EMSACHIP亚细胞定位.docx
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EMSACHIP亚细胞定位
EMSA
实验材料：
EMSA探针生物素标记试剂盒（20；1358）；化学发光EMSA检测试剂盒（100；1399）；正电尼龙膜（20；458）；细胞核蛋白提取试剂盒（50；462）；BCA蛋白浓度测定试剂盒（200；170）；压片暗盒（1个；138）；PMSF试剂（1g;118）
实验方法：
一、探针制备：
1.准备工作：
A.取出TdTBuffer（5X）、Biotin-11-dUTP和Ultrapurewater溶解，并置于冰浴上备用。
B.取出待标记的单链EMSA探针，用水稀释至1μM，并置于冰浴上备用。
如果待标记的EMSA探针为双链，95℃加热2分钟，然后立即放置到冰水浴中，使双链的EMSA探针转变为单链的探针，然后同样用水稀释至总的单链DNA浓度为1μM，即每条单链的浓度为0.5μM，相当于最初双链的EMSA探针浓度为0.5μM。
2.DNA探针的标记:
Ultrapurewater
29ul
TdTBuffer（5X）
10ul
待标记探针（1μM）
5ul
Biotin-11-dUTP（5μM）
5ul
TdT（10U/μl）
1ul
总体积
50ul
A.参考上表设置反应体系。
注：
对于双链的EMSA探针的标记反应，建议一次做两管，即总体积共100μl，以最终获得足够的生物素标记EMSA探针用于后续EMSA检测。
B.用枪轻轻吹打混匀，切勿vortex。
37℃孵育30分钟。
C.加入2.5μl探针标记终止液，轻轻混匀终止反应。
3.TdT的去除:
A.探针标记反应终止后，加入52.5μl氯仿-异戊醇（24:
1），vortex使有机相和水相充分混合以抽提TdT（说明：
静止后有机相和水相会很快分层）。
B.12000-14000g离心1-2分钟。
吸取上清备用。
上清即为被生物素标记的单链DNA探针。
4.探针的纯化（选做）：
通常为实验简便起见，可以不必纯化标记好的探针。
有些时候，纯化后的探针会改善后续实验的结果。
如需纯化，可以按照如下步骤操作：
A.对于100μl标记好的探针，加入1/4体积即25μl的5M醋酸铵，再加入2体积即200μl的无水乙醇，混匀。
B.-70℃至-80℃沉淀1小时，或-20℃沉淀过夜。
C.4℃，12,000g-16,000g离心30分钟。
小心去除上清，切不可触及沉淀。
D.4℃，12,000g-16,000g离心1分钟。
小心吸去残余液体。
微晾干沉淀，但不宜过分干燥。
E.加入50μlTE，完全溶解沉淀。
标记好的探针可以-20℃保存。
5.生物素标记探针标记效率的检测：
A.取5μlBiotin-ControlOligo（0.4μM），加入196μlTE，混匀，稀释成10nMBiotin-ControlOligo（作为标准品）。
取出适量10nMBiotin-ControlOligo，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
B.取3μl步骤3B所获得的生物素标记的DNA探针（100nM），加入27μlTE，混匀，稀释成10nM生物素标记的探针（作为待测样品）。
取出适量的10nM生物素标记的探针，依次稀释成5nM、2.5nM、1nM、0.5nM和0.25nM。
C.参考下面的表格，取一适当大小的带正电荷尼龙膜，在膜上做好相应标记。
对于经过梯度稀释的标准品和待测样品，分别取2μl滴加到膜上。
在膜上滴加标准品或待测样品时，请注意使液滴充分被膜吸收，在膜上形成一个湿的圆形小斑点。
说明：
如果条件许可，可以使用专门用于点杂交或狭缝杂交的设备进行探针标记效率的检测，探针的用量参考下表，浓度可以再稀释50倍，而所用体积可以相应放大50倍至100μl。
探针浓度
10nM
5nM
2.5nM
1nM
0.5nM
0.25nM
