蛋白表达纯化实验步骤.docx

蛋白表达纯化实验步骤.docx

《蛋白表达纯化实验步骤.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《蛋白表达纯化实验步骤.docx（11页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

蛋白表达纯化实验步骤

蛋白表达纯化实验步骤（待改进）

1、取适当相应蛋白高表达的动物组织提total-RNA。

2、设计蛋白表达引物。

引物要去除信号肽,要加上适当的酶切位点和保护碱基。

3、RT-PCR,KOD酶扩增获取目的基因cDNA.

4、双酶切,将cDNA.克隆入PET28/32等表达载体。

5、转化到DH5α感受态细菌中扩增,提质粒。

6、将质粒转化入表达菌株,挑菌检测并保种。

表达菌株如Bl21（DE3）、Rosettagami（DE3）、

Bl21codon（DE3）等。

7、蛋白的诱导表达。

1）将表达菌株在3mlLB培养基中摇至OD=0.6左右,加入IPTG,浓度梯度从25μM

到1mM。

37度诱导过夜（一般3h以上即有大量表达）。

2）SDS-PAGE电泳检测目的蛋白的表达。

注:

目的蛋白包涵体表达量一般会达到菌体

蛋白的50%以上,在胶上可以看到明显的粗大的条带。

3）将有表达的菌株10%甘油保种,保存1ml左右就足够了,并记录IPTG浓度范围。

甘油是用0.22μm过滤除菌的,储存浓度一般是30%-60%,使用时自己计算用量。

4）用上述IPTG浓度范围的最低值诱导10ml表达菌,18度,低转速（140-180rpm）,

诱导过夜作为包涵体检测样品。

注意:

1.如果表达的蛋白对菌体有毒性,可以在加IPTG之前的培养基中加入1%的葡萄糖用来抑制本底表达。

葡萄糖会随着细菌的繁殖消耗殆尽,不会影响后面的表达。

2.

保种可以取一部分分成50μl一管,每次用一管,避免反复冻融。

8、包涵体检测。

方案见附件2

9、如有上清表达,则扩大摇菌。

1）取保种的表达菌株先摇10ml,37度,300rpm摇至OD>=1.5,约5h左右,视菌种

的活性而异,也可过夜摇菌。

2）将上一步中的8ml加入300ml培养基中37度,250rpm摇至OD=1.0左右（约

2.5h~3h）,然后加IPTG（浓度同包涵体检测中使用的浓度。

）注:

菌液浓度要适当

的浓一些,否则第二天收集不到足够的菌体,因为低温低转速细菌生长非常缓慢。

拿起锥形瓶对光摇动,看到有大量云雾状菌体即可。

另一方法是,将手指放在瓶底晃动,看不清手指为宜,不过此法宜受气泡影响。

3）过夜摇菌,使用包涵体检测的温度（18°左右）,转速140rpm左右。

4）将菌液6000rpm,4min,4度离心收集菌体。

加入20mMPBS,洗一遍后用平衡缓

冲液重悬。

每250ml菌液用30ml到50ml平衡缓冲液,视菌液的浓度而定。

可用4支50ml的离心管同时离心,但是,离心管要重复使用,用完后洗净保存。

10、超声波裂解。

1）用6mm变幅杆,35%功率,3.5s工作,7s休息,50min即可。

注意:

1.要冰浴。

2.要随时观察裂解情况以防意外。

3.要将探头探入到溶液中下部,尽量不要打出大量气泡。

一般溶液量比较大的时候不会出现大量气泡。

4.正常声音为:

孜孜声,尖锐刺耳的声音表明探头位置不对或者功率太大或者探头

松动等原因,要与时调整。

溶液由浑浊变清透,由粘稠变不粘稠表明裂解完成（后面3000转离心时,如果沉淀少说明裂解的好）。

5.超声波破碎仪工作30分min要休息5min（即关闭总电源开关）。

注意:

