欧洲药典 1002613 非无菌产品的微生物检测 特定微生物的检测.docx

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欧洲药典1002613非无菌产品的微生物检测特定微生物的检测

04/2010:

20613

2.6.13.非无菌产品的微生物检测:

特定微生物的检测（）

1.介绍

以下描述的几项检测可用于检测不得存在或限量存在的特定微生物，这些微生物可在规定的条件下检出。

设计这些检测,主要用于鉴定一种物质或制剂是否符合一个已建立的微生物质量规定。

用于此目的时，可按如下规定确定取样数量，判定结果。

如果能证明它等同于药典的方法，可采用替代性的微生物的检测程序（包括自动化的方法）。

2.一般性操作规程

按通用章节2.6.12所述制备样品。

若供试品有抑菌性活性，需按通用章节2.6.12所述尽可能的减少其抑菌性或中和。

如果样品制备过程中使用了表面活性剂，则必须按通用章节2.6.12所述证明表面活性剂对微生物的无毒性和它与所使用的钝化剂的相容性。

3.培养基的促生长性和抑制性以及检测的适用性

必须验证在有供试品存在的条件下检测方法检出微生物的能力。

如果检测过程或产品发生了变化，且该变化可能影响检测的结果，则需证明其适用性。

3-1.检测菌株的制备

使用稳定的标准检测菌株混悬液或按以下规定制备。

采用种子菌培养保持技术，确保原代菌连续传代不超过5次。

3-1-1.需氧的微生物。

将每种细菌检测菌株分别在大豆酪蛋白消化物肉汤培养基或大豆酪蛋白消化琼脂培养基上于30-35℃培养18-24小时。

将白色念珠菌的检测菌株在分别在萨布罗右旋糖琼脂培养基上或萨布罗右旋糖肉汤培养基上于20-25℃培养2-3天。

－金黄色葡萄球菌如：

ATCC6538，NCIMB9518，CIP4.83或NBRC13276；

－铜绿假单胞菌如：

ATCC9027，NCIMB8626，CIP82.118或NBRC13275；

－大肠杆菌如：

ATCC8739，NCIMB8545，CIP53.126或NBRC3972；

－肠道沙门菌：

血清型为salmonellaentericasubsp.entericaserptypetyphimutium,如ATTC14028，或其替代品salmonellaentericasubsp.entericaserotypeabony如NBRC100797，NCTC6017或CIP80.39;

－白色念珠菌如：

ATCC10231，NCPF3179，IP48.72或NBRC1594；

用pH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲溶液或pH7.2的磷酸缓冲溶液配制供试混悬液。

该混悬液在2小时内使用或在2-8℃贮存条件下24小时内使用。

3-1-2.梭菌属使用产孢梭菌如ATCC11437（NBRC14293，NCIMB12343,CIP100651）或ATCC19404（NCTC532或CIP79.03）或NBRC14293。

在无氧条件下，将梭菌检测菌株在梭菌的增菌培养基中于30-35℃培养24-48小时。

可用稳定的孢子混悬液代替孢梭菌的营养细胞混悬液的新鲜稀释液作为测试菌接种。

该孢子混悬液可在2-8°C保存一定有效时间。

3-2阴性对照

为验证检测条件，采用选定的稀释剂代替供试制剂作阴性对照。

必须无微生物生长。

当产品按照第4部分的描述进行检测时也需要进行阴性对照实验。

需要对失败的阴性对照进行研究。

3-3培养基促进生长和抑制的作用

检测每批预制备的培养基和培养基，包括经无水培养基和由所描述成分制备的培养基。

按表2.6.13-1的描述验证相关培养基适用性。

液体培养基促生长性的检测:

将少量（不超过100CFU）合适的微生物接种于适量的培养基中。

于规定的温度下，不超过检测中规定的最短时间内培养。

相比于预先用预测试得到的和经认可批次的培养基，其长出的微生物应该是清晰可见的。

表2.6.13.-1－培养基的生长促进性，抑制性和指示性

培养基

性质

检测菌株

胆汁耐受性革兰氏阴性细菌的检测

肠道菌增菌Mossel肉汤培养基

促生长性

大肠杆菌

绿脓杆菌

抑制性

金黄色葡萄球菌

结晶紫，中性红，胆盐葡萄糖琼脂培养基

促生长性+指示性

大肠杆菌

铜绿假单胞菌

大肠杆菌的检测

麦康凯（MacConkey）肉汤培养基

促生长性

大肠杆菌

抑制性

绿脓杆菌

麦康凯（MacConkey）琼脂培养基

促生长性+指示性

大肠杆菌

沙门氏菌的检测

氯化镁孔雀绿沙门氏菌增菌肉汤培养基

促生长性

肠道沙门菌（血清型为）salmonellaentericasubsp.entericaserptypetyphimutium或salmonellaentericasubsp.entericaserotypeabony

