高效液相色谱操作知识.docx
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高效液相色谱操作知识
高效液相色谱操作知识
2010-06-2614:
27:
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（一）高压恒流泵的维护注意事项
泵的密封圈是最易磨损的部件，密封圈的损坏可引起系统的许多故障，要注意保养和定期更换。
应采取下列措施以延长使用寿命：
绝对不允许在没有流动相的或流动相还没有进入泵头的情况下启动泵而造成柱塞杆的干磨。
每天使用后应将整个系统管路中的缓冲液体冲洗干净，防止盐沉积，整个管路要浸在无缓冲的溶液或有机溶剂中。
长期不用也要定期开泵冲洗整个管路。
要用HPLC级试剂
输液管前端要用烧结不锈钢沉子过滤流动相。
要注意防止管路阻塞造成压力过高而损坏仪器。
压力下限应设置在0.5~1MPa，以防止储液器中的流动相被抽干或严重渗漏而引起柱塞的干磨
有柱后清洗功能的高压恒流泵还要注意保持清洗液，否则将失去柱后清洗效果。
（二）流动相使用的注意事项
必须使用HPLC级或相当于该级别的流动相，并要先经0.45?
m薄膜过滤。
过滤后的流动相必须经过充分脱气，以除去其中溶解的气体（如02），如不脱气易产生气泡，增加基线噪声，造成灵敏度下降，甚至无法分析。
几种脱气方法比较：
1、氦气脱气法：
利用液体中氦气的溶解度比空气低，连续吹氦脱气，效果较好但成本高。
2、加热回流法：
效果较好，但操作复杂，且有毒性挥发污染。
3、抽真空脱气法：
易抽走有机相
4、超声脱气法：
一种较为常见的脱气法。
流动相放在超声波容器中，用超声波震荡10~15分钟，此法效果并不太好但操作简单。
如果管路中使用peek树脂部件，请不要使用下列流动相：
浓硫酸、浓硝酸、二氯乙酸、丙酮、四氢呋喃、二氯甲烷、氯仿和二甲基亚砜
特别注意HPLC使用过后的系统清洗：
含有缓冲盐溶液的流动相的清洗方法：
1、先用100%的纯水冲洗，打开排放阀，用3~5ml/min的流量，洗二十分钟左右后停泵。
此举主要是针对吸液系统、泵头、进出口单向阀等体积较大的空间的清洗
2、再用5：
95的甲醇/水清洗整个系统，关闭排放阀，用1ml/min的流量，洗30~60分钟后停泵。
此举主要是用水清洗整个系统中的盐，用5%的甲醇主要是为了保护色谱柱。
3、最后用100%的甲醇清洗整个系统，用1ml/min的流量，洗2分钟左右，然后关机。
如果流动相中不含盐，则使用上述第三步清洗即可。
（三）流动相的更换
在分析过程中，有时需要更换流动相进行分析。
一定要注意前一种使用的流动相和所更换的流动相是不是能够相溶。
如果前一种使用的流动相和所更换的流动相不能够相溶，那您就要特别注意了。
要采用一种与这二种需更换的流动相都能相溶的流动相进行过滤、清洗。
较为常用的过滤流动相为异丙醇，但实际操作中要看具体情况而定，原则就是采用与这二种需更换的流动相都能相溶的流动相。
一般清洗时间为30~40分钟，直至系统完全稳定。
如不进行以上“特别注意”上述步骤的操作，将会导致系统管路阻塞。
严重时将引起流通池污染堵塞，不得不更换流通池。
用户就要承担不必要的损失了。
储液器的注意事项：
保持流动相储液器的清洁是保证仪器正常使用的关键。
要使用HPLC级的溶剂，对试剂含有缓冲盐及非HPLC级的流动相一定要用0.45?
