小鼠哮喘模型肺组织中STAT1活性变化及其对ICAM.docx

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小鼠哮喘模型肺组织中STAT1活性变化及其对ICAM

小鼠哮喘模型肺组织中STAT1活性变化及其对ICAM1表达的影响

【摘要】　目的探讨信号转导和转录激活子1DNA结合活性在小鼠哮喘模型的肺中不同时间点的变化及其对细胞间黏附分子1表达的调控作用。

方法　用鸡卵白蛋白（OVA）抗原溶液腹腔注射致敏,雾化吸入激发制备哮喘小鼠模型，造模后凝胶迁移滞留试验的方法测定病变肺组织中STAT1DNA结合活性在模型组不同时间点（8h、24h、48h、96h、7d）的变化；PCR法测定ICAM1mRNA在上述时间点的表达，设生理盐水对照组。

设生理盐水对照组为0h时间组。

结果造模后肺STAT1明显活化，96h达到最高峰；ICAM1mRNA与蛋白表达在8h开始有所增加，96h达高峰。

STAT1DNA结合活性及ICAM1表达呈高度正相关。

对照组则无明显改变。

结论哮喘模型的病变肺组织STAT1DNA结合活性的持续与异常升高，STAT1参与鸡卵白蛋白诱导的小鼠哮喘的发生和　；ICAM1在模型的不同时间点表达增加，可能受到STAT1调控。

【关键词】　小鼠鸡卵白蛋白哮喘动物模型转录黏附分子

　　Abstract:

ObjectiveTodetectthechangeofDNAbindingactivityofSTAT1invarioustimeandexpressionofintercellularadhesionmolecule1　which　wasregulatedbySTAT1inthemicemodelwithelectrophoreticmobilityshiftassay（EMSA）andPCR.MethodsMicewererandomizedintodifferentgroups:

asthmagroupandnormalcontrolgroup.MiceinmodelgroupweresensitizedbyintraperitonealinjectionandAl（OH）3on0,14d.On18,19,20d,theanimalswerechallengedwith10g/LOVAaerosolfor20min.　The　modelsweredividedinto6groupswhichwerekilledat0h,8h,24h,48h,96h,7d.ActivityofSTAT1DNAbindingwasdetectedbyelectrophoresismobilityshiftassays（EMSA）atvarioustimepoints.ExpressionofICAM1wasdetectedbyPCR.ResultsThebindingactivityofSTAT1increasedwithadynamiccurveinexperimentalgroups.Itbegantoincreaseat8hpointtimeandreachedtopeakat96h,thendecreasedbutstillkeepobviouslyhigherat7dversuscontrolgroup（）.LevelsofICAM1mRNAsignificantlyelevatedat8handthepeakwasat7d.ConclusionsSTAT1activationisanimportantfactorthatmaybeinvolvedinacuteandchronicinflammationdevelopment.STAT1alsoregulatedICAM1expressionduringasthma.

　　Keywords:

mice;OVA;asthma;animalmodel;transcription;intercellularadhesionmolecule

　　支气管哮喘（bronchialasthma,BA）是一种气道非特异性炎症性疾病,在我国发病率比较高，严重影响患者的身心健康和生活质量，给　及家庭造成了严重的　负担。

随着研究的深入，细胞信号转导途径对哮喘的作用越来越受重视，特别是信号转导和转录激活子1，成为揭示哮喘发病机制的一个新的途径。

STAT1是连接多种细胞膜受体与选择性效应器之间信号转导的主要蛋白质，在细胞因子调节　中起着重要作用。

本文旨在通过建立小鼠的哮喘模型，研究STAT1在哮喘发病过程中对ICAM1基因的转录调节作用，有助于从基因转录调节的水平寻找哮喘治疗的新靶点。

　　1材料与方法

　　1．1实验方法

　　实验动物分组36只6周BALA/C小鼠，购自广东院动物实验中心，体质量10～14g，合格证号：

2005A025。

按随机区组设计随机分为6组：

生理盐水组，模型组（造模后8h,24h,48h,96h,7d5个时间点处死，各6只）。

实验方法：

第1日每只小鼠腹腔注射20μg卵白蛋白（OVA）和2mg氢氧化铝〔混合于mL磷酸盐缓冲液（PBS）中〕；第8天注射10μgOVA和1mg氢氧化铝。

第15天开始将小鼠置于封闭容器中，给予5%OVA和×PBS雾化吸入激发哮喘发作；均每日1次，每次25min，连续7d；造模成功后，按上述时间点处死动物。

标本处理：

造模后放血处死小鼠，从每时间点组迅速取出肺组织，小部分作HE病理分析，其余部分液氮-70℃冷冻保存留待EMSA分析STAT1，RTPCR分析ICAM1mRNA表达。