Biotin-ControlOligo
2ul
2ul
2ul
2ul
2ul
2ul
生物素标记的探针
2ul
2ul
2ul
2ul
2ul
2ul
探针量
20fmol
10fmol
5fmol
2fmol
1fmol
0.5fmol
D.滴加完所有的标准品和样品后，将膜室温晾干。
E.用紫外交联仪（UV-lightcross-linker）选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联30-45秒。
如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯（例如碧云天的手提紫外检测仪（EUV002）），距离膜5-10厘米左右照射1-5分钟。
也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射1-10分钟。
最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。
F.随后可以立即采用各种生物素检测试剂盒，检测出样品的生物素标记效率；也可以室温存放数天直至进行后续检测。
G.如果最后采用的是ECL类试剂或其它类似试剂进行检测，则可以对比样品和标准品的灰度，从而计算出探针的标记效率。
例如2fmol量的待测样品探针的灰度和1fmol标准品的灰度相同，则说明探针的标记效率大致为50%，待测样品中总探针的浓度约为1μM，而实际被生物素标记的探针约为0.5μM。
探针的标记效率也可以通过建立标准曲线进行比较精确的计算。
用于后续检测时通常要求标记效率不低于30%。
有文献报道标记效率和3’末端的碱基无关，但和整个待标记探针的序列有关。
由于在TdT的催化下可以在待标记探针的3’端加上多个Biotin标记的dUTP，因此有时会出现标记效率大于100%的情况。
6.生物素标记EMSA
A.对于步骤3B标记好的单链DNA探针，把正义链和反义链等体积混合（不可根据标记效率调整摩尔比例）。
对于最初使用变性的双链EMSA探针进行探针标记的情况，直接进入下一步.
B.加入退火缓冲液（10X），使退火缓冲液的最终浓度为1X，混匀。
例如待退火探针的体积为100微升，则加入11微升退火缓冲液（10X）。
C.如下设置PCR仪进行退火反应：
步骤
温度
时间
说明
1
95℃
2分钟
让oligo充分变性
2
每8秒下降0.1℃，降至25℃（注1）
约90分钟
退火
3
4℃
长时间保持
暂时存放
注1：
如果所用的PCR仪不具备下降0.1℃的功能，也可以设置为每90秒下降1℃。
D.退火反应结束后，-20℃保存标记好的EMSA探针。
此时的EMSA探针已经可以直接用于后续的EMSA检测，也可以对探针进行适当纯化后再进行EMSA检测。
二、核蛋白提取
1.准备溶液：
室温融解试剂盒中的三种试剂，溶解后立即放置在冰上，混匀。
取适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
取适当量的细胞核蛋白抽提试剂备用，在使用前数分钟内加入PMSF，使PMSF的最终浓度为1mM。
2.对于贴壁细胞：
用PBS洗一遍，用细胞刮子刮下细胞，或用EDTA溶液处理细胞使细胞不再贴壁很紧，并用移液器吹打下细胞。
离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
尽量避免用胰酶消化细胞，以免胰酶降解需抽提的目的蛋白。
3.对于悬浮细胞：
用PBS洗一遍，离心收集细胞，尽最大努力吸尽上清，留下细胞沉淀备用。
4.每20微升细胞沉淀加入200微升添加了PMSF的细胞浆蛋白抽提试剂A。
（对于二百万Hela细胞，其细胞沉淀的体积大约为20微升或40毫克。
）
5.最高速剧烈Vortex5秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。
（如果细胞沉淀没有完全悬浮并分散开，可以适当延长vortex时间。