m过滤器除区去其中的微量物质。
仪操作步骤
1）、过滤流动相，根据需要选择不同的滤膜。
2）、对抽滤后的流动相进行超声脱气10-20分钟。
3）、打开液相色谱工作站（包括计算机软件和色谱仪），连接好流动相管道，连接检测系统。
4）、进入液相色谱仪控制界面主菜单，点击manual，进入手动菜单。
5）、有一段时间没用，或者换了新的流动相，需要先冲洗泵和进样阀。
冲洗泵，直接在泵的出水口，用针头抽取。
冲洗进样阀，需要在manual菜单下，先点击purge，再点击start，冲洗时速度不要超过10ml/min。
6）、调节流量，初次使用新的流动相，可以先试一下压力，流速越大，压力越大，一般不要超过2000。
点击injure，选用合适的流速，点击on，走基线，观察基线的情况。
7）、设计走样方法。
点击file，选取se-lectusersａndmethods，可以选取现有的各种走样方法。
若需建立一个新的方法，点击newmethod。
选取需要的配件，包括进样阀，泵，检测器等，根据需要而不同。
选完后，点击protocol。
一个完整的走样方法需要包括：
a.进样前的稳流，一般2-5分钟；b.基线归零；c.进样阀的loading-inject转换；d.走样时间，随不同的样品而不同。
8）、进样和进样后操作。
选定走样方法，点击start。
进样，所有的样品均需过滤。
方法走完后，点击postrun，可记录数据和做标记等。
全部样品走完后，再用上面的方法走一段基线，洗掉剩余物。
9）、关液相色谱仪时，先关计算机，再关液相色谱。
10）、填写登记本，由负责人签字。
注意事项：
1）、流动相均需色谱纯度，水用20M的去离子水。
脱气后的流动相要小心振动尽量不引起气泡。
2）、柱子是非常脆弱的，第一次做的方法，先不要让液体过柱子。
3）、所有过柱子的液体均需严格的过滤。
高效液相色谱仪（Agilent1100）操作注意事项---流动相：
1、流动相应选用色谱纯试剂、高纯水或双蒸水，酸碱液及缓冲液需经过滤后使用，过滤时注意区分水系膜和油系膜的使用范围；
2、水相流动相需经常更换（一般不超过2天），防止长菌变质；
3、使用双泵时，A、B、C、D四相中，若所用流动相中有含盐流动相，则A、D（进液口位于混合器下方）放置含盐流动相，B、C（进液口位于混合器上方）放置不含盐流动相；A、B、C、D四个储液器中其中一个为棕色瓶，用于存放水相流动相。
样品：
1、采用过滤或离心方法处理样品，确保样品中不含固体颗粒；
2、用流动相或比流动相弱（若为反相柱，则极性比流动相大；若为正相柱，则极性比流动相小）的溶剂制备样品溶液，尽量用流动相制备样品液；手动进样时，进样量尽量小，使用定量管定量时，进样体积应为定量管的3～5倍；
色谱柱：
1、使用前仔细阅读色谱柱附带的说明书，注意适用范围，如pH值范围、流动相类型等；
2、使用符合要求的流动相；
3、使用保护柱；
4、如所用流动相为含盐流动相，反相色谱柱使用后，先用水或低浓度甲醇水（如5％甲醇水溶液），再用甲醇冲洗。
5、色谱柱在不使用时，应用甲醇冲洗，取下后紧密封闭两端保存；
6、不要高压冲洗柱子；
7、不要在高温下长时间使用硅胶键合相色谱柱；
使用过程中注意轻拿轻放。
实验前准备事项
1.1对照品的配制
1.1.1配制方法
取干燥情况下的对照品（注意是否吸潮），每次称取量不得少于5mg，置一定容量量瓶中，加入少量溶剂，超声溶解冷却后再定容、混匀（高浓度）。
再用移液管吸取1~2ml至先配制成高浓度的对照品，一定容量量瓶中，加入溶剂定容、混匀，即得（低浓度）。
配置后的对照品均需用封口膜封好。
1.1.2配制浓度 严格按照标准配制对照品浓度（低浓度），不可超过或低于一倍。
1.1.3所需玻璃仪器和容器 所需玻璃仪器和容器，尽量选用棕色容量瓶进行配制。
每次临用前需要用纯水清洗干净后，再用无水乙醇冲洗三次，阴（烤）干、冷却后方可使用。
1.1.4标签 配制好的对照品标签上应注明：
品名、批号、取样量、稀释倍数（浓度）、配制日期。
