人类胚胎干细胞基础培训教材0.docx
《人类胚胎干细胞基础培训教材0.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《人类胚胎干细胞基础培训教材0.docx（24页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。
人类胚胎干细胞基础培训教材0
人类胚胎干细胞基础技术
高级培训班
2010-12
1.
绪论
本操作手册将为您详细介绍人胚胎干细胞/iPS细胞培养的基础知识、技术细节及相关的产品信息。
目的是为了让您更好地培养您购买的细胞，请按照此手册进行培养操作直至获得可靠的冻存细胞。
上海斯丹赛生物技术有限公司专业提供各类胚胎干细胞/iPS细胞及成套产品服务，为您的干细胞研究提供一站式解决方案。
2.
饲养层细胞的制备
材料与仪器
♦成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01
♦胰酶，货号M-005-1
♦成纤维细胞冻存液（2x），货号EFFM-01
♦基质胶（Matrigelmatrix），BDPharmingen，货号356235
♦CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01
♦T25透气培养瓶，NUNC，货号156367
♦T75透气培养瓶，NUNC，货号156499
♦2ml移液管，NUNC，货号159617
♦5ml移液管，NUNC，货号159625
♦10ml移液管，NUNC，货号159633
♦15ml离心管，货号366036
♦50ml离心管，货号373660
♦冻存管，NUNC，货号377267
♦Thermo-FisherFinnpipetteF3移液器和灭过菌的枪头
♦生物安全柜，货号
♦CO2培养箱，Thermo，HERAcell150i
♦电子计数器，millipore，货号PHCC00000
♦电动移液器，ThermoScientificFinnpipetteC1，货号4580800
♦低速离心机，ThermoScientificCL10
♦液氮罐，Thermofisher，货号CN50900
2.1从胎鼠获得小鼠胚胎成纤维细胞（MEF）
1.拉断颈椎处死怀孕12-13天的CF-1小鼠，浸入70％的酒精中消毒。
2.将小鼠放在超净台无菌的解剖盘中，在腹中线处做一横向切口。
3.剪开的皮肤拉向切口的上下两侧，提起腹膜，将其剪开，充分暴露腹腔。
4.找出子宫，一只手用无菌钝口镊子轻轻提起子宫，另一只手持无菌镊子小心分离子宫周围的结缔组织。
当两侧子宫都与其相连的组织分离好后，用剪刀将左右两侧的子宫在输卵管与子宫角的衔接处剪下，小心剪下子宫的联体部分，置于无菌的60mm培养皿中。
5.用无菌的剪刀在子宫头与子宫尾分别剪去输卵管及子宫角部分。
6.将子宫置于15ml离心管中，用10mlPBS洗三遍。
7.用尖镊子撕开子宫壁和胎膜，取出胎鼠，放在新的培养皿中。
8.用8mlPBS将胎鼠洗三遍。
9.用灭菌的眼科剪刀去除胎鼠的胚囊，释放胚胎，并胚胎计数。
10.将胚胎移到干净的培养皿中，PBS洗三次。
11.用镊子小心的去除胚胎的头和肝脏，PBS洗三次。
12.将胚胎转移至新的培养皿中，用无菌剪刀将组织充分剪碎，加入0.25％胰酶同时吹打几分钟使其消化均一并彻底酶解。
13.用同样体积的MEF完全培养基中和胰酶。
14.一个T75瓶加10mlMEF完全培养基，按照每2-3个胚胎一个T75瓶，将已消化的胚胎加入培养瓶中，放在5％CO2培养箱中培养，培养瓶注明细胞名称，代数及日期。
2.2MEF的传代
1.将T75瓶中的MEF培养基吸出。
2.加入大约3ml胰酶，于37℃的CO2培养箱中放置3-5分钟
3.取出瓶子，轻轻晃动，可以看见白色的细胞层开始从瓶子的底壁掉落。
确保瓶盖是拧紧的。
用手掌根轻拍瓶侧3-5次。
在灯下观察细胞是否已从瓶子上脱落。
4.加入同等体积（3ml）的MEF培养基，混匀，吹打几次以形成单细胞悬浮液。
▲Note:
这一培养基是包含血清的，将会完全抑制胰酶的活性。
5.补加42mlMEF培养基到瓶子中，使总体积达到50ml，混匀。
6.将上述细胞悬浮液均分至5个新的T75瓶子中，每瓶10ml。
7.放在5％CO2培养箱中培养，逐日观察。
2.3MEF的冻存
