2河南大学大学生创新创业训练计划项目申请书.docx

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2河南大学大学生创新创业训练计划项目申请书

河南大学

大学生创新创业训练计划项目

申请书

项目名称：

玉米谷胱甘肽过氧化物酶家族分析和功能鉴定

项目负责人：

王瑾

学号：

所在学院：

生命科学学院

年级专业：

2011级生物科学专业

填写日期：

2013年5月21日

河南大学大学生创新创业训练计划工作领导组制

填写说明

一、封面中的项目编号由学校统一编排填写。

二、申请书中第2页和第一至第五项的内容，经项目团队人员共同讨论并征得指导教师意见后，由项目负责人主持填写。

三、“项目所属学科”按教育部1998年颁布的“普通高等学校本科专业目录”中的哲学、经济学、法学、教育学、文学、历史学、理学、工学、农学、医学和管理学11个一级学科门类中的一种或多种（跨学科）；“学业能力与获奖情况”指项目负责人已经获取的成果和奖励，如正式发表的学术论文、创作、专利、参加完成的科研课题、被社会及生产实际采用的成果和校级以上的各种学业奖励（挑战杯、电子设计大赛等），均须提供复印件，随申请书一并报送。

四、所填内容要符合《河南大学大学生创新性实验计划项目管理办法》要求，实事求是、简明清晰、具体可靠。

对提供虚假材料或信息数据不实者，将取消申报资格，并承担相应责任。

五、格式要求：

封面使用小三号字体，表格中使用五号字体，所填写的文字用宋体，数字及其他用TimesNewRoman，单倍行距。

需签字部分须由相关人员用黑色钢笔或水笔签名。

A4纸双面打印，左侧装订。

六、项目申请书一式二份，报教务处一份、所在学院一份。

项目名称

玉米谷胱甘肽过氧化物酶家族分析和功能鉴定

项目所属

一级学科

生物学

申请经费（元）

20300

起止

时间

2013年6月至2015年3月

项目负责人

基本情况

姓名

王瑾

性别

女

出生年月

1992、6

政治面貌

团员

联系电话

E-mail

学

业

能

力

与

获

奖

情

况

该生学业能力强，成绩优良，具有一定的专业知识和技能基础，对科学研究有浓

厚的兴趣。

在平时的学习中广泛涉猎了生物化学、分子生物学、细胞生物学及遗传学等多学科的知识，对生物信息学分析软件及相关网站如DNAMAN，Promoter2.0PredictionServer，MaizeGDB，Uniprot等较为熟悉且能熟练运用。