1.1.5干燥器 干燥器中的干燥剂每月至少处理一次。
1.2供试品的制备
1.2.1取样方法 成品：
取10袋装量差异项下的样品，按照相关品种标准含量测定项下有关要求，精密称取两份，进行平行实验。
药材：
取样袋中药材全部打粉至规定目数（一般为3～4号筛），按照05年版中国药典相关品种含量测定项下有关要求，精密称取两份，进行平行实验。
1.2.2称样要求 用万分之一天平称取，使用中注意天平稳定。
1.2.3量取要求 均用移液管量取或刻度量管。
1.2.4所需玻璃仪器和容器 所需玻璃仪器和容器，每次临用前需要用纯水清洗干净后，再用无水乙醇冲洗三次，阴（烤）干、冷却后方可使用。
2实验中注意事项
2.1实验仪器的准备
2.1.1仪器安装后是否存在漏液现象？
压力是否稳定？
柱子是否安反？
2.1.2检查完毕后，打开电脑、N2000工作站电源开关后，再打开泵电源开关、控制面板上泵开关。
先用色谱甲醇冲洗柱子，等待机器平稳后，再打开检测器电源开关、控制面板上检测器开关。
30分钟后方可进针做实验。
2.1.3打开电脑桌面上的N2000在线工作站，选择通道，设定保存路径、波长（注意控制面板上同样需要设置）等实验信息。
2.1.4设定完毕后，点击数据采集、查看基线、零点校正后，注意观察电脑左下角电压值、时间值波动是否正常？
电压不对：
灯是否开启？
如果开启还有问题，就重新开启工作站或检测器。
时间不对：
调节采样频率（应为10帧/秒）
2.2流动相的配制 所需玻璃仪器和容器，每次临用前需要用纯水清洗干净后，再用无水乙醇冲洗三次，阴（烤）干、冷却后方可使用。
先抽滤、后超声（10-15分钟）
2.3测定法要求
2.3.1样品进样前先混匀，再用0.45?
m滤膜过滤，再混匀后进样。
2.3.2对照品与样品进样量要尽量保持一致，样品峰面积与对照品峰面积尽量保持一致（不要超过一倍，可适当调整进样量或稀释倍数）。
2.3.3注意系统评价：
理论板数（达到标准要求）、分离度（大于1.5）、拖尾因子（0.95-1.05之间）。
2.3.4平行进针要求RSD<2％。
2.3.5进样针每次改进不同样品或对照品时，需用色谱甲醇涮洗五次以上，涮洗位置要超过进样量位置。
2.4仪器使用过程中注意事项
注意机器异常情况的发生（声音），压力是否过高（超过200Bar不可再做实验），流动相是否流空、废液瓶是否已满等等。
2.5实验完毕后
可用甲醇冲洗一小时，如果流动相中含有酸或缓冲盐，则先用新鲜纯水冲洗0.5小时，再用甲醇冲洗一小时。
2.6人参、西洋参等含量测定
做波长小于240nm的样品时，注意机器、柱子一定要加长冲洗时间，乙腈则改用进口乙腈。
2.7保留时间改变的样品
用于实验时间加长，导致对照品与样品保留时间不一致时，在实验最后加进一针对
操作过程：
1、开机操作：
（1）、打开电源，用Harb相连接时，注意Harb电源，打开计算机，打开BootpServer（一般启动时已打开）；
（2）、自上而下打开个组件电源，BootpServer里显示有信号时（有六行字符），打开工作站（先打开Online）；
（3）、打开冲洗泵头的10％异丙醇溶液的开关（需用针捅抽），控制流量大小，以能流出的最小流量为准；
（4）、注意各流动相所剩溶液的容积设定，若设定的容积低于最低限会自动停泵，注意洗泵溶液的体积，及时加液；
（5）、使用过程中要经常观察仪器工作状态，及时正确处理各种突发事件。
2、先以所用流动相冲洗系统一定时间（如所用流动相为含盐流动相，必须先用水冲洗20分钟以上再换上含盐流动相），正式进样分析前30min左右开启D灯或W灯，以延长灯的使用寿命；
3、建立色谱操作方法，注意保存为自己命名的Method，勿覆盖或删除他人的方法及实验结果；
4、使用手动进样器进样时，在进样前和进样后都需用洗针液洗净进样针筒，洗针液一般选择与样品液一致的溶剂，进样前必须用样品液清洗进样针筒3遍以上，并排除针筒中的气泡；
5、溶剂瓶中的沙芯过滤头容易破碎，在更换流动相时注意保护，当发现过滤头变脏或长菌时，不可用超声洗涤，可用5%稀硝酸溶液浸泡后再洗涤；