1.吸去培养液，加3ml0.25％胰酶至完全覆盖瓶底（以T75为例）。
2.CO2培养箱中孵育3-5分钟，不时轻拍瓶壁，使细胞层脱落。
3.加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，吹打混匀。
4.将其转移至15ml离心管，用电子计数器进行细胞计数后，以1000rpm的速度离心5分钟。
5.移去上清，用少量新鲜的MEF培养液重悬细胞沉淀。
6.缓慢加入等量的MEF细胞冻存液（2x）并混匀。
7.分装上述细胞悬液于2ml冻存管中，每管0.25ml。
8.在冻存管上注明细胞名称，代数，数目，冻存时间。
9.将冻存管放到冻存盒中，-80℃冰箱过夜。
10.最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。
2.4MEF的失活
1.MEF传代到3－5代时，当细胞铺满培养瓶后（以T75为例），加3ml0.25％胰酶，放入37℃的CO2培养箱孵育3-5分钟。
2.加入同等体积的MEF培养液中和胰酶，用移液枪吹打几次以形成单细胞悬浮液。
3.将所有细胞悬液混合到一个50ml离心管中，补加适量新鲜的MEF培养液。
4.取0.5ml上述细胞悬液，转移至新的15ml离心管中，用4.5ml培养液稀释，混匀。
5.用电子计数器计数细胞。
6.将原来的50ml离心管封口，使用gama射线辐照仪，50－80戈雷辐照。
7.辐照完后，以1000rpm的速度离心5分钟。
8.移去上清，用适量新鲜的MEF培养液重悬细胞。
用于培养人胚胎干细胞的饲养层细胞标准浓度是∼30,000cells/cm2。
按照此标准铺板。
具体铺板步骤请见3饲养层细胞的准备。
对于暂时不用的细胞，将其冻存，需要时复苏。
具体冻存步骤请见2.3MEF的冻存。
3.
饲养层细胞的准备
材料和仪器
♦CF-1小鼠胚胎成纤维细胞（MEF），货号MEF-CF1-01
♦成纤维细胞完全培养基，货号EFM-01
♦基质胶（Matrigelmatrix），BDPharmingen，货号356235
♦CO2培养箱，Thermo，HERAcell240
♦Thermo-FisherFinnpipetteF3移液器和灭过菌的枪头
♦T25透气培养瓶，NUNC，货号156367
♦2ml移液管，NUNC，货号159617
♦5ml移液管，NUNC，货号159625
♦10ml移液管，NUNC，货号159633
♦电动移液器，ThermoScientificFinnpipetteC1，货号4580800
3.1加入足量的基质胶均匀铺到瓶（或孔板或皿）底部，以能覆盖全部底部为准，譬如T25透气培养瓶以超过0.5ml为宜。
3.237℃培养箱放置至少30min。
3.3从培养箱中取出瓶（或孔板或皿），轻轻推送板子将未被基质胶覆盖的地方再次覆盖，然后立即吸弃基质胶。
3.4加入适量成纤维细胞完全培养基（37℃预孵育超过10min），譬如T25透气培养瓶以加入4ml为宜。
3.5从液氮中取出冻存的失活过的MEF细胞，立即投入37℃水浴中，迅速解冻（1min之内）。
3.6根据预实验将相应数量的饲养层细胞加到之前已经准备好的瓶（或孔板或皿）中，混匀。
推荐的饲养层细胞密度为3万cells/cm2。
Point
Ø饲养层细胞需在ES/iPS细胞传代前两至三天准备。
Ø饲养层细胞的密度最适宜是80－90％,太密或是太稀疏都容易使干细胞分化。
Ø请在铺被前先做预实验估算细胞的复苏存活率，以一个T25培养瓶计算，若存活率为90%，则铺入的细胞量应为83.3万。
▲Note:
饲养层细胞铺了10天之后推荐不再使用。
Table1培养容器的类型和需要的基质胶的体积
培养容器的类型
基质胶体积
24-well
0.1-0.2ml
12-well
0.2-0.4ml
6-well/35mm
0.4-0.5ml
60mm/T25Flask
0.5-1ml
100mm/T75Flask
2-3ml
Table2培养容器的面积和需要接种的MEF细胞悬浮液的体积（接种细胞的浓度为1.5×105cells/ml）
培养容器的类型
细胞悬浮液的体积
24-well
0.4ml
12-well
0.8ml
6-well/35mm
2ml
60mm/T25Flask
5ml
100mm/T75Flask
15ml
▲Note:
上述细胞接种密度按人类ES/iPS细胞培养的标准计。
4.