）
6.冰浴10-15分钟。
7.加入细胞浆蛋白抽提试剂B10微升。
最高速剧烈Vortex5秒，冰浴1分钟。
8.最高速剧烈Vortex5秒，4ºC12,000-16,000g离心5分钟。
9.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞浆蛋白。
可以立即使用，也可以冻存。
（千万不要触及沉淀，可以在沉淀上方保留极小体积的上清，以免触及沉淀。
）
10.对于沉淀，完全吸尽残余的上清，加入50微升添加了PMSF的细胞核蛋白抽提试剂。
（不吸尽上清会带来细胞浆蛋白的污染。
）
11.最高速剧烈Vortex15-30秒，把细胞沉淀完全悬浮并分散开。
然后放回冰浴中，每隔1-2分钟再高速剧烈Vortex15-30秒，共30分钟。
12.4ºC12,000-16,000g离心10分钟。
13.立即吸取上清至一预冷的塑料管中，即为抽提得到的细胞核蛋白。
可以立即使用，也可以-70ºC冻存。
14.对于新鲜组织：
A.把组织尽可能切成非常细小的碎片。
按照20:
1的比例混合适当量的细胞浆蛋白抽提试剂A和B（例如200微升细胞浆蛋白抽提试剂A中加入10微升抽提试剂B）。
并加入PMSF至最终浓度为1mM配制成组织匀浆液。
按照每60mg组织加入200微升组织匀浆液的比例混合组织和组织匀浆液，并在玻璃匀浆器内充分匀浆。
匀浆需在冰浴或4ºC进行。
B.匀浆后把匀浆液转移到塑料离心管内，冰浴放置15分钟。
C.4ºC1,500g离心5分钟。
把上清转移至一预冷的塑料管中，为抽提得到的部分细胞浆蛋白。
（吸上清时千万不要触及沉淀。
）
D.对于沉淀，到了这一步已经充分匀浆，但很多细胞还没有破碎。
接下去按照使用说明的步骤4开始操作，即把沉淀当做已经离心收集好的细胞沉淀操作，按照步骤4至步骤13抽提得到细胞浆蛋白和细胞核蛋白。
抽提得到的细胞浆蛋白可以和步骤14c中抽提得到的细胞浆蛋白合并。
三、EMSA胶的配制
A.准备好倒胶的模具。
可以使用常规的制备蛋白电泳胶的模具（例如BioRad的常规用于蛋白电泳的制胶装置），或其它适当的模具。
最好选择可以灌制较薄胶的模具，以便于干胶等后续操作。
为得到更好的结果，可以选择可灌制较大EMSA胶的模具。
制胶前必须把制胶模具冲洗干净，需特别注意不能有SDS残留。
B.按照如下配方配制20ml4％的聚丙烯酰胺凝胶（注意：
使用29:
1等不同比例的Acr/Bis对结果影响不大）。
TBEbuffer（10X）
1ul
重蒸水
16.2ul
39:
1acrylamide/bisacrylamide（40%,w/v）
2ul
80%甘油
625ul
10%过硫酸铵（ammoniumpersulfate）
150ul
TEMED
10ul
C.按照上述顺序依次加入各种试剂，加入TEMED前先混匀，加入TEMED后立即混匀，并马上加入到制胶的模具中。
避免产生气泡，并加上梳齿。
如果发现非常容易形成气泡，可以把一块制胶的玻璃板进行硅烷化处理。
四、EMSA结合反应：
A.如下设置EMSA结合反应：
阴性对照反应：
Nuclease-FreeWater
7ul
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）
2ul
细胞核蛋白或纯化的转录因子
0ul
标记好的探针
1ul
总体积
10ul
样品反应：
Nuclease-FreeWater
5ul
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）
2ul
细胞核蛋白或纯化的转录因子
2ul
标记好的探针
1ul
总体积
10ul
探针冷竞争反应：
Nuclease-FreeWater
4ul
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）
2ul
细胞核蛋白或纯化的转录因子
2ul
未标记好的探针
1ul