在理论知识学习之余还在植物逆境生物学重点实验室、棉花生物学国家重点实验室等相关实验室学习实验操作及相关技能，能较好地组织实验项目的开展与进行。

曾获奖项：

河南大学优秀学生

项目团队

（

含负责人）

姓名

性别

学号

所在学院、专业

年级

项目分工

王瑾

女

生命科学学院生物科学专业

2011级

统筹协调实验进行、进行相关实验操作、实验结果整理汇总

孙秀娜

女

生命科学学院生物技术专业

2011级

收集资料、进行相关实验操作、实验结果收集

刘天娇

女

生命科学学院生物技术专业

2011级

收集资料、进行相关实验操作实验结果收集、

路乾宇

男

生命科学学院生物技术专业

2011级

实验材料准备、进行相关实验操作、实验结果收集

饶显平

男

生命科学学院生物工程专业

2011级

实验材料准备、进行相关实验操作、实验结果收集

指导教

师

姓名

性别

出生年月

学历

职称

所在单位

联系电话

苗雨晨

男

1970年9月

博士

教授

生命科学学院

刘浩

男

1978年6月

博士

讲师

生命科学学院

韩栓

男

1981年6月

硕士

实验师

生命科学学院

第一指导教师的业务特长与主要学术成果

苗雨晨，教授，博士生导师，河南省优秀教师，河南省学术技术带头人。

2005年毕业于中国农业大学，获博士学位。

2008.12-2011.12于美国能源部布鲁克海文（Brookhaven）国家实验室从事博士后研究。

现为河南大学“黄河学者”特聘教授，河南省植物逆境生物学重点实验室副主任。

主持和参与国家自然科学基金、973国家重点基础发展规划项目等研究项目8项。

在ThePlantCell、PNAS等著名刊物上发表文章20余篇，申请国家专利2项，获教育部自然科学奖1项（第三完成人）。

作为主要完成人参与的“植物应答干旱胁迫的气孔调节机制（2012-2-105-2-04-R03）”获2012年度国家自然科学二等奖。

其研究领域主要为植物逆境生理生化及分子生物学。

近年来，苗雨晨教授始终围绕干旱胁迫和植物生物学研究的前沿出发，发展了分子生理学、细胞生物学、生物化学、基因组学、分子遗传学等多学科的技术，取得了一系列原创性研究成果。

首次提出“ABA诱导保卫细胞产生H2O2并引起气孔关闭”；利用分子遗传学等技术，发现其中一个突变体基因编码谷胱甘肽过氧化物酶（GPX3），是H2O2信号感受器和中继蛋白（relayprotein），它能和ABA信号途径中重要成分ABI2强烈互作，引起胞质钙离子浓度变化，诱导气孔关闭。

另外，通过植物细胞膜和液泡膜分离和运输测定系统，在国际上率先证明了植物细胞ABC转运器家族蛋白参与了木质素前体从胞内运输到胞外进行聚合的过程。

代表性文章如下：

1.MiaoYC,LiuC-J.ATP-bindingcassette-liketransportersareinvolvedinthetransportofligninprecursorsacrossplasmaandvacuolarmembranes.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.,107（52）:

22728-22733,2010

2.MiaoYC,LuD,WangP,WangX-C,ChenJ,MiaoC,SongC-P.AnArabidopsisglutathioneperoxidasefunctionsasbotharedox-transducerandascavengerinABAanddroughtstressresponses.PlantCell,18:

2749-2766,2006

3.ZhangKW,BhuiyaMW,PazoJR,MiaoYC,KimH,RalphJ,andLiuC-J.Anengineeredmonolignol4-O-methyltransferase（MOMT4）repressesligninpolymerizationandconfersnovelmetaboliccapabilityinArabidopsis.PlantCell,24（7）:

3135-3152,2012

4.WangPC,DuYY,ZhaoXL,MiaoYC,andSongC-P.TheMPK6-ERF6-ROSE7/GCC-boxcomplexmodulatesoxidativegenetranscriptionandtheoxidativeresponseinArabidopsisthaliana.PlantPhysiol,161:

1392-1408,2013

5.LiuC-J,MiaoYC,ZhangKW.Sequestrationandtransportofligninmonomericprecursors.Molecules,16,710~727,2011

6.MiaoYC,GuoJG,LiuET,LiK,DaiJ,WangPC,ChenJ,SongC-P.Osmoticstress-regulatedtheexpressionofglutathioneperoxidase3inArabidopsis.ChineseScienceBulletin,52:

127-130,2007

一、主要研究内容及研究价值、目前国内外研究现状、本项目的创新与特色

国内外研究现状：

玉米作为世界三大粮食作物之一，也是我国传统的农作物，在玉米基因组测序完成之前，人们对玉米的研究主要集中于玉米育种、抗胁迫等宏观方面，对玉米的分子生物学研究少之又少。

2008年，美国科学家宣布成功测序得出玉米基因组的草图，此后，各国科学家对玉米的研究成为一个新的热点。

植物在有氧代谢过程中，线粒体、叶绿体和过氧化物酶体会产生活性氧，尤其在外界环境胁迫条件下,活性氧的含量大大增加,对植物产生一定的伤害。

为防御氧化胁迫,植物中存在着一套相应的酶促和非酶促解毒体系（Grene,2002）。

植物清除ROS的酶促系统主要包括SOD（superoxidedismutase）、APX（ascorbateperoxidase）、CAT（catalyse）和GPX（glutathioneperoxidase），它们在清除活性氧过程中起着不同的作用。