抑制性

大肠杆菌

木糖，赖氨酸，脱氧胆酸盐琼脂培养基

促生长性+指示性

肠道沙门菌（血清型为）salmonellaentericasubsp.entericaserptypetyphimutium或salmonellaentericasubsp.entericaserotypeabony

指示性

大肠杆菌

铜绿假单胞菌的检测

溴棕三甲铵琼脂培养基

促生长性+指示性

铜绿假单胞菌

抑制性

大肠杆菌

金黄色葡萄球菌的检测

甘露醇盐琼脂培养基

促生长性+指示性

金黄色葡萄球菌

抑制性

大肠杆菌

梭菌的检测

梭菌增菌培养基

促生长性

产孢梭菌

哥伦比亚琼脂培养基

促生长性

产孢梭菌

白色念珠菌检测

沙氏葡萄糖肉汤培养基

促生长性

白色念珠菌

沙氏葡萄糖琼脂培养基

促生长性+指示性

白色念珠菌

固体培养基促生长性的检测:

采用表面铺展法，在每个培养皿中接种少量（不超过100CFU）的合适的微生物。

于规定的温度下，不超过检测中规定的最短时间内培养。

相比于预先用预测试得到的和经认可批次的培养基，其长出的微生物应该是清晰可见的。

液体或固体培养基抑制性的检测:

将不少于100CFU的合适的微生物接种于合适的培养基中。

于规定的温度下，不超过检测中规定的最长时间内培养。

应无检测的微生物生长。

指示性的检测:

采用表面铺展法，在每个培养皿中接种少量（不超过100CFU）的合适的微生物。

于规定的温度下，在检测规定的时间范围内培养。

相比于预先用预测试得到的和经认可批次的培养基，菌落是明显的且具有指示反应。

3-4.检测方法的适用性

对于每份供试品，按第4部分相关段落所述制备样品。

在混合时，于规定的生长培养基中加入每种检测菌株。

单个的接种这些检测菌株。

使用相当于接种的供试制剂中不超过100CFU的微生物接种。

采用规定的最短的培养时间,执行第4部分相关段落描述的检测。

规定的微生物必须检出有如第4部分所述的指示反应。

产品的任何抗菌作用，将使检测过程做出必要的改变（参见总论章节2.6.12中4-5-3项内容）。

对于某种给定的产品，规定的检测不能中和其对有关微生物的抗菌活性时，可假定其抑制的微生物在产品中不存在。

4.产品的检测

4-1胆汁耐受革兰氏阴性菌

4-1-1.样品的制备和预培养.按总论章节2.6.12所述使用1g供试品的10倍稀释液制备样品。

（用大豆酪蛋白消化物肉汤作为稀释液）混匀并于20-25℃下，在大于细菌复苏而小于细菌增殖的一段足够的时间内培养（一般为2h，但不超过5h）。

4-1-2.无菌检测除非另有规定，按4-1-1项制备相当于1g产品量的样品，接种于肠道菌增菌Mossel肉汤培养基上，于30-35℃下培养24-48小时。

在结晶紫，中性红，胆盐葡萄糖琼脂培养基的平板上，于30-35℃继代培养18-24小时。

若无任何菌落生长，则该产品符合检测要求。

4-1-3.定量检测

4-1-3-1.选择和继代培养。

取适量的肠道菌增菌Mossel肉汤培养基，分别接种按4-1-1所述的含0.1g,0.01g,0.001g（或0.1ml,0.01ml或0.001ml）的供试品和/或稀释液，于30-35℃培养24-48小时。