6、实验结束后，一般先用水或低浓度甲醇水溶液冲洗整个管路30分钟以上，再用甲醇冲洗。
冲洗过程中关闭D灯、W灯；
7、关机时，先关闭泵、检测器等，再关闭工作站，然后关机，最后自下而上关闭色谱仪各组件，关闭洗泵溶液的开关；
8、使用者须认真履行仪器使用登记制度，出现问题及时向老师报告，不要擅自拆卸仪器。
未经操作培训，不得擅自使用仪器。
1、操作过程若发现压力很小，则可能管件连接有漏，注意检查。
当出现错误警告（各组件指示灯均为红色），一般为漏液，其中一个感应器中已有溶剂，漏液故障排除后，擦干，点击Online操作界面中的Instrument/SystemOff，然后再点击操作界面中的Instrument/SystemOn即可。
2、连接柱子与管线时，应注意拧紧螺丝的力度，过度用力可导致连接螺丝断裂。
柱接头处易发生漏液，可能情况为接头Fittings中间的管子未和接口处贴紧。
不同厂家的管线及色谱柱头结构有差异，最好不要混用，必要时可使用PEEK管及活动接头；
3、操作过程若发现压力非常高，则可能管路已堵，应先卸下色谱柱，然后用分段排除法检查，确定何处堵塞后解决。
若是保护柱或色谱柱堵塞，可用小流量流动相或以小流量异丙醇冲洗，还可采用小流量反冲的办法（新柱不提倡），若还是无法通畅，则需换柱；
4、运行过程中自动停泵，可能为压力超过上限或流动相用完；
5、样品瓶中样品较少，自动进样器进样针无法到达液面，可采用调低进样针进样高度的办法，注意设置时不要使进样针碰到瓶底，微量样品分析应使用微量样品瓶；
6、自动进样器进样针未与样品瓶瓶口对准时，需重新定位。
7、泵压不稳或流量不准，可能为柱塞杆密封圈问题或sealwash垫圈问题，需更换；
8、基线产生不规则噪声，可能原因为系统不稳定或没达到化学平衡（使其平衡，若用离子对试剂，在首次使用使需要足够的时间和溶剂体积，色谱柱才能达到足够的平衡），流动相被污染（更换流动相，清洗储液器、过滤器，冲洗并重新平衡系统），色谱柱被污染（为证明可能的原因更换系统的色谱柱或使用一根同类的被证明性能好的色谱柱），检测器不稳定；
9、短期有规则的噪声，可能原因为泵压不稳或泵脉冲，调节溶剂不适当（如两种溶剂的互溶性问题），泵入口管路松或堵塞，泵太脏，泵柱塞磨损，检测器不稳定；
10、长期有规则噪声，可能原因为室温不稳（未使用柱温箱）或使用柱温箱不当；
11、基线漂移，可能原因为系统不稳或没有达到化学平衡，室温不稳（未使用柱温箱），流动相污染或分解，柱污染，检测池泄漏，系统泄漏，固定相流失（另选流动相，另选色谱柱），测定的波长选择错误（对溶剂有吸收），样品组分保留太长（用强度合适的溶剂清洗色谱柱），检测器不稳定；
12、每次进样时的保留时间不重复，可能原因为系统不稳或未达到化学平衡，由于气泡、各部件磨损等原因引起的泵压或泵脉冲输液不稳定，进样体积太大或样品浓度太高平衡被破坏，溶剂配比不合适，柱被污染；
13、无峰，可能原因为检测器选择错误，使用错误的流动相，样品降解；
14、色谱峰比预计的小，可能原因为进样体积错误，检测器灯故障，进样问题（瓶号错、进样体积不合适、进样错误、针头堵塞）；
15、峰变宽，可能原因为进样体积太大或样品浓度太高，过滤器、保护柱入口、柱入口或连接管路有部分堵塞，检测器时间常数设置错误，进样器问题（如阀漏、针头堵塞或损坏），柱或保护柱被污染，对流动相来说样品溶剂太强，使用错误的色谱柱，温度变化；
16、出现双峰/肩峰，可能原因为保护柱或柱入口部分阻塞，柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效，进样体积太大或样品浓度太高（样品过载），平衡破坏；
17、前沿峰，可能原因为进样体积太大或样品浓度太高（样品过载），平衡破坏，对于流动相来说样品溶剂非极性太强（对于反相柱），柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效；
