金银花中绿原酸的提取及检测乌兰.docx

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金银花中绿原酸的提取及检测乌兰

下,随着球磨时间的增加,其剪切应力显著下降。

用幂方程τ=kγm（其中k为稠度系数;m为流动特征指数对曲线进行拟合,结果如表2所示。

由拟合结果可知,在不同温度下,相关系数R2在0.9850~0.9993之间,这说明方程与曲线有较好的相关性。

同一样品的稠度系数k随着温度的升高而减小,说明温度升高可以减小体系的稠度,增强淀粉糊的流动性。

在同一温度下随着球磨时间的增加,稠度系数k显著下降,流动指数m则是呈现增加的趋势,说明球磨后的绿豆淀粉更趋近于牛顿流体。

3结　　论

上述实验结果表明,机械球磨方法可以有效地将绿豆淀粉非晶化,球磨一定时间后淀粉颗粒的偏光十字消失,X-射线衍射曲线的尖峰衍射特征逐渐减弱,绿豆淀粉颗粒的结晶结构受到严重破坏。

球磨处理后绿豆淀粉糊的流变特性在不同浓度和温度下发生了变化,绿豆淀粉糊随着球磨时间的延长稠度系数k不断减小,而流动特征指数m则不断增大,说明球磨处理后绿豆淀粉糊趋向于牛顿流体的特征。

参考文献:

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　Aca-demic　Press,　1979.[5]Prentice　J　H.　Measurements　in　the　rheology　of　foodstuffs[M].　London:

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　轻工业出版社,　1990.　31-43,　163-167.

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　501-505.

收稿日期:

2004-07-14　　　　　　　　　　　　　　　　　　　*通讯作者

基金项目:

天津市教委科研项目（20039902

作者简介:

乌兰（1976-,女,硕士研究生,研究方向为食品科学、天然产物开发。

金银花中绿原酸的提取及检测

乌　兰,张泽生*

（天津科技大学食品工程与生物技术学院,天津　　　　300222

摘　　　要:

采用多种方法分别从金银花中提取绿原酸,用紫外光谱法和高效液相色谱法对其进行定性定量分析。

同时用金银花乙醇提取物对大肠杆菌进行抗菌试验。

绿原酸提取试验结果表明:

用70%乙醇热回流提取是金银花中绿原酸提取的最佳方法,获得绿原酸的提取率高于其他方法,提取终产物与标准品的最高吸收峰均在324nm处,终产物中绿原酸的含量为43.35%。

抗菌试验结果表明:

金银花提取物具有较强的抑菌活性。

关键词:

金银花;绿原酸;提取;检测;抗菌活性

Extraction　and　Examination　of　　Chlorogenic　Acid　from　Flos　Lonicerae

WU　Lan,ZHANG　Ze-sheng*

（Food　Engineering　and　Biology　Technology,　Tianjin　University　of　Science　and　Technology,

Tianjin　　　　　　300222,　China

Abstract　:

Optimization　of　the　extracting　method　of　chlorogenic　acid　from　Flos　Lonicerae　was　studied　by　several　different

methods.　Two　different　ways　of　Ultraviolet　（UV　and　Visible　Spectrophotometr　and　High　Performance　Liquid　Chromatography（HPLC　have　been　carried　out　for　the　quantitative　and　qualitative　determination　of　chlorogenic　acid　in　Flos　Lonicerae.　Inhibitiontest　against　pathogenic　bacteria　has　been　done　with　Flos　Lonicerae　ethanol　and　chlorogenic　acid.　The　results　of　chlorogenic　acidextraction　showed　that　chlorogenic　acid　tiptop　absorb-apex　was　324nm,　with　ethanol　of　70%　concentration　extraction　wasremarkably　superior　to　other　methods.　The　content　of　chlorogenic　acid　with　70%　ethanol　extraction　was　43.35%,　so　the　ethanolwith　70%　concentration　extraction　was　the　optimum　condition.　The　antibacterial　action　of　chlorogenic　acid　

in　vitro　on　EscherichiaColiand　extracted　with　70%　ethanol　from　Flos　Lonicerae　showed　that　Flos　Lonicerae　had　strong　antimicrobial　activity.