在结晶紫，中性红，胆盐葡萄糖琼脂培养基的平板上，于30-35℃继代培养18-24小时。

4-1-3-2.结果判定。

有菌落的生长即为阳性结果。

记录产品呈现阳性结果的最小量和呈阴性结果的最大量。

按表2.6.13-2测定细菌的可能数目。

表2.6.13.-2－结果判定

产品各个量的结果

每克或每毫升产品细菌的可能数量

0.1g或0.1ml

0.01g或0.01ml

0.01g或0.01ml

+

+

+

>103

+

+

-

<103且>102

+

-

-

<102且>10

-

-

-

<10

4-2大肠杆菌

4-2-1样品的制备和预培养。

按总论章节2.6.12所述使用不少于1g供试品的10倍稀释液制备样品，用10ml或相当于供试品1g或1ml的量接种于适量（按3-4项下描述检测）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基上，混匀并于30-35°C培养18-24小时。

4-2-2选择和继代培养。

振摇容器，将1ml大豆酪蛋白消化物肉汤培养基转移至100ml麦康凯（MacConkey）肉汤培养基中，于42-44℃培养24-48小时。

在麦康凯琼脂培养基平板上于30-35℃继代培养18-72小时。

4-2-3结果判定。

有菌落生长表明可能存在大肠杆菌。

可用鉴别检测来确证。

若无菌落存在或鉴别检测结果呈阴性，则产品符合检测要求。

4-3.沙门氏菌

4-3-1.样品的制备和预培养。

按总论章节2.6.12所述制备供试品，使用相当于不少于供试品10g或10ml的量接种于适量（按3-4项下描述检测）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基中，混匀并于30-35°C培养18-24小时。

4-3-2.选择和继代培养。

将0.1ml的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基转移至10ml氯化镁孔雀绿沙门氏菌增菌肉汤培养基中，于30-35℃培养18-24小时。

在木糖，赖氨酸，脱氧胆酸盐琼脂培养基平板上于30-35℃继代培养18-48小时。

4-3-3.结果判定。

有生长良好的红色菌落（有或无黑色中心）生长表明可能存在沙门氏菌。

可用鉴别检测来确证。

若无所述类型的菌落存在或鉴别检测结果呈阴性，则产品符合检测要求。

4-4.铜绿假单胞菌

4-4-1样品的制备和预培养。

按总论章节2.6.12所述使用不少于1g供试品的10倍稀释液制备样品，用10ml或相当于供试品1g或1ml的量接种于适量（按3-4项下描述检测）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基上，混匀。

当检测透皮贴剂时，按总论章节2.6.12下4-5-1项下所述，用无菌滤膜过滤相当于1块贴剂的样品制备液，并将滤膜置于100ml大豆酪蛋白消化物肉汤培养基中。

于30-35°C培养18-24小时。

4-4-2选择和继代培养.在溴棕三甲铵琼脂培养基平板上于30-35℃培养18-72小时。

4-4-3.结果判定。

有菌落生长表明可能存在铜绿假单胞菌。

可用鉴别检测来确证。

若无所述类型的菌落存在或鉴别检测结果呈阴性，则产品符合检测要求。

4-5.金黄色葡萄球菌

4-5-1.样品的制备和预培养。

按总论章节2.6.1.2（统一的方法，B部分下）所述使用不少于1g供试品的10倍稀释液制备样品，用10ml或相当于供试品1g或1ml的量接种于适量（按3-4项下描述检测）的大豆酪蛋白消化物肉汤培养基中，混匀。

当检测透皮贴剂时，按总论章节2.6.12（统一的方法，B部分下，4-5-1）所述，用无菌滤膜过滤相当于1块贴剂的样品制备液，并将滤膜置于100ml大豆酪蛋白消化物肉汤培养基中。

于35-37°C培养18-24小时。

4-5-2.选择和继代培养。

在甘露醇盐琼脂培养基平板上，于30-35℃培养18-72小时。

4-5-3.结果判定。

有被黄色区域包围的黄色/白色的菌落生长，表明可能存在金黄色葡萄球菌。

可用鉴别检测来确证。

若无所述类型的菌落存在或鉴别检测结果呈阴性，则产品符合检测要求。

4-6.梭菌

4-6-1.样品的制备和热处理。

按总论章节2.6.12所述，取不少于2g或2ml供试品以1:

10稀释（最小总体积为20ml）制备供试品。

将样品分成2份，每份至少10ml。

将其中一份于80℃加热10分钟并立即冷却。

另一部分不需加热。

4-6-2选择和继代培养.使用两份10ml或相当于1g或1ml供试品的数量用适量（按3-4项下的描述确定）的梭菌属强化培养基。

在无氧条件下，于30-35℃培养48小时。

培养之后，将每只试管的培养物在哥伦比亚琼脂培养基中，在无氧条件下，于30-35℃继代培养48-72小时。

4-6-3.结果判定。

在无氧条件下生长的杆菌（有或无内生孢子）过氧化氢酶反应呈阴，则表明存在梭菌。

通过鉴定检测证实。

如果在哥伦比亚琼脂培养基上未出现描述的这种菌落或者用于证实的鉴定检测为阴性则产品符合检测。

4-7.白色念珠菌

样品的制备和预培养。

按总论章节2.6.12所述制备供试品，用10ml或相当于不少于供试品1g或1ml的量，接种于100ml的沙氏葡萄糖肉汤培养基中，混匀。

于30-35℃培养3-5天。

4-7-2.选择和继代培养。

在沙氏葡萄糖琼脂培养基的平板上，于30-35℃培养24-48小时。

4-7-3.结果判定。

有白色菌落生长表明存在白色念珠菌。

可用鉴别检测来确证。

若无菌落存在或鉴别检测结果呈阴性，则产品符合检测要求。

以下部分为提供信息。

5.推荐溶液与培养基

以下溶液和培养基可满足药典关于微生物污染检验的要求。

若能证明适用性则其他培养基亦可采用。

储备缓冲溶液。

将34克磷酸二氢钾置于一个1000ml的容量瓶中，用500ml纯化水溶解，用氢氧化钠将pH值调至7.2±0.2，用纯化水稀释至1000.0ml，混匀。

分装至几个容器中并灭菌。

在2-8℃下保存。

pH7.2的磷酸盐缓冲液。

制备储备缓冲溶液与纯化水的混合溶液（1:

800V/V）并灭菌。

pH7.0的氯化钠-蛋白胨缓冲溶液

磷酸二氢钾3.6g

磷酸氢二钠二水化物7.2g（相当于0.067M磷酸盐）

氯化钠4.3g

蛋白胨（肉或酪蛋白）1.0g

纯化水1000ml

置高压灭菌器中按有效地周期灭菌。

大豆酪蛋白消化物肉汤培养基

酪蛋白胰酶消化物17.0g

大豆木瓜蛋白酶消化物3.0g

氯化钠（NaCl）5.0g

磷酸氢二钾（K2HPO4）2.5g

葡萄糖一水合物2.5g

纯化水1000ml

调节pH值，使灭菌后25℃时其pH值为7.3±0.2。

置高压灭菌器中按有效地周期灭菌。

大豆酪蛋白消化物琼脂培养基

酪蛋白胰酶消化物15.0g

大豆木瓜蛋白酶消化物5.0g

氯化钠5.0g

琼脂15.0g

纯化水1000ml

调节pH值，使灭菌后25℃时其pH值为7.3±0.2。

置高压灭菌器中按有效地周期灭菌。

沙氏葡萄糖琼脂培养基

葡萄糖40.0g

动物组织胃蛋白酶消化物与酪蛋白胰酶消化物的混合物（1:

1）10.0g

琼脂15.0g

纯化水1000ml

调节pH值，使灭菌后25℃时其pH值为5.6±0.2。

置高压灭菌器中按有效地周期灭菌。

马铃薯葡萄糖琼脂培养基

马铃薯浸出物200g

葡萄糖20.0g

琼脂15.0g

纯化水1000ml。

调节pH值，使灭菌后25℃时其pH值为5.6±0.2。

置高压灭菌器中按有效地周期灭菌。

沙氏葡萄糖肉汤培养基

葡萄糖20.0g

动物组织胃蛋白酶消化物与酪蛋白胰酶消化物的混合物（1:

1）10.0g

纯化水1000ml。

调节pH值，使灭菌后25℃时其pH值为5.6±0.2。

置高压灭菌器中按有效地周期灭菌。

肠道菌增菌Mossel肉汤培养基

明胶胰酶消化物10.0g

葡萄糖一水合物5.0g

脱水牛胆汁20.0g

磷酸二氢钾2.0g

磷酸氢二钠二水化物8.0g

亮绿15mg

纯化水1000ml

调节pH值，使灭菌后25℃时其pH值为7.2±0.2。

于100℃加热30分钟，立即冷却。

结晶紫，中性红，胆盐葡萄糖琼脂培养基

酵母浸出物3.0g

明胶胰酶消化物7.0g

胆盐1.5g

氯化钠5.0g

葡萄糖一水合物10.0g

琼脂15.0g

中性红30mg

结晶紫2mg

纯化水1000ml

调节pH值，使灭菌后25℃时其pH值为7.4±0.2。

加热至沸，不得在高压灭菌器中加热。

麦康凯肉汤培养基

明胶胰酶消化物20.0g

乳糖一水合物10.0g

脱水牛胆汁5.0g

溴甲酚紫10mg

纯化水1000ml

调节pH值，使灭菌后25℃时其pH值为7.3±0.2。

置高压灭菌器中按有效地周期灭菌。

麦康凯琼脂培养基

明胶胰酶消化物17.0g

蛋白胨（肉和酪蛋白胨）3.0g

乳糖一水合物10.0g

氯化钠5.0g

胆汁盐1.5g

琼脂13.5g

中性红30.0mg

结晶紫1mg

纯化水1000ml

调节pH值，使在灭菌后25℃时其pH值为7.1±0.2。

不停地摇动并加热至沸1分钟，然后置高压灭菌器中按有效地周期灭菌。

氯化镁孔雀绿沙门氏菌增菌肉汤培养基

大豆胨4.5g

氯化镁六水合物29.0g

氯化钠8.0g

磷酸氢二钾0.4g

磷酸二氢钾0.6g

孔雀绿0.036g

纯化水1000ml

溶解，缓慢地温热，置高压灭菌器中在不超过115℃的温度下按有效地周期灭菌。

在加热和高压灭菌之后25℃时其pH值应为5.2±0.2。

木糖、赖氨酸、脱氧胆酸盐琼脂培养基

木糖3.5g

L-赖氨酸5.0g

乳糖一水合物7.5g

蔗糖7.5g

氯化钠5.0g

酵母浸出物3.0g

酚红80mg

琼脂13.5g

去氧胆酸钠2.5g

硫代硫酸钠6.8g

枸橼酸铁铵0.8g

纯化水1000ml

调节pH值，使灭菌后25℃时其pH值为7.4±0.2。

加热至沸，冷却至50℃，并倒入培养皿中。

不得在高压灭菌器中加热。

溴棕三甲铵琼脂培养基

明胶胰酶消化物20.0g

氯化镁1.4g

硫酸钾10.0g

溴化十六烷基三甲铵0.3g

琼脂13.6g

纯化水1000ml

甘油10.0ml

振摇并加热至沸1分钟。

调节pH值，使灭菌后25℃时其pH值为7.4±0.2。

置高压灭菌器中按有效地周期灭菌。

甘露醇盐琼脂培养基

酪蛋白胰酶消化物5.0g

动物组织胃蛋白酶消化物5.0g

牛肉浸膏1.0g

D-甘露醇10.0g

氯化钠75.0g

琼脂15.0g

酚红0.025g

纯化水1000ml

振摇并加热至沸1分钟。

调节pH值，使灭菌后25℃时其pH值为7.4±0.2。

置高压灭菌器中按有效地周期灭菌。

梭菌增菌培养基

牛肉浸膏10.0g

蛋白胨10.0g

酵母浸出物3.0g

可溶性淀粉1.0g

葡萄糖一水合物5.0g

盐酸半胱氨酸0.5g

氯化钠5.0g

乙酸钠3.0g

琼脂0.5g

纯化水1000ml

水化琼脂，加热并不断搅拌使其溶解。

必要时调节pH，使灭菌后25℃时其pH约为6.8±0.2。

置高压灭菌器中按有效地周期灭菌。

哥伦比亚琼脂培养基

酪蛋白胰酶消化物10.0g

肉蛋白胃蛋白酶消化物（Meatpepticdigest）5.0g

心肌蛋白胰酶消化物（Heartpancreaticdigest）3.0g

酵母浸出物5.0g

玉米淀粉1.0g

氯化钠5.0g

琼脂（根据其凝胶化作用力）10.0-15.0g

纯化水1000ml

水化琼脂，加热并不断搅拌使其溶解。

必要时调节pH，使灭菌后25℃时其pH值为7.3±0.2。

置高压灭菌器中按有效地周期灭菌。

放置冷却至45-50℃，有必要时可加入相当于20mg庆大霉素基的硫酸庆大霉素并倒入培养皿中。