18、脱尾峰，可能原因为柱或保护柱被污染，柱性能下降，保护柱失效，进样器问题（如阀漏等），检测器时间常数设置错误；
19、出现鬼峰，可能原因为流动相被污染，样品预处理时产生降解或混入杂质，先前进样的流出物，样品定量管清洗不当，注射器脏，柱被污染，进样装置被污染，流动相中含有稳定剂/稳定剂变化。
液相色谱常见问题及处理方法
一、HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法
1．样品量不足，解决办法为增加样品量
2．样品未从柱子中流出。
可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
3．样品与检测器不匹配。
根据样品化学性质调整波长或改换检测器
4．检测器衰减太多。
调整衰减即可。
5．检测器时间常数太大。
解决办法为降低时间参数
6．检测器池窗污染。
解决办法为清洗池窗。
7．检测池中有气泡。
解决办法为排气。
8．记录仪测压范围不当。
调整电压范围即可。
9．流动相流量不合适。
调整流速即可。
10．检测器与记录仪超出校正曲线。
解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
二、为什么HPLC柱柱压过高
柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。
其原因有多方面，而且常常并不是柱子本身的问题，您可按下面步骤检查问题的起因。
1．拆去保护预柱，看柱压是否还高，否则是保护柱的问题，若柱压仍高，再检查；2．把色谱柱从仪器上取下，看压力是否下降，否则是管路堵塞，需清洗，若压力下降，再检查；3．将柱子的进出口反过来接在仪器上，用10倍柱体积的流动相冲洗柱子，（此时不要连接检测器，以防固体颗粒进入流动池）。
这时，如果柱压仍不下降，再检查；4．更换柱子入口筛板，若柱压下降，说明您的溶剂或样品含有颗粒杂质，正是这些杂质将筛板堵塞引起压力上升。
若柱压还高，请与厂商联系。
一般情况下，在进样器与保护柱之间接一个在线过滤器便可避免柱压过高的问题，SGE提供的heodyne7315型过滤器就是解决这一问题的最佳选择。
三、液相色谱中峰出现拖尾或出现双峰的原因是什么？
1．筛板堵塞或柱失效，解决办法是反向冲洗柱子，替换筛板或更换柱子。
2．存在干扰峰，解决办法为使用较长的柱子，改换流动相或更换选择性好的柱子.
四、如何解决HPLC进行分析时保留时间发生漂移或急速变化
1．温度控制不好，解决方法是采用恒温装置，保持柱温恒定
2．流动相发生变化，解决办法是防止流动相发生蒸发、反应等
3．柱子未平衡好，需对柱子进行更长时间的平衡快速变化现象
4. 流速发生变化，解决办法是重新设定流速，使之保持稳定
5．泵中有气泡，可通过排气等操作将气泡赶出。
6．
流动相不合适，解决办法为改换流动相或使流动相在控制室内进行适当混合
五、HPLC仪器问题
1、我的HPLC泵压明显的偏高，请问可能的原因？
答：
流速设定过高；流动相或进样中有机械杂质，造成保护柱、柱前筛板或在线过滤器阻塞；流动相粘度过大；柱温过低；缓冲盐结晶；压力传感器故障。
2、基线不稳，上下波动或漂移的原因是什么，如何解决？
答：
a.流动相有溶解气体；用超声波脱气15-30分钟或用充氦气脱气
b.单向阀堵塞；取下单向阀，用超声波在纯水中超20分钟左右，去处堵塞物
c.泵密封损坏，造成压力波动；更换泵密封
d.系统存在漏液点；确定漏液位置并维修
e.流通池有脏物或杂质；清洗流通池
f.柱后产生气泡；流通池出液口加负压调整器
g.检测器没有设定在最大吸收波长处；将波长调整至最大吸收波长处
h.柱平衡慢，特别是流动相发生变化时；用中等强度的溶剂进行冲洗，更改流动相时，在分析前用10-20倍体积的新流动相对柱子进行冲洗。
3、接头处为何经常漏液，如何处理？
答：
接头没有拧紧；拧松后再紧，手紧接头以手劲为限，不要使用工具，不锈钢接头先用手拧紧，再用专用扳手紧1/4-1/2圈，注意接头中的管路一定要通到底，否则会留下死体积。