　　凝胶迁移滞留试验检测肺组织STAT1核蛋白的提取从液氮中取出肺组织，隔铝箔纸捣碎。

裂解缓冲A液312μL溶解粉末，0℃匀浆10～20次。

0℃，2000r/min，离心15s。

弃沉淀，保留上清液冰浴5min。

0℃，5000r/min，离心10s。

保留沉淀用裂解缓冲B液104μL重悬，冰浴2min。

0℃，12000g，离心15min。

保留上清液，取1μL用考马斯亮蓝染色法测定核蛋白浓度。

其余上清液分装，-70℃保存备用。

凝胶迁移率变动电泳分析法具体步骤参考　文献［1］。

　　逆转录-聚合酶链反应检测肺组织中ICAM1mRNA变化总RNA的提取参照Invitrogen公司的Trizol试剂说明书进行。

引物的设计与合成按照文献公布的Genebank上小鼠、βActin和ICAM1cDNA序列，借助于PrimerPremier生物设计它们各自特异的引物，委托上海博亚生物技术有限公司合成。

内参照βActin扩增片段长度701bp：

正义：

5′gccaaccgtgaaaagatga3′，反义：

5′gccaggatagagccaccaat3′。

ICAM1扩增片段长度433bp：

正义：

5′aacgacgcttcttttgctc3′，反义：

5′ctctggcggtaataggtgtaa3′。

RTPCR采用二步法：

第一步逆转录：

反应体系为μL%DEPC灭菌三蒸水中加入总RNA4μL,Oligo（dT）18μL,混匀后在65℃水浴中变性10min,冰浴中再加入5×MMLVRT缓冲液5μL,dNTP（10mmol/L）　μL,50U/μLRNasin　μL,最后加入200U/mLMMLV逆转录1μL,共25μL；反应条件42℃1h,95℃5min。

第二步多聚酶链反应：

反应体系为三蒸水μL、10×ExTaq酶缓冲液μL、dNTP（mmol/L）2μL、对应的一对引物各加μL、cDNA3μL、ExTaq（5U/μL）μL，共25μL。

PCR反应参数：

首先94℃5min进行预变性，接下来进行变性、延伸、退火循环，再72℃10min作最后延伸。

琼脂糖凝胶电泳观察结果和像分析：

配制1%琼脂糖凝胶，取PCR产物5μL与6×上样缓冲液1μL混匀后加入凝胶梳孔5V/cm电压下电泳30～40min后。

Gel100凝胶成像系统紫外灯下观察电泳结果和摄影，并用其自带的Quantity软件进行光密度分析，分别计算出ICAM1与βActin的光密度积分值之比作为ICAM1mRNA表达的相对表达量。

　　数据及处理计量资料用表示，统计软件进行正态性检验（normalitytest）及方差齐性检验（homogentyofvariancestest）,以P＜为差异有显着性。

　　2结果

　　各组STAT1DNA结合活性变化的变化

　　EMSA测定显示生理盐水组的肺组织中STAT1DNA结合活性较低；造模后8h开始升高，与生理盐水组相比差异具有显着性；24h时STAT1DNA结合活性稍下降；第48h时又再上升，第96h时达到最高峰，第7d时活性有所减弱，但仍高于生理盐水组；经特异性与非特异竞争试验证明，加入50，100倍未标记探针电泳带减弱，而加入非竞争探针对其影响不大。

　　表1不同时间点的STAT1结合活性变化

　　Tab.1ActivityofSTAT1DNABindinginvarioustimepoints

　　注：

0h组即NS对照组；与NS组比：

*P＜，**P＜

　　ICAM1mRNA表达变化

　　RTPCR检测结果表明，生理盐水组的肺中少量表达ICAM1mRNA，造模后8h开始升高，与生理盐水组比较差异有显着性，96h时达到最高峰，7d时活性有所减弱，但仍高于生理盐水组。

　　表2不同时间点ICAM1mRNA表达的变化

　　ResultsofICAM1mRNAexpressionindifferenttimepoints

　　与0h组比较:

**

　　control；mg/LLPS；mg/LLPS；mg/LLPS；mg/LLPS；mg/LLPS；LineM：

Marker

　　图1不同时间点ICAM1mRNA表达的变化

　　ResultsofICAM1mRNAexpressionindifferenttimepoints

　　3讨论

　　支气管哮喘是一种慢性气道非特异性炎症性疾病。

随着研究的深入,人们越来越重视细胞信号传导转录途径对哮喘的作用。

STAT1是连接多种细胞膜受体与选择性效应器之间信号转导的主要蛋白质，在细胞因子调节　中起着重要作用。

细胞因子通过JAK/STAT途径激活STAT而诱导目的基因表达。

　　研究发现在支气管哮喘时存在STAT信号传导途径的异常，在气道炎症时支气管上皮细胞存在STAT1途径的上调，同时支气管肺泡巨噬细胞缺乏STAT1的活化及表达［2］。

HierholzerC等发现与健康对照组比较哮喘患者的气道上皮细胞存在STAT1的异常活化［3］。

李国平等［4］发现哮喘豚鼠气道上皮细胞STAT1的活化与过度表达与嗜酸性粒细胞聚齐增多密切相关。

SampathD等用电泳泳动度移动分析法、免疫沉淀、免疫印迹法研究标准对照组、慢性支气管炎、哮喘组发现上皮细胞STAT1磷酸化与非磷酸化之比为20∶1,提示哮喘存在选择性支气管上皮细胞STAT1的活化,并且Henricks试验认为,支气管上皮细胞STAT1的选择性活化及过度表达与哮喘病情加重有关［5］。

本研究利用EMSA方法证实了小鼠哮喘病模型中肺组织存在大量具有DNA结合活性的STAT1，它标志着基因转录的关键步骤已启动。

并且与生理盐水对照组相比，其活性明显增高，活性高峰时间为第96小时，7d时活性有所下降，但与生理盐水组比较差异有显着性。

　　STAT1的激活可产生类似某些细胞因子的作用。

哮喘过程中，细胞因子信号传导途径存在异常导致STAT1的活化。

Sampath等［5］研究发现STAT1的活化导致依赖STAT1的免疫应答基因表达,包括ICAM1等异常表达。

而且,STAT1活化水平与ICAM1表达呈正相关。

同时,ICAM1的表达异常导致淋巴细胞聚集增多,从而加重炎症反应。

黏附分子作为一类介导细胞与细胞间或与基质间相互接触和结合的分子，在各种炎症的发生、　过程中起到关键的作用，从而成为抗感染治疗的靶子，也是目前哮喘治疗的一个目标。

本研究通过RTPCR方法，研究了该模型中ICAM1mRNA的表达，也发现模型组与对照组中存在明显的差别，在正常对照组很少表达甚至不表达ICAM1，而模型组的表达则明显增加。

　　综上所述，卵蛋白的小鼠哮喘模型STAT1是持续活化，与检测的结果一致，而且活性呈动态的变化过程。

ICAM1mRNA的表达在该模型中也明显增加，其动态变化的过程与STAT1活性变化有着良好的相关性，提示它的表达受STAT1调控。

因此通过阻断STAT1来治疗哮喘具有理论基础，可能有　前景。

【参考　文献】

　　［1］FRIEDMG．MeasurementofprotnDNAinteractionparametersbyelectrophoresismobilityshiftassay［J］．Electrophoresis，1989，10（5-6）：

366-376.

　　［2］SCHINDLERCW.SeriesintroductionJAKSTATsignalinginhumandisease［J］.JClinInvest,2002,109（9）:

1133-1137.

　　［3］HIERHOLZERC,KALFFJC,BILLIARTR,etal.ActivationofSTATprotnsinthelungofratsfollowingresuscitationfromhemorrhagicshock［J］.ArchOrthopTraumaSurg,1998,117（6-7）:

372-375.

　　［4］李国平,熊瑛,刘志刚,等.支气管哮喘豚鼠气道上皮细胞信号转导子与转录活化因子1表达及其对气道炎症的调控［J］.中华结核和呼吸杂志,2004,27（5）:

306-310.

　　［5］SAMPATHD,CASTROM,LOOKDC,etal.Constitutiveactivationofanepithelialsignaltransducerandactivatoroftranscription（STAT）pathwayinasthma［J］.JClinInvest,1999,103（9）:

1353-1361.