1.如果纯化的蛋白较易被蛋白酶降解,在超声裂解之前要加蛋白酶抑制剂（PMSF）,PMSF工作浓度为1%。

2.如不能判断是否裂解完全,就按上述条件裂解

60分钟,60分钟足够裂解。

11、取得上清

1）将破碎好的溶液收集到50ml离心管中。

10000rpm,15min,4°离心。

沉淀为包涵

体、细胞碎片和未破碎的细胞。

轻轻的将上清倒出,尽量不要倒出沉淀。

（此时可以测量一下pH值,pH值最好在7.5左右。

平衡buffer的pH是7.8左右,裂解后上清就会在7.5左右。

）

12、纯化上清---摸洗脱条件。

1）镍柱处理。

将1ml镍柱吸入空层析管中,待其中的液体流完后加入平衡缓冲液3ml。

2）将10ml上清加到已经平衡过的NI柱上,并将过柱的样品重复上样3次。

（若是流

速慢可以在柱子下面加一个针头,或者用1ml的枪将胶体吹散。

）取20μl过柱后的样品,以备跑胶。

3）分别加20mM、40mM、60mM、80mM的咪唑梯度来洗脱杂蛋白。

每个梯度分别

的上样量为4ml、2ml、2ml、2ml。

每个次上样的液体分前面1ml和后面1ml分别收集入EP管中,以备跑胶。

注意:

理论上是要将收集的溶液测量280nm处的吸光度,直到吸光度为零时再进行下一个梯度的洗脱。

实际上测不到零,怎么都会有一点的,上面说的量已经做够洗脱了。

4）加ElutionBuffer将目的蛋白洗脱。

上样量为4.5ml（将前面的0.5ml单独接入EP

管,再将后面的4ml接入另外两个EP管）,留跑胶样品。

5）加MES将NI柱重生。

MES加10ml,流完后再加10mlMiliqH2O。

流完后保存于2

倍体积的20%乙醇中,镍柱至少能重复利用6次。

（尿素可能对NI柱有损伤。

）注意:

所有溶液使用前都要确定其pH是否正确,pH对挂柱与洗脱影响较大。

镍柱所用溶液MES的ph=5.0,其余EquilibrationBufferpH=7.8,上清pH=7.5,WashBufferpH=7.0,ElutionBufferpH=7.2。

13、跑胶验证。

1）跑2块0.75mm的PAGE胶,把所有的样品都加上去,注意两块胶的浓分离比要相

同两块胶才会比较一致。

2）跑胶顺序:

负对照、正对照、上清、过柱样品、W1、W2、W3、W4、W5、W6、

W7、W8、W9、E1、E2、MES

3）300V快速压胶5min左右,160V分离样品50min左右。

（也可以300V,30min,只是

图没有160V好看。

）

4）考马斯亮蓝染色。

一般染色2h即可。

5）脱色。

先用脱色剂1脱15min,再用脱色剂2脱过夜。

14、纯化上清---收集目的蛋白

1）将重生的镍柱再次平衡（即加EquilibrationBuffer3ml）。

2）重复步骤12中的操作,只是wash时只用步骤12中摸好的咪唑浓度洗。

15、跑胶验证。

同步骤13这次胶图要跑的漂亮一点（用160V）,保存好。

16、透析。

1）配制2L透析液（配方见附件1）,并放于-20度冰箱预冷但不要结冰。

2）透析袋（剪10cm即可）用透析袋处理液煮沸10min,用MILIQH2O充分洗净。

3）用透析夹将透析袋夹住（将透析袋折叠一下会夹的更牢）,将洗脱的蛋白样品加入其

中,置入提前预冷的500ml透析液（20mMPBS+50mMNaCl）中。

冰浴下轻微磁力搅拌20min后置入4°冰箱1.5h后换液。

透析3次即可。

注意:

用广口瓶装透析液,将广口瓶置于装有冰的2L大烧杯中。

冰浴以防活性降低。

17、浓缩。

1）将透析好的样品连同透析袋一起放在白色盒子中,用预冷的聚乙二醇2000固体包埋。

2）30min后将吸水后呈浆糊状的聚乙二醇去除,加入新的固体聚乙二醇。

3）每隔10min观察一次,一旦出现浑浊立即停止浓缩。

4）透析袋用完后,洗净,保存于20%乙醇中4°存放。

注意:

浓缩过度后会有白色小颗粒或絮状晶体出现,由于透析袋使溶液成薄层状,透明度较高,不易发现小颗粒或絮状沉淀,要看仔细。

如果看不到,可根据自己估计的蛋白量留1-2ml体积。

用透析液将透析袋表面的聚乙二醇洗掉,吸取其中的溶液分装后-20度保存。

18、超滤法浓缩、透析蛋白。

使用超滤法就可省去16、17两步。

1）将4mlElution得到的蛋白溶液加入超滤管中。

2）配平。

3）7400g,30min,4°离心,结束时4ml变为1ml左右。

浓缩4倍。

可根据需要选择

不同的离心时间,以达到不同的浓缩倍数。

可以几次的Elution液一起浓缩。

4）加入需要的蛋白储存液至4ml,离心。

重复操作可以使Elution液逐渐换为所需的蛋

白储存液。

蛋白储存液一般用20mMPBS+*mMNaCl或适当浓度和pH的tris-HCl

溶液。

如果蛋白有沉淀达不到预定浓度可以添加适当的甘油（1%-5%即可）助溶。

5）收集。

将溶液从超滤管中收集到EP管中,标记好储存液的成分,蛋白名称,蛋白

浓度（测量后）,制备日期。

注:

超滤管的使用方法见附件4

19、蛋白浓度测定。

见附件3

20、蛋白活性测试。

转染细胞测量荧光。

21、抗原处理。

蛋白与弗氏佐剂混合成油包水状。

22、注射兔子。

选择合适的注射方式和合适的免疫程序。

23、收集免疫血清。

提取抗体。

24、抗体效价评定。

附件1

所需溶液配方:

1）20mMPBS:

20mMsodiumphosphate,300mMNaClpH7.4

试剂名称NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCl

用量（g）1L0.59285.80219217.532

2）EquilibrationBuffer（平衡缓冲液）:

PBSwith10mM咪唑pH7.4

3）WashBuffer（清洗缓冲液）:

PBSwith25mM/50mM/75mM咪唑pH7.4

4）ElutionBuffer（洗脱缓冲液）:

PBSwith250mM咪唑pH7.4

5）MES（再生缓冲液）:

20mM2-（N-morpholine）-ethanesulfonicacid,0.1Msodium

chloride;pH5.0。

即0.3904gMES+0.5844gNaCl.

6）透析袋处理液:

2%（w/v）碳酸氢钠和1mmol/L（pH8.0）EDTA

7）透析液:

20mMPBS+50mMNaCl（2.92g）

试剂名称NaH2PO4-2H2ONa2HPO4-12H2ONaCl

用量（g）1L0.59285.8021922.92g

TIPS:

1—4的溶液可以一起配制。

先配10ml8M的咪唑。

再配1L的PBS,用500ml水将

试剂溶解,取两个50ml和一个150ml分别加到两个100ml瓶子和一个500ml瓶子中,作为WashBuffer、ElutionBuffer和EquilibrationBuffer,再向其分别加入适当体积的8M咪唑。

最后,定容。

WashBuffer、ElutionBuffer各配了100ml,EquilibrationBuffer配了300ml。

PBS配了500ml。

附件2

包涵体检测

1.摇10ml菌,加0.5%葡萄糖和相应抗性。

培养至OD600=0.5后离心加入新的培养基和相

应浓度的IPTG低温（16-25度）诱导过夜（也可不离心,在原来LB中直接加IPTG）。

在离心前取500μl菌液作为负对照,诱导完成后取500微升作为正对照。

正负对照不用超声波裂解,直接煮沸10min跑胶。

2.诱导完成后,用2mlEP管6000rpm,2min,4度,收集10ml菌液。

1.5mlPBS（50mM

PBS,300mMNaCl）重悬细菌。

3.裂解细胞。

用超声波破碎细胞直到悬液变清亮,一般15到30min。

裂解3s,停止6s,

裂解时冰上放置。

4.分离上清。

5000rpm,4min,4°除去未裂解的细菌和大的细菌碎片。

然后,10000rpm,

10min,4度。

取上清于新的1.5mlEP管中。

取其中的20微升于200微的EP管中,加5微5*SDSloadingbuffer混匀,煮沸10min。

5.重悬包涵体。

用1000微PBS震荡重悬包涵体,取20微于200微的EP管中加5微

5*SDSloadingbuffer,煮沸10min。

6.正负对照的收集。

离心收集正负对照菌体,0.5ml上清留下40μl,加入10μl5*SDSloading

buffer,煮沸10min裂解。

7.跑聚丙烯酰胺凝胶。

将正负对照与实验样品一起跑胶。

一般顺序是:

-,+,上清,包涵体.