接头被污染或磨损；建议更换接头。
接头不匹配，建议使用同一品牌的配件。
4、进样阀漏液是如何造成的？
答：
a.转子密封损坏；更换转子密封
b.定量环阻塞；清洗或更换定量环
c.进样口密封松动；调整松紧度
d.进样针头尺寸不合适，一般是过短；使用恰当的进样针（注意针头形状）
e.废液管中产生虹吸；清空废液管
六、谱图问题
1、问：
造成峰分叉的原因是什么，如何消除？
答：
保护柱或分析柱污染；取下保护柱再进行分析。
如果必要更换保护柱。
如果分析柱阻塞，拆下来清洗。
如果问题仍然存在，可能是柱子被强保留物质污染，运用适当的再生措施。
如果问题仍然存在，入口可能被阻塞，更换筛板或更换色谱柱。
样品溶剂不溶于流动相；改变样品溶剂，如果可能采取流动相作为样品溶剂。
2、问：
K'值增加时，拖尾更严重，这是为什么？
答：
反相模式，二级保留效应；
a.加入三乙胺（或碱性样品）
b.加入乙酸（或酸性样品）
c.加入盐或缓冲剂（或离子化样品）
d.更换一支柱子
3、问：
保留时间的波动有几种可能的原因？
答：
温控不当；调节好柱温。
流动相组分变化；防止流动相蒸发、反应等，做梯度时尤其要注意流动相混合的均匀。
色谱柱没有平衡；在每一次运行之前给予足够的时间平衡色谱柱。
七、问：
HPLC灵敏度不够的主要原因及解决办法
1．样品量不足，解决办法为增加样品量
2．样品未从柱子中流出。
可根据样品的化学性质改变流动相或柱子
3．样品与检测器不匹配。
根据样品化学性质调整波长或改换检测器
4．检测器衰减太多。
调整衰减即可。
5．检测器时间常数太大。
解决办法为降低时间参数
6．检测器池窗污染。
解决办法为清洗池窗。
7．检测池中有气泡。
解决办法为排气。
8．记录仪测压范围不当。
调整电压范围即可。
9．流动相流量不合适。
调整流速即可。
10．检测器与记录仪超出校正曲线。
解决办法为检查记录仪与检测器，重作校正曲线。
八、问：
毛细管色谱分流进样时，非线性分流的主要原因是什么？
1进样器温度太低，样品汽化不完全，发生分级分流。
2进样器温度太高，某些组分可能发生热分解，也有的样品可能发生催化分解，或样品部分地被吸附在进样器内表面上。
3在分流点以前样品没有混合均匀或混合不充分。
4系统的进样垫、柱接头等地方漏气。
九、问：
做HPLC分析时，柱压不稳定，原因何在？
如何解决？
答：
原因可能有：
1．泵内有空气，解决的办法是清除泵内空气，对溶剂进行脱气处理；
2．比例阀失效，更换比例阀即可；
3．泵密封垫损坏，更换密封垫即可；
4．溶剂中的气泡，解决的办法是对溶剂脱气，必要时改变脱气方法；
5．系统检漏，找出漏点，密封即可；
6．梯度洗脱，这时压力波动是正常的。
十、问：
做PGS/MS分析时，如何防止焦油状污染物进入毛细柱？
答：
聚合物，尤其是一些含氮，硫及卤素的高分子裂解时，常有焦油状物质产生。
为防止这种焦油状物质进入毛细柱造成污染而使柱性能下降，可采用保护预柱，即在裂解器与毛细柱之间接一填充预柱，通过控制预柱温度而使焦油状物质滞留在预柱内，预柱可置于GC气化室内，这样既容易控制温度，又减少系统的死体积，当然，预柱填料需经常更换。
十一、问：
更换了另一种牌号的ODS柱，虽然分离情况仍可以，但保留时间不能重现，为什么？
答：
这是因为被分析物可能具有形成氢键的能力。
尽管过去几年来，填料的制造技术有了极大的提高，但不同的厂商的ODS填料表面硅醇基的浓度不同。
正是这些硅醇基可能与样品发生相互作用。
因此，同一被分析物中的各组分在不同牌号的ODS柱上的相对保留时间就可能不同。
在流动相中加入少量竞争物，如三乙基胺（TEA），将会使硅醇基的成键能力饱和，从而能保证不同牌号柱子上的相对保留时间具有较好的重现性。
十二、问：
购买的HPLC柱验收测试时柱压过高，请问为什么？
答：
柱压过高是HPLC柱用户最常碰到的问题。
其原因有多方面，
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