ES/iPS细胞的复苏
材料和仪器
♦人类ES/iPS细胞（SiDSH-01,SiDSH-03），货号HIPS-01/03
♦人类胚胎干细胞完全培养基，货号HESM-01-500
♦CO2培养箱，Thermo，货号HERACell240
♦Thermo-FisherFinnpipetteF3移液器和灭过菌的枪头
♦电动移液器，ThermoScientificFinnpipetteC1，货号4580800
♦T25透气培养皿，NUNC，货号156367
♦5ml移液管，NUNC，货号159625
♦15ml离心管，NUNC，货号366036
4.1解冻人ES/iPS细胞，从液氮中取出冰冻的人类ES/iPS细胞冻存管，立即投入37℃水浴中快速的旋转以迅速解冻（控制在1min之内）。
▲Note:
水不要淹没瓶盖
4.2当只有一片冰晶存在时，从水中取出冻存管。
用消毒酒精棉将冻存管外壁擦拭一遍，以去除水缸中的微生物。
4.3将细胞转移到一个预装有2ml人类胚胎干细胞完全培养基的15ml离心管中，混匀。
200×g（1000rpm）,离心5分钟。
4.4吸弃上清液。
用4ml的人类胚胎干细胞完全培养基重悬细胞沉淀。
4.5转移悬浮液到一个预铺有饲养层细胞的T25瓶中，补加人类胚胎干细胞完全培养基至总体积为5ml。
4.6将瓶放入37℃的CO2培养箱中，观察细胞每天的生长情况。
Point
Ø复苏的第二天无需更换培养液，从第三天起每天更换新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基。
Ø复苏后第5天左右可以看见微小的克隆出现，之后逐渐长大。
Ø复苏后第10-12天传代，具体情况视ES细胞生长情况而定。
5.
ES/iPS细胞的传代
材料和仪器
♦人类胚胎干细胞培养液（含bFGF货号HESM-01-500；不含bFGF货号HESM-02-500）
♦Ⅳ型胶原酶（货号M-001）
♦已经包被好饲养层细胞的培养瓶/板
♦Thermo-FisherFinnpipetteF3移液器和灭过菌的枪头
♦T25透气培养皿，NUNC，货号156367
♦5ml移液管，NUNC，货号159625
♦15ml离心管，NUNC，货号366036
♦电动吸引器
Point
Ø当出现以下情况之一即可以进行细胞传代：
1．MEF滋养层细胞生长超过两周。
2．克隆太大，或太密集。
3．当培养的ES克隆中出现越来越多的分化。
人的ES细胞传代（以T25培养瓶为例）
5.1从培养瓶中吸出旧的人胚胎干细胞培养液
5.2立即加入3-4ml的Ⅳ型胶原酶到瓶中，温柔的摇晃培养瓶使之覆盖到所有的细胞。
▲Note:
Ⅳ型胶原酶需在37度预热。
5.3将T25瓶重新放回37度培养箱中，放置约20min－30min。
5.4消化期间可以处理预铺了饲养层细胞准备用来传代的新的培养瓶，处理如下：
吸弃里面的成纤维细胞完全培养基，加入1ml人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF）洗涤feeder（只要将瓶底盖过），吸弃，然后加入4-5ml新的人类胚胎干细胞完全培养基，以备传代。
5.5待克隆消化下来后，取出培养瓶，将瓶中液体连同脱落的克隆转移到15ml离心管里。
加入2ml的人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF），混匀。
5.6待干细胞团块沉降下来后，吸弃上清液。
5.7加入2ml新鲜的人类胚胎干细胞培养液（不含bFGF）洗涤细胞（即吹打重悬），待细胞沉降下来后，吸弃上清。
5.8加入2ml新鲜的人类胚胎干细胞完全培养基重悬细胞，并用移液枪吹打克隆到适合大小，然后根据自己需要按比例传代。
Point：
Ø在消化过程中，最好每隔10min拿出来观察一下，看是否已经开始消化。
随着克隆的消化，克隆边缘部分卷起，当克隆大部分卷起，直至轻轻晃细胞就会脱落时，表明消化充分。
注意：
消化时间约为20－30min，根据经验，这一时间段可以将未分化的干细胞克隆消化下来，而分化的克隆就不会消化下来，所以，消化时间不宜过长，这样可以剔除分化的克隆。
而如果消化不充分，会导致传代后的细胞结块。
所以，要掌握好时间。
Ø如果细胞不易沉降，则可以1000－1200rpm离心30sec－1min使细胞沉降。
Ø传代比例通常为1：
6或1：
8。
Ø传代后的注意事项：
1．传代后的第一天，不需更换新的培养液，从第二天起，每天换液。
2．传代周期为6－7days，但要视细胞状态而定，传代可以改善细胞状态。
3．传代的前两至三天预铺feeder。
6.