附件3

蛋白浓度定量测试方案

1.将染色剂稀释。

稀释5倍,取4ml染色剂于50ml离心管中,加16mlmiliqH2O.充分溶解后用0.44μm的滤膜过滤于另50ml离心管中。

（此剂量可测4个样品。

）

2.牛血清白蛋白（BSA）标准品的制备

1）将冻干的BSA溶于去离子水中,溶解成浓度为1mg/ml,分装为400-500μl/支（可以

室温放置60天,-20度长期保存）。

2）将1mg/ml的BSA分别稀释成0.2、0.4、0.6、0.8mg/ml,各180μl,另外加一管水为

3.染色。

1）取1.5ml已过滤的染色剂分别加入13支（其中4支为待测样品）1.5mlEP管中。

4个

梯度各做一个重复,共8支,另外加1个样品（或1+n个样品）和1个blank,共10支EP管（或10+n支）,分别对应标记。

2）将30μl样品和30μl标准BSA与30μlH2O分别加入上述EP管中。

涡旋混匀。

3）室温孵育5min到60min。

5min后即开始测量,在60min内测完,越快越好,因为Absorbancewilincreaseovertime。

4.吸光度的测量。

600nm处测量,并记录吸光度。

注意:

1.blank是染色液加30微升的水。

2.从低浓度测量到高浓度。

根据混合液的颜色大致判断sample的浓度范围,据此决定sample的测量顺序。

5.比色皿的洗涤。

用100%乙醇浸泡洗涤。

6.标准曲线的制作。

利用excel工具取标准品的平均值制作线性回归标准曲线。

附件4.

4mlmillipore超滤离心管使用注意事项

1.用前用miliq水润湿。

2.4度预冷。

3.离心力不能超过7500g。

加速度设定为8.

4.离心时将离心管的两膜片竖直到与地面垂直的角度后开始离心,以使两膜所受的压力一

致。

5.使用完毕后,用miliq水洗净,加入1ml0.1NNaOH泡24h,后加入1ml20%乙醇保存。

如果要短期保存几天,也可加水浸泡。

附件5

聚丙烯酰胺凝胶的制备与使用方法

附件6.

包涵体蛋白的提纯

与提上清中所用试剂不同之处:

在EquilibrationBuffer、WashBuffer、ElutionBuffer中各加了6M尿素或盐酸胍。

尿素或盐酸胍用来溶解包涵体蛋白。

在裂解完后,离心时先3000rpm3min去除未裂解的细胞和大的碎片,再10000rpm15min离心,沉淀就是包涵体。

用加了6M尿素或盐酸瓜的EquilibrationBuffer溶解包涵体。

后面的步骤跟提上清蛋白一致,只是所用EquilibrationBuffer、WashBuffer、ElutionBuffer中都含有6M尿素或盐酸胍。

另外盐酸胍会与SDS结合形成沉淀,影响跑胶。

这里采用乙醇沉淀法来除去盐酸胍后跑胶。

如果要做包涵体,建议用尿素做,因为盐酸胍的毒性较大,必须除去,除去后蛋白可能就析出了。

尿素毒性相对较小,可以不用除去。

这样可以省去很多麻烦。

尿素对包涵体的溶解性不如盐酸胍好,较难溶解,可以用超声波破碎仪帮助溶解:

6mm变幅杆,15%功率,3s/6s,10min左右即可。

也可以加上1%---5%的甘油助溶。

甘油是加在EquilibrationBuffer中的。

另外,做包涵体可以直接37度快速摇菌,无需低温,加IPTG的时间可以提前到OD=0.6左右。

乙醇法淀蛋白跑SDS-PAGE

1、1.5mlEP管中加150μl蛋白溶液和1350μl100%乙醇,乙醇要-20度预冷,涡旋。

2、-20度放置10min。

4度,15000rpm,10min,小心弃去上清,尽量去干净。

此时管底可

见蛋白沉淀。

3、向管中加30μl1.5*SDS-loadingbuffer。

（这里蛋白溶液已经浓缩了5倍）。

4、上样,跑胶。

如有错误,敬请批评指正。

血清的提取

动物血采集后,室温自然凝固后立即4500g,10min离心,分离出血清。

抗血清保存有三种方法:

第一种是4℃保存,通常可保存3个月~半年,效价高时可保存一年左右;第二种是-20℃~-40℃低温保存,可保存5年左右,但需防止反复冻融;

第三种是真空冰冻干燥保存,可保存5~10年。

注:

耳缘静脉采血,为防止溶血请勿吸取流到外面的血,直接从静脉吸取的血液不会溶血。