Key　words:

Flos　Lonicerae;chlorogenic　acid;extraction;examination;antimicrobial　activity

中图分类号:

TS207.3　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文献标识码:

A　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　　文章编号:

1002-6630（200505-0130-05

金银花为忍冬科（Caprifoliaceae忍冬属（Lonicera植物忍冬（Lonicera　japonica　thunb及同属多种植物的干燥花蕾,它是一种“药食同源”的绿色植物,是临床常用的中药之一。

近代研究一般认为金银花的生物活性有效成分为绿原酸类化合物,并且常以绿原酸含量的高低来评价金银花质量的优劣[1]。

绿原酸具有显著的清热解毒、抗菌消炎和抗衰老作用;对消化道的癌症有明显的抑制作用;还具有抗生育作用及对免疫系统的调节作用;绿原酸还具有增香和护色作用,可用于食品和果品保鲜。

绿原酸是含有羧基和邻二酚羟基的有机酸,易溶于水、醇溶液和丙酮等溶剂。

目前,从金银花中提取绿原酸多采用水煎法、水提醇沉、稀醇回流法、动态浸提法、超声波法和渗漉法等,国内学者对绿原酸不同提取工艺的评价仍存在分歧,但多数认为乙醇回流法较好。

为进一步优化乙醇回流法的提取工艺,本文进行了金银花中绿原酸的提取试验,并采用紫外分光光度法及《中华人民共和国药典》（2000年版要求采用高效液相色谱法（HPLC等作了相应的含量测定,以及经典的生物检测法[2,3]对金银花提取物的生物活性进行检测。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试验材料　　　　河南金银花。

1.1.2试验菌株　　　　大肠埃希氏菌（Escherichia　Coil,　G-,购自湖北武汉大学中国典型培养物保藏中心。

1.1.3培养基　　　　固体肉汤培养基g/L:

蛋白胨10.0,牛肉浸膏5.0,NaCl　5.0,琼脂20.0,pH7.2,121℃灭菌20min;半固体肉汤培养基g/L:

蛋白胨10.0,牛肉浸膏5.0,NaCl　5.0,琼脂8.0,pH7.2,121℃灭菌20min;琼脂培养基g/L:

琼脂20.0,121℃灭菌20min。

1.1.4实验仪器　　　　KDF-2116康达多功能食品粉碎机（天津市达康电器公司,微量进样器（基因公司,ORION818型pH计（美国,RE-3000旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器,SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸,调温加热套（河北省黄骅市中兴,超净工作台（苏净集团,HPS-250生化培养箱（哈尔滨市东明医疗仪器,AB204-N分析天平（美国Mettler-Toledo　Group,Uvmini-1240紫外可见分光光度计（日本岛津有限公司,高效液相色谱仪（　美国Lab,数码相机　CASIO（日本,游标卡尺。

1.1.5主要试剂　　　　无水乙醇、甲醇、氯化钠、柠檬酸、三乙胺（分析纯、乙腈（色谱纯,绿原酸标准品（Sigma公司,庆大霉素（华北制药厂,生产批号:

20040218,80万单位/2ml。

1.2实验方法

1.2.1绿原酸的基本提取工艺

1.2.1.1破碎　　　　水提取时将金银花低温烘干后切至0.6~0.8cm;乙醇提取时将烘干后的金银花用粉碎机破碎至约20目;

1.2.1.2热回流浸提　　　　破碎后将金银花置于磨口圆底烧瓶中,加入适量的水或乙醇溶液,用调温电热套加热至微沸状态,热回流2次,第一次1h,第二次0.5h;

1.2.1.3抽滤　　　　用布氏抽滤器减压处理浸提液;

1.2.1.4浓缩　　　　合并浸提液,用薄膜旋转蒸发器减压浓缩（40℃至无乙醇味,回收的乙醇待用;

1.2.1.5冷沉离心　　　　将浓缩液置于4℃冷藏24h后10000r/min离心30min,取上清,同时将沉淀用少量蒸馏水再洗脱一次,离心后合并两次上清液,定容。

1.2.1.6真空冷冻干燥　　　　将提取液先于超低温冰箱中冷冻0.5h,然后至于真空冷冻干燥剂中干燥成粉末。

1.2.2绿原酸的检测

对金银花中绿原酸定性定量的测定有颜色反应法、容量法、极谱法、比色法、紫外分光光度法、三波长分光光度法、导数光谱法、纸层析—比色法、纸层析—紫外分光光度法、薄层光密度法、薄层层析—紫外分光光度法、薄层扫描法、气相层析法、GC-MC法、高效液相色谱法（HPLC及生物检测法。

