），但植物中的去饱和酶能在第九位碳原子以外引进双键，因此能合成多不饱和脂肪酸如亚油酸（18:

2，Δ9,12）和亚麻酸（18:

3Δ9,12,15）等多烯脂肪酸。

此外，植物的继续脱氢是在内质网膜上由单不饱和脂肪酸以甘油糖脂或磷脂的形式继续进行脱氢反应，这一过程是一个需氧的过程。

不同生物体内的脂肪酸合酶复合体的结构不同，植物中脂肪酸合酶系统包含六种酶：

乙酰CoA：

ACP转移酶；丙二酸单酰-CoA：

β-酮酯酰-ACP合酶；β-酮酯酰-ACP还原酶；β-羟脂酰-ACP脱水酶；烯脂酰-ACP还原酶。

通过以上途径生成的脂肪酸作为CoA的衍生物，在线粒体中与乙酰CoA，或在微粒体中与丙二酸单酰CoA缩合，每次反应会增加两个碳原子，使得碳链不断的延长[10]。

图1-1脂肪酸合成途径

1.4脂肪酸脱氢酶

多不饱和脂肪酸（PolyunsaturatedFattyacids，PUFAs）合成过程中的重要酶类主要是脂肪酸脱氢酶（FattyAcidDenaturizes，FAD），脂肪酸脱氢酶可分为脂酰辅酶A、脂酰脂和酰基载体蛋白三类[11]。

多不饱和脂肪酸在植物细胞膜的甘油脂类代谢及维护膜的流动性方面发挥着重要的作用，根据第一个不饱和双键的位置不同，多不饱和脂肪酸又可以分为ω-3、ω-6、ω-7、ω-9系列脂肪酸。

在植物中不饱和脂肪酸的合成主要是通过两种途径，一种是真核植物的代谢途径，另一种是原核植物代谢途径，不饱和脂肪酸中的脂肪酸脱氢酶（FattyAcidDenaturize，FAD）发挥作用的机理主要是它的脱氢作用，脂肪酸脱氢酶是催化脂肪酸链的特定位置形成双键以及产生不饱和脂肪酸的一类酶。

研究发现，在植物中存在植物脂肪酸脱氢酶主要有FAD2、FAD3、FAD6、FAD7和FAD8五种类型[12]。

这五种类型可以分为两大类ω-6型（FAD2、FAD6）和ω-3型（FAD3、FAD7、FAD8），他们分别负责催化形成亚油酸和亚麻酸。

到目前为止，在植物中分离的脂肪酸大部分是ω-3脂肪酸，ω-3脂肪酸包括的组分有α-亚麻酸、二十二碳六烯酸（DHA）和二十碳五烯酸（EPA），该脂肪酸为多元的不饱和脂肪酸，对人体的发育及成长、免疫反应、血脂调节等方面有很重要的保健作用[13]。

1.5脂肪酸脱氢酶基因的研究现状

近些年来，许多科研人员已经从拟南芥、大豆、向日葵以及各种油菜作物中发现了FAD2基因，进一步发现FAD2基因是编码FAD2酶的关键基因，是油酸向亚油酸转变的关键基因，对种子中多不饱和脂肪酸的含量以及比例起着决定性的作用。

FAD3、FAD7、FAD8在紫苏中均有表达，只是在不同的部位表达量不同，FAD3在种子中的表达量最高，FAD7在叶子中表达量最高，当然，不同品系表达的量也不一样[14]。

研讨表达脂肪酸脱氢酶FAD8具备催化二烯脂肪酸转变为三烯脂肪酸的性能，是决议α-亚麻酸（Alpha-linolenicacid，ALA）合成的关键酶。

α-亚麻酸对促进人体的健康具有非常重要的作用，ω-3脂肪酸脱氢酶FAD8是催化亚油酸脱氢生成亚麻酸的重要酶类。

拟南芥中的脂肪酸去饱和酶FAD8基因是编码叶绿体ω-3脂肪酸脱饱和酶的主要酶类，这种酶在温度低的环境情况下能够很快实现二烯酸到三烯酸的转变，该酶能提高植物植株中不饱和脂肪酸的含量，而且可以增强植物对低温的适应能力和植物油脂对人体的营养价值[15]。

第2章实验材料与方法

2.1实验材料

2.1.1菌株和载体

所用菌株为大肠杆菌DH5α所用载体pMD18-TVector是一种高效克隆PCR产物（TACloning）的专用载体，其图谱如下:

2.1.2植物材料

该实验所用植物材料为洛阳牡丹“凤丹白”，取自洛阳理工学院王城校区D教学楼西门口的牡丹籽，在实验过程中也需取用牡丹的茎和叶做相应的克隆研究。

牡丹是自然生长的，并没有进行人工培养，取用此牡丹花开约40天后的种子，此时籽实饱满且成熟，利于基因的提取。

2.1.3试剂和药品

（1）DEPC水的配置：

取1mLDEPC水加入到1L水中（稀释1000倍），配置成浓度为0.1%的DEPC水。

在整个配置过程中，全程操作要在通风橱中进行，因为DEPC是一种毒性很强的试剂，配置好的DEPC水要进行高温灭菌处理，经过灭菌后的DEPC没有毒性，配置好的DEPC水主要有两个用途：

①作为提取RNA其他试剂配置时的一种水溶液，由于配置的溶液较多或者配置过程中的其他问题，建议DEPC水可以多配一些，备用；②提取RNA用的所有移液枪的枪头、离心管、PCR时使用的PCR管等塑料器材都要用DEPC水进行处理。

处理的具体操作为：

用两个（或者根据实验所需的枪头、离心管、PCR管的数量来决定）塑料盒，把枪头、离心管、PCR管分装在两个盒中，之后用提前灭过菌的DEPC水把所有的管淹没，一定要把所有要消化的材料完全被DEPC水所覆盖，然后用塑料盒配套的盖子封紧，塑料盒外面用厚质的铝箔包住，避光，拿到37℃培养箱中培养，24个小时之后，把消化过枪头的DEPC水不要倒掉，要进行回收循环利用，因为DEPC水在15天之内都是有效的，最后是把消化过的枪头、离心管、PCR管、配置的DEPC水、消化枪头用的DEPC水一起放到高压蒸汽灭菌锅中进行灭菌，121℃，2小时。

灭菌之后，除了DEPC水外，其他的要放到烘