标记好的探针
1ul
总体积
10ul
突变探针的冷竞争反应：
Nuclease-FreeWater
4ul
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）
2ul
细胞核蛋白或纯化的转录因子
2ul
未标记的突变探针
1ul
标记好的探针
1ul
总体积
10ul
Super-shift反应：
Nuclease-FreeWater
4ul
EMSA/Gel-Shift结合缓冲液（5X）
2ul
细胞核蛋白或纯化的转录因子
2ul
目的蛋白特异抗体
1ul
标记好的探针
1ul
总体积
10ul
B.按照上述顺序依次加入各种试剂，在加入标记好的探针前先混匀，并且室温（20-25℃）放置10分钟，从而消除可能发生的探针和蛋白的非特异性结合，或者让冷探针优先反应。
然后加入标记好的探针，混匀，室温（20-25℃）放置20分钟。
C.加入1µlEMSA/Gel-Shift上样缓冲液（无色，10X），混匀后立即上样。
注意：
有些时候溴酚蓝会影响蛋白和DNA的结合，建议尽量使用无色的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液。
如果对于使用无色上样缓冲液在上样时感觉到无法上样，可以在无色上样缓冲液里面添加极少量的蓝色的上样缓冲液，至可以观察到蓝颜色即可。
五、电泳
A.用0.5XTBE作为电泳液。
按照10V/厘米的电压预电泳10分钟。
预电泳的时候如果有空余的上样孔，可以加入少量稀释好的1X的EMSA上样缓冲液（蓝色），以观察电压是否正常进行。
B.把混合了上样缓冲液的样品加入到上样孔内。
在多余的某个上样孔内加入10µl稀释好的1X的EMSA/Gel-Shift上样缓冲液（蓝色），用于观察电泳进行的情况。
C.按照10V/厘米的电压电泳。
确保胶的温度不超过30℃，如果温度升高，需要适当降低电压。
电泳至EMSA/Gel-Shift上样缓冲液中的蓝色染料溴酚蓝至胶的下缘1/4处，停止电泳。
六、转膜
A.取一和EMSA胶大小相近或略大的尼龙膜，剪角做好标记，用0.5XTBE浸泡至少10分钟。
尼龙膜自始至终仅能使用镊子夹取，并且仅可夹取不可能接触样品的边角处。
B.取两片和尼龙膜大小相近或略大的滤纸，用0.5XTBE浸湿。
C.把浸泡过的尼龙膜放置在一片浸湿的滤纸上，注意避免尼龙膜和滤纸间产生气泡。
D.非常小心地取出EMSA胶放置到尼龙膜上，注意确保胶和膜之间没有气泡。
E.再把另外一片浸湿的滤纸放置到EMSA胶上，注意确保滤纸和胶之间没有气泡。
F.采用Western时所使用的湿法电转膜装置或其它类似的电转膜装置，以0.5XTBE为转膜液，把EMSA胶上的探针、蛋白以及探针和蛋白的复合物等转移到尼龙膜上。
对于大小约为10x8x0.1cm的EMSA胶，用BioRad的常用的Western转膜装置，电转时可以设置为380mA（约100V）转膜30-60分钟。
如果胶较厚，则需适当延长转膜时间。
转膜时需保持转膜液的温度较低，通常可以把电转槽置于4℃冷库或置于冰浴或冰水浴中进行电转，这样可以确保低温。
具体的电转膜方法请参考电转膜装置的使用说明。
G.转膜完毕后，小心取出尼龙膜，样品面向上，放置在一干燥的滤纸上，轻轻吸掉下表面明显的液体。
立即进入下一步的交联步骤，不可使膜干掉。
七、交联
A.用紫外交联仪（UV-lightcross-linker）选择254nm紫外波长，120mJ/cm2，交联45-60秒。
如果没有紫外交联仪可以使用普通的手提式紫外灯（例如碧云天的手提紫外检测仪（EUV002）），距离膜5-10厘米左右照射3-10分钟。
也可以使用超净工作台内的紫外灯，距离膜5-10厘米左右照射3-15分钟。
最佳的交联时间可以使用标准品自行摸索。
B.交联完毕后，可以直接进入下一步检测；也可以用保鲜膜包裹后在室温干燥处存放3-5天，然后再进入下一步检测。