本试验采用紫外

分光光度法及高效液相色谱（HPLC法,以及经典的生物检测法——管碟法对金银花提取物的生物活性进行检测。

1.2.2.1紫外分光光度法

（1　标准曲线的绘制

准确称取绿原酸标准品5.0mg,用30%甲醇溶解并定容于50ml容量瓶中。

再准确量取标准溶液0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、2.00、2.50、3.00ml分别于10ml比色管中,用30%甲醇溶液定容。

取0.05mol/L的绿原酸标准溶液用紫外分光光度计于200~500nm扫描。

然后选取最大吸收波长分别测定不同浓度标准溶液的吸光度值（OD值,以绿原酸标准品浓度（g/L为横坐标,以其吸光度值（OD值为纵坐标绘制标准曲线。

（2　绿原酸含量的测定

将不同提取工艺所得供试品各取1ml用30%的甲醇溶液定容至1000ml;在324nm处测其吸光度值,以计算其中绿原酸的含量及提取率。

绿原酸含量=根据标准曲线测得含量/原金银花质量

绿原酸提取率=根据标准曲线测得含量/原金银花中绿原酸总含量

1.2.2.2高效液相色谱法（HPLC

（1　分析条件

柱:

Lab[250mm×4.5mm,C18]分析柱,流动相为乙腈:

柠檬酸缓冲溶液:

水（10:

20:

70,流速为1.0ml/min,室温,进样量为20μl,检测波长为324nm。

（2　对金银花中绿原酸的定性分析

本试验利用HPLC在相同色谱条件下,将标准溶液色谱图与样品色谱图进行对照,根据保留时间确定样品中的绿原酸等活性物质。

（3　标准曲线的绘制

以不同质量浓度的绿原酸标准溶液各20μl分别进样,测定其峰面积。

以绿原酸标准品浓度（g/L为横坐标,以与其相应峰面积为纵坐标绘制标准曲线,再取不同工艺条件提取的待测液用同样方法测定其峰面积以求出绿原酸含量。

1.2.3金银花提取物抑菌活性实验——生物检测法

本试验采用测量抗生素效价的牛津杯法对金银花提取物进行效价的测定。

牛津杯法（又称管碟法是利用抗生素在营养琼脂培养基中的扩散渗透作用,将已知浓度的标准溶液和未知浓度的样品在含有敏感性实验菌的营养琼脂表面进行扩散渗透,由于抗生素对被试菌的抑制作用而产生透明抑菌圈,抑菌圈的大小和抗生素的浓度之间有一定的比例,从而确定抗生素效价的一种方法。

这个方法是利用抗生素可以抑制敏感菌的特点,既符合临床使用的实际情况,而且灵敏度高,又不需要特殊设备,因此被国际公认。

本试验采用管碟法对绿原酸的最低抑菌浓度（MIC进行了测定,利用大肠杆菌（Escherichia　Coli　G+作为敏感试菌。

具体方法如下:

无菌操作。

取10ml琼脂培养基于直径为9cm的无菌培养皿中,铺匀,待凝固后,放入两个牛津杯;取含有活菌数为106~108/ml的半固体培养基10ml,加到装有牛津杯的培养皿中,铺匀,待凝固后,拔出牛津杯;在其中一个杯孔中加入50μl不同工艺条件提取的、一系列浓度梯度的金银花提取液或绿原酸纯品;另一个孔作空白对照以便观察所接菌的生长情况,37℃培养24~48h后,观察抑菌圈的大小和透明度,相同条件作三个平行;恰好没有抑菌圈出现的培养皿所用的溶液浓度为最小抑菌浓度（MIC。