ES/iPS细胞的冻存
材料和仪器
♦人ES/iPS细胞（生长到可传代的状态，同上描述）
♦人胚胎干细胞培养基（货号：
HESM-01-500）
♦Ⅳ胶原酶（货号M-001）
♦人胚胎干细胞冻存液（2x）（货号：
HESFM-01）
♦15ml离心管，NUNC，货号366036
♦液氮罐，Thermo，货号CN50900
♦冰
♦镊子
♦ThermoF3移液器和灭过菌的枪头
♦2ml冻存管，NUNC，货号377267
♦冻存管架，NUNC，货号376589
Point：
Ø人的胚胎干细胞可以在液氮中长期冻存。
Ø为了得到人类胚胎干细胞的高存活率，在开始冻存步骤之前，准备好所有的材料和仪器。
冻存管在使用之前应该在冰上预冷，且应该事先将必须的信息（如细胞的名称，传代次数，细胞数目，冻存日期等）标记在管子的标签上。
冻存步骤（以T25瓶为例）：
6.1当细胞生长良好时，消化细胞（具体步骤同上述传代过程）。
6.2将消化下的细胞洗涤两次。
6.3用2ml新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞并吹打至传代大小。
6.4待克隆沉降下来后，吸弃上清。
6.5加入0.25ml新鲜的人胚胎干细胞培养基重悬细胞
6.6加入0.25ml人胚胎干细胞冻存液（2x），快速混匀。
6.7将上述0.5ml细胞悬液转移至2ml冻存管中。
6.8迅速将冻存管放入冻存盒中，-80℃冰箱过夜。
6.9最后将冻存管转移至液氮罐中以便长期保存。
7.
人类胚胎干细胞的无滋养层培养
材料与仪器
7.1人类胚胎干细胞条件培养基（CM）的收集
1.配制人类胚胎干细胞培养液。
2.培养瓶加入适量明胶（覆盖瓶底即可），放入5％CO2培养箱孵育30分钟左右。
3.吸掉明胶，将辐照过的饲养层细胞按照55,000cells/cm2浓度铺板。
4.待细胞贴壁后，换人类胚胎干细胞培养液培养液（按照0.5ml/cm2）。
5.24小时左右开始收集培养液，之后每天收集，可持续收集7-10天。
6.CM可存放在-20℃冰箱中一个月。
7.2无饲养层人胚胎干细胞系的培养及传代
1.在培养瓶中加入适量matrigel（覆盖瓶底即可）放入培养箱孵育1小时左右。
2.吸去matrigel，将饲养层培养的人胚胎干细胞传代洗涤后，最后细胞转移到此培养瓶中，加CM培养。
3.在人胚胎干细胞克隆生长5天左右传代。
吸去培养液，加dispase5％CO2培养箱消化至克隆大部分脱壁。
4.加适量培养液，用移液管轻轻吹打使克隆脱壁。
5.将细胞悬液转移到15ml离心管中，用移液管吹打几次使细胞克隆至适当大小。
6.吸取适量混匀的悬液至小离心管中，离心沉淀，用胰酶消化成单细胞，加培养液中和，细胞计数。
7.以1000rpm的速度离心5分钟。
8.吸去上清，加CM培养液重悬细胞。
9.按照∼90,000–170,000cells/cm2将细胞接种到已铺好matrigel的培养瓶中，补加适量CM。
轻轻晃动培养瓶，使克隆均匀分布在瓶底，放入5％CO2培养箱培养。
8.
拟胚体的形成
材料与仪器
拟胚体（embryonicbody,EB）来源于多能干细胞，且由多种分化的细胞类型组成。
它可以模拟胚胎早期发育的过程，是一种很好的在体外研究早期发育中细胞和分子间作用的模型。
拟胚体的制备：
将得到的iPS细胞系扩增培养后，按正常传代步骤消化下来，洗涤去除MEF细胞，将细胞吹打至小团块（比正常传代大小再小一些），然后悬浮培养在MEF培养液中。
3天后换第一次液，之后每2-3天换液一次，直至收集。
收集EB后用TRIZOL裂解，抽提RNA,反转录，通过real-timePCR的方法（见real-timePCR检测的具体protocol）检测各胚层marker的表达情况。
9.