如果检测结果发现交联效果不佳，甚至连freeprobe的条带都非常微弱，可以考虑在膜干燥后参考步骤A的条件再交联一次，以进一步改善交联效果。
八、化学发光法检测生物素标记的探针
a.37-50℃水浴溶解封闭液和洗涤液。
注意：
封闭液和洗涤液必须完全溶解后方可使用，封闭液和洗涤液可以在室温至50℃之间使用，但必须确保这两种溶液中均无沉淀产生，在冬天需特别注意。
b.取一合适的容器加入15ml封闭液，再放入交联过的含有样品的尼龙膜。
在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
c.取7.5µlStreptavidin-HRPConjugate加入到15ml封闭液中（1:
2000稀释），混匀备用。
d.去除用于尼龙膜封闭的封闭液，加入上一步中配制的15ml含有Streptavidin-HRPConjugate的封闭液。
在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动15分钟。
e.取25ml洗涤液（5X），加入100ml重蒸水或MilliQ级纯水，混匀配制成125ml洗涤液。
f.将尼龙膜转移至另一装有15-20ml洗涤液的容器内，漂洗1分钟。
g.去除洗涤液，加入15-20ml洗涤液，在侧摆摇床或水平摇床缓慢上洗涤5分钟。
h.重复步骤G三次（共洗涤四次），每次洗涤时间都约为5分钟。
i.将尼龙膜转移至另一装有20-25ml检测平衡液的容器内，在侧摆摇床或水平摇床上缓慢摇动5分钟。
j.取5mlBeyoECLStarA液和5mlBeyoECLStarB液混匀，配制成BeyoECLStar工作液。
注意：
BeyoECLStar工作液必须现配现用。
说明：
从本步骤起操作方法和注意事项同Western实验的荧光检测。
k.取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。
立即将膜的样品面向上，放置到处于水平桌面上的洁净容器内或保鲜膜上。
l.在尼龙膜的表面小心加上步骤J配制好的共10mlBeyoECLStar工作液，使工作液完全覆盖尼龙膜。
室温放置2-3分钟。
m.取出尼龙膜，用吸水纸吸去过多液体。
将尼龙膜放在两片保鲜膜或其它适当的透光薄膜中间，并固定于压片暗盒（也称片夹）内。
n.用X光片压片1-5分钟。
可以先压片1分钟，立即显影定影，然后根据结果再调整压片时间；也可以直接分别压片30秒、1、3、5分钟或更长时间，然后一起显影定影观察结果。
CHIP
实验材料：
Chipassaykit（22，1396）；ChIP的一抗，37%甲醛，PBS，PMSF，Elutioinbuffer（1%SDS,0.1MNaHCO3），蛋白酶K，Glycogen或tRNA，Tris平衡苯酚，氯仿，95%乙醇，70%乙醇，3MNaAc（pH5.2）以及细胞刮子或细胞铲子。
PMSF（ST506），蛋白酶K（ST532/ST533），Glycogen（D0812）和3MNaAcpH5.2（ST351），超声破碎仪等。
实验方法：
样品超声处理条件的优化
A.准备适量冰浴预冷的PBS，以及100mMPMSF。
将SDSLysisBuffer适当温浴，使其中的SDS充分溶解，并混匀。
B.将细胞培养于10cm细胞培养皿中，细胞培养液的用量为10ml。
在预期发生目的蛋白和基因组DNA结合的时间点，直接在细胞培养液中加入适量甲醛，轻轻混匀，至最终浓度为1%。
随即在37℃孵育10分钟，以交联目的蛋白和相应的基因组DNA。
例如，对于常规的每个10cm细胞培养皿中加入10ml细胞培养液的情况，需加入270微升37%甲醛。
请注意尽量使用高质量的在有效使用期限内的甲醛。
细胞也可以培养于6cm细胞培养皿中，相关溶液的用量需按照比例进行相应调整。
C.加入1.1mlGlycineSolution（10X），轻轻混匀。
室温放置5分钟。
D.将有细胞样品的培养皿置于冰浴上。
吸尽含甲醛和glycine的培养液，尽量保持没有液体残留。