将稀释一系列的庆大霉素也用上述步骤作阳性对照试验。

2结果与分析

2.1紫外分光光度法对绿原酸含量的测定

将绿原酸标准溶液配制成浓度为0.05mol/L,用紫外分光光度计于200~500nm扫描,如图1所示,绿原酸的最大吸收峰在波长为324nm处,故选取324nm。

分别测定不同浓度标准溶液的吸光度值（OD值,做出标准曲线,如图2所示。

求得线性回归方程为Y=57.497x+0.0482,R2=0.9999,

说明本方法在绿原酸的质量浓度为0.005~0.03g/L时具有

良好的线性。

在不同工艺条件对金银花的提取液在324nm测其吸光度值经过公式计算结果如图3。

根据用紫外分光光度法测定绿原酸的含量、提取率与成本来看,应选取70%乙醇进行对绿原酸的提取,提取率可达96.81%,终产物中绿原酸的质量百分数为43.35%。

2.2用高效液相色谱法（HPLC对金银花中绿原酸的检测

对金银花提取液中是否含有绿原酸进行定性分析,标准样品的色谱图如图4所示,样品则选取了70%乙醇提取液进行谱图绘制,如图5。

根据图4、图5表明检测物均在10.211min处出现最大吸收峰,可以初步断定两种物质为同一化合物。

绿原酸的标准曲线如图6所示。

求得线性回归方程为Y=1.0066×108x+8530000,R2=0.9985,说明本方法在绿原酸的质量浓度为0.005~0.025g/L时具有良好的线性。

用不同工艺条件提取的待测液每次进样20μl,测其峰面积以求出绿原酸含量结果如图7所示。

从结果可以看出,紫外分光光度法测定的结果含量往往较高,重现性不好。

而用高效液相色谱法测定的结果较稳定,偏差小。

根据以上的不同检测结果可以看出,紫外分光光度法与高效液相色谱法得出的结果趋势一致,故在提取绿原酸时应选取70%乙醇作为提取溶剂,用HPLC测的绿原酸的提取率为85.63%。

2.3生物检测法测定金银花提取物的最低抑菌浓度（MIC

本试验采用管碟法对不同提取工艺得到的金银花提取物和绿原酸标准品的最低抑菌浓度（MIC

进行了测

定,并设阴性对照与阳性对照（庆大霉素1.0g/L。

结果如表1。

样品MIC（g/L水提取0.87060%乙醇提取0.90070%乙醇提取0.83580%乙醇提取1.000绿原酸标准样品

1.110庆大霉素

0.750

表1　　　不同工艺条件提取的绿原酸及绿原酸标准样品的

最低抑菌浓度（MIC

Table1ResultsofdistillsolutionantimicrobialactivityofMIC

根据以上结果表明:

（1金银花中所含绿原酸并非唯一抑菌成分,其它成分也有抑菌作用,有待于进一步研究;（2确定了金银花中绿原酸提取的最佳工艺为:

70%乙醇提取。

本试验又比较了70%乙醇提取液和庆大霉素的抑菌圈,从中可以看出,0.8g/L的庆大霉素与1.0g/L的70%乙醇提取液效果相当（图8、图9。

庆大霉素,虽对大肠杆菌具有强抑菌作用,但它对人体有肾毒性、耳毒性、过敏反应等,而金银花提取液的毒副作用还未见文献报道,又因为金银花来源丰富、价格低廉,所以金银花与庆大霉素等比较,在临床应用上更为安全、方便,可供临床选用防治大肠杆菌等感染的参考

[4]

。

3讨　　论

3.1

在金银花的提取中,采用70%乙醇提取能有效提

取出金银花中的绿原酸,纯度较高。

且金银花中的有效成分以绿原酸为指标,再根据其生物有效性来看,应选取70%乙醇提取。

3.2

在绿原酸的检测中,紫外分光光度法所测结果与高效液相所测结果相比偏差较大,但趋势相同,故检测绿原酸应采用高效液相法为佳。

3.3

抑菌实验结果表明,金银花的提取物具有很好的体外抑菌作用,对临床有指导意义,而且说明提取物中除绿原酸以外还存在其它较强的抑菌物质,有待于对其它成分的进一步研究　。

参考文献:

[1]国家药典委员会编.　中华人民共和国药典（第一部[M].　化学工业出版社,　2000.　177.

[2]杜连祥,　等.　工业微生物学实验技术[M].　科学技术出版社,　1992.

[3]邬行彦,　熊宗贵,　胡章助.　抗生素生产工艺学[M].　化学工业出版社,　1987.

[4]

戴自英.　临床抗菌药物学[M].　北京:

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信　　息

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