胚胎干细胞全能性的鉴定
胚胎干细胞全能性的鉴定主要包括以下几个方面：
●碱性磷酸酶活性检测
●干细胞表面marker的免疫染色检测
●干性因子的去甲基化分析
●干细胞内源基因的表达分析
●端粒酶活性检测
●核型检测
●拟胚体形成
●畸胎瘤形成实验
下面分述各种鉴定的方法以及详细的操作步骤：
9.1碱性磷酸酶活性检测
材料
✓PBSbuffer
✓4%Paraformaldehyde
✓AlkalinePhosphataseDetectionKit：
Sidansai，货号AP-1kit
✓1xRinseBuffer（e.g.TBST:
20mMTris-HCl,pH7.4,0.15MNaCl,0.05%Tween-20）
碱性磷酸酶染色步骤：
a.AspiratemediaandfixESoriPScellswithafixative（e.g.4%ParaformaldehydeinPBS）for1-2minutes.Note:
Donotoverfix.Fixingcellslongerthan2minuteswillresultintheinactivationofalkalinephosphatase.
b.AspiratefixativeandrinsewithPBSbuffer.
c.Aspirateandrinsewith1XRinseBuffer.DONOTallowwellstodry.
d.PreparereagentsforAlkalinePhosphatasestaining（BufferA:
BufferB:
BufferC=100:
38:
28）
e.Addenoughstainsolutiontocovereachwell（e.g.0.5mLforawellofa24-wellplate）.Incubateindarkatroomtemperaturefor15minutes.
f.Aspiratestainingsolutionandrinsewellswith1XRinseBuffer.Covercellswith1XPBStopreventdryingandthencountthenumberofcoloniesexpressingAP（redstemcellcolonies）,versusthenumberofdifferentiatedcolonies（colorless）.
9.2干细胞表面marker的免疫染色检测
可用的试剂盒包括：
货号
包装
所鉴定的抗体
A-P1-1KT
10test
Oct4，Sox2，Nanog，SSEA4，Tra-1-60，Tra-1-81
A-P2-1KT
10test
Oct4，Sox2，Nanog，SSEA1，SSEA3，SSEA4，Tra-1-60，Tra-1-81
A-P3-1KT
10test
Oct4，Nanog，Sox2，SSEA1
表达于人类ES/iPS细胞中的标志物包括：
Stage-specificembryonicantigen-3（SSEA3）
Stage-specificembryonicantigen-4（SSEA4）
Tumor-relatedantigen-1-60（TRA-1-60）
Tumor-relatedantigen-1-81（TRA-1-81）
OCT4
SOX2
Nanog
表达于小鼠ES/iPS细胞中的标志物包括：
Stagespecificembryonicantigen-1（SSEA-1）
OCT4
SOX2
Nanog
免疫染色步骤：
1.首先把细胞固定在4％多聚甲醛（4％PFA）中，室温放置30min;
2.在无水乙醇中浸泡两次，每次20min（或3次，10min/次）
注意：
此步骤仅限于核蛋白，如Oct4，Nanog或Rex1等，不能用于膜蛋白如SSEA和Tra等
3.将上述溶液吸干，先用1XPBS洗涤一次，再用抗体稀释液（0.2%BSA和0.1%TritonX100溶于PBS）洗涤两次；
4.（此步骤可不操作，进行此步骤是为了更好的封闭非特异反应）用封闭液（含1%BSA+4%normalserum+0.4%TritonX100的PBS溶液）封闭细胞；
5.将一抗稀释在抗体稀释液中，加到样品上，室温2h或4度放置过夜；
6.用PBT（0.1%TritonX100）洗涤细胞3－5次；
7.将二抗稀释在抗体稀释液中，并加到细胞样品上，室温放置1h;
注意：
从步骤7开始，样品要注意避光！
8.用PBT洗涤3次；
9.将DAPI（1mg/mlinPBS）母液以1:
1000用PBS稀释,室温放置5min;
OR:
将JASMIN（hochest）母液以1:
1000用PBS稀释，室温放置5min;
10.用PBS洗涤5min,两次；
11.再用4％多聚甲醛室温固定30min；
12.最后再用PBS洗涤两次，每次5min.
9.3干性因子的去甲基化程度分析
BisulphiteSquencing法分析甲基化状态
（一）Bisulphite处理基因组DNA
1、将基因组DNA置于冰上，液体石蜡冰上预冷。
2、给每个样品准备6个Ep管，每管加300ul液体石蜡。
3、准备样品：
1）每个样品取210ng的DNA，稀释到21ul。
2）新配2M的NaOH（用超纯水配，1.6gNaOH/20ml水），每管样品中加4ul（使之终浓度为0.3M）NaOH。
3）50℃，15min。
4、准备2％低熔点argrose：
0.02g/ml，用双蒸水配。
100℃5min，之后置于50℃待用。
5、向3中的DNA液中加入50ul2％低熔点argrose，混匀（保持50℃）。
6、吸取上述argose和D
升级会员 