E.在上述室温放置5分钟期间，用冰浴预冷的PBS稀释100mMPMSF至1mM，即配制成冰浴预冷的含1mMPMSF的PBS。
PMSF水性溶液一定要新鲜配制，其在水相中的半衰期约为30分钟。
F.加入5-10ml冰浴预冷的含1mMPMSF的PBS，洗涤细胞，吸尽液体，尽量保持没有液体残留。
G.再加入5-10ml含冰浴预冷的1mMPMSF的PBS，进一步洗涤细胞，吸尽液体，尽量保持没有液体残留。
H.加入1ml冰浴预冷的含1mMPMSF的PBS，用细胞刮子刮下细胞，收集至离心管中。
如果细胞可以用枪吹打下来，也可以用枪吹打。
对细胞进行计数，分装成每管大约100万细胞。
I.4℃，800-1000g离心1-2分钟，以充分沉淀细胞。
如果发现沉淀不充分，可以适当延长离心时间。
吸尽上清，尽量减少液体残留。
J.配制适量含有1mMPMSF的SDSLysisBuffer。
上一步骤的100万细胞沉淀用0.2ml含有1mMPMSF的SDSLysisBuffer重悬。
K.在冰浴上孵育10分钟，以充分裂解细胞。
L.超声处理，以剪切基因组DNA，使DNA大部分断裂成200-1000bp大小，如果能把大部分控制在400-800bp则更佳。
超声过程中请一定注意要保持样品处于冰浴中，并且处于较低温度。
超声剪切的效果在后续去交联后可以用常规的DNA琼脂糖凝胶电泳检测。
超声处理的条件通常可以设置为10秒每次，共3-4次，功率为50W时设置为最大功率的30%，采用2mm超声头。
不同的超声处理仪器的设置不太一样，摸索超声条件时，可以先固定其他条件，先确定每次超声多长时间不会导致明显发热，然后摸索不同的超声次数。
直至找到比较合适的超声次数可以使大部分基因组DNA断裂成200-1000bp大小。
需要注意的是每次的超声体积和细胞用量宜固定，否则就不能使用一个相对比较固定的超声条件用于后续实验。
M.在0.2ml经过超声处理的样品中加入8微升5MNaCl，混匀。
65℃加热4小时，以去除蛋白和基因组DNA之间的交联。
N.加入等体积的Tris平衡苯酚，vortex剧烈混匀，随后4℃，12000g左右离心5分钟。
吸取上清至另一离心管中。
O.加入等体积氯仿，vortex剧烈混匀，随后4℃，12000g左右离心5分钟。
吸取上清至另一离心管中。
说明：
上述步骤1N和1O的酚氯仿抽提可以使用DNA纯化试剂盒进行操作。
例如碧云天的PCR/DNA纯化试剂盒（D0033）。
P.取少量通过酚氯仿抽提或DNA纯化试剂盒获得的液体，对于酚氯仿抽提产物可以取5-10微升，对于DNA纯化试剂盒纯化产物可以取2-5微升，进行琼脂糖凝胶电泳，观察超声处理对于基因组DNA的剪切效果。
2.染色质免疫沉淀：
a）在对样品超声处理条件进行优化后，对于待检测样品按照步骤1A-1K进行操作，并参考步骤1L进行超声处理。
b）随后对于经过超声处理的样品在4℃，12000-14000g离心5分钟。
取上清（约0.2ml）至一2ml离心管中，置于冰浴。
c）配制适量含有1mMPMSF的ChIPDilutionBuffer。
加入1.8ml含有1mMPMSF的ChIPDilutionBuffer以稀释经过超声处理的样品，使最终体积为2毫升。
d）取出20微升样品作为Input用于后续检测。
其余近2ml样品加入70微升ProteinA+GAgarose/SalmonSpermDNA（其中约35微升为沉淀，35微升为液体），在4℃缓慢转动或摆动混匀30分钟。
此步骤的目的是减少ProteinA+GAgarose/SalmonSpermDNA和目的蛋白或目的DNA序列的非特异性结合。
e）4℃，1000g左右离心1分钟，将上清转移至一个新的2毫升离心管中。
f）加入适量一抗，一抗的用量可以参考抗体的说明书。
如果抗体的说明中未给出用于ChIP的稀释比例，可以参考普通的免疫沉淀的
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