SOD作为清除ROS的第一道防线,是一类含金属离子的酶,其功能是将.O2-歧化为H2O2，然后由APX和CAT再分解多余的H2O2（Asada,1994）,但两者在在清除H2O2时都具有一定的局限性。

与植物中不同的是,动物体清除ROS的主要酶类是谷胱甘肽过氧化物酶（GPXs）,经过几十年的研究,人们对动物中GPXs的结构及功能已经有了清晰的认识。

目前，已知的GPxs家族的成员有7种。

它们在体内能够清除有害过氧化物的代谢产物，能催化GSH变为GSSG，同时促进H2O2的分解，阻断脂质过氧化作用，从而起到保护细胞膜结构和功能完整的作用（Sunde,1987）。

GPx2具有组织特异性，只存在于啮齿动物的胃肠道中，其功能是保护动物免受摄入脂质过氧化物的损害（Chuetal.,1993）。

GPx3主要分布于血浆，与清除细胞外过氧化氢和参与GSH的运输有关。

GPx4是磷脂过氧化氢GPX，它在维生素E的协同作用下保护生物膜，被认为是“过氧化反应抑制蛋白”。

GPx5是GPx家族新成员，其表达产物作为一种分泌蛋白，能结合到精子上，以免细胞受脂质过氧化损伤，该酶的缺乏会导致受精能力下降。

GPx6的生物学功能还不确定。

GPx7的结构与功能也在进一步研究中。

对动物GPxs的研究也启示人们去思考,GPXs在植物中到底起到一个什么样的作用?

经过近20年的探索,人们研究了柑橘、拟南芥、大白菜、菠菜、向日葵、番茄、豌豆、水稻以及衣藻、大麦和芦荟等，但对于植物体内GPXs的结构与功能认识仍然有限。

后来人们以模式植物拟南芥为材料，发现并研究了8种GPXs的同功酶，分别命名为AtGPX1、AtGPX2、AtGPX3、AtGPX4、AtGPX5、AtGPX6和AtGPX7、AtGPX8（Millaetal.,2003），8个基因分别位于1号、2号、3号和4号染色体上，对不同的非生物胁迫都有应答反应。

研究表明，AtGPX1和AtGPX6的磷酸化位点多，与其它AtGPX相比，AtGPX1和AtGPX6在受盐、干旱、金属、ABA等胁迫处理后可上调表达。

根据亚细胞定位，AtGPX1主要在叶绿体、AtGPX6主要在细胞质和线粒体中表达。

AtGPX2、AtGPX3、AtGPX5分别定位于细胞质、线粒体和内质网，在植物中广泛存在，并可诱导表达.已有研究表明，AtGPX3可以作为清除酶或信号传递因子调节植物对ABA和干旱的反应，而且参与了渗透胁迫反应.AtGPX7、AtGPX8在氧化胁迫下表达。

系统进化树分析显示，AtGPX1和AtGPX7、AtGPX4和AtGPX5、AtGPX2和AtGPX3同源性较高，AtGPX6和AtGPX8距离相对较远。

根据其亚细胞定位、表达条件等分析，提示AtGPX家族的各个成员的作用形式可能存在不同。

虽然拟南芥GPXs研究已经有报道，但作为主要粮食作物玉米中GPXs家族如何？

是否和模式植物拟南芥有类似的功能，至今未见报道。

本研究利用已知的拟南芥GPX家族基因序列，通过生物信息学分析和鉴定玉米中GPX的同源基因，然后进行功能分析，进一步确定玉米GPXs在非生物胁迫中的作用。

该项目的开展，不仅为理解玉米中的GPX功能提供直接的理论根据，而且为研究玉米应对氧化胁迫以及基因工程改良玉米抗逆性开辟新途径。

[参考文献]：

GreneR（2002）Oxidativestressandacclimationmechansismsinplants.In:

SomevilleCK,MeyerwitzEMeds,TheArabidopsisBook.AmericanSocietyofPlantBiologist,Rockville,pp.1-19

AsadaK（1994）Productionandactiveoxygenspeciesinphotosynthetictissues.In:

FoyerCH,MullineauxPMeds,CausesofPhotoxidativeStressandAmeliorationofDefenceSystemsinPlants.CRCPress,BocaRaton,pp.77-104

SundeRA（1987）Selenium.In:

O’DellBL,SundeRAeds,HandbookofNutritionallyEssentialMineralElements,Vol.18.MarcelDekker,NewYork,pp.493-556

ChuFF,DoroshowJH,EsworthyRS（1993）Expression,characterizationandtissuedistributionofanewcellularselenium-dependentglutathioneperoxidase,GSHPx-GI.JournalofBiologicalChemistry,268:

2571-2576

MillaMAR,MaurerA,HueteAR,GustafsonJP（2003）GlutathioneperoxidasegenesinArabidposisareubiquityousandregulatedbyabioticstressesthoughdiversesignalingpathways.ThePlantJournal,36:

602-615

主要研究内容及研究价值：

利用MaizeGDB、NCBI等数据库寻找玉米中GPXs基因及其序列，然后对这些序列对这些基因进行生物信息学分析，包括基因Promoter区各转录元件（TATA-box,CAAT-box,GC-box，增强子，沉默子等）的确定，基因ESTclones,基因染色体定位，科学预测基因组织定位，基因表达的亚细胞定位，基因的胁迫响应元件等；

一、利用qRT-PCR分别分析不同胁迫因子（如干旱、盐、冷、脱落酸等）处理下，这些基因表达情况，进一步确定GPXs家族应答各种环境胁迫的可能性；

二、利用分子生物学研究玉米GPXs的表达定位，以及环境胁迫下谷胱甘肽过氧化物酶活性变化；

三、构建7种GPX的原核表达载体，诱导表达并纯化GPXs蛋白，分析蛋白特性；

其研究价值在于通过对玉米中GPXs的生物信息学分析及验证，为以后人们研究玉米GPXs功能提供较为精确的科学依据，这将大大推动玉米中GPXs功能的研究进展。

创新与特色：

目前，生物信息学已经成为生物学（尤其是分子生物学）和生物技术研究开发中不可缺少的一个辅助工具.利用生物信息学可以进行两个或者多个序列比对，找出其相似性;通过ESTs序列信息数据库查找新的基因;通过氨基酸序列预测蛋白质的高级结构和功能;依据不同物种DNA或氨基酸水平上的异同分析，研究目的基因的起源进化和结构、功能的演变，进而寻找其间的亲缘关系.生物信息学的应用有利于正确引导实验、缩短实验数据分析时间，并使许多比较分析变为可能.

我们研究的特色在于：

一、拟南芥中GPXs的生物信息学分析已经有人做得较为透彻，而在玉米中，GPXs的生物信息学分析尚无人探索，我们的探索研究将补充这样的空缺；

二、玉米GPXs的生物信息学分析将会为玉米中GPXs功能研究提供很大的指导作用。

我们的创新点在于：

一、拟南芥属于双子叶植物，而玉米作为单子叶植物，其GPXs表达产物同拟南芥中GPXs表达产物是否具有类似的功能结构域，我们通过研究可以得以确定；

二、应答双子叶植物拟南芥的这些非生物胁迫因子（如干旱、盐、冷、脱落酸等）是否对玉米这样的单子叶植物起到相似的作用，通过我们的研究也可以得以确定；

三、通过这两者的比较，我们不仅可以理解玉米中GPXs家族同拟南芥GPXs家族的相似性，同时也可以对单、双子叶植物中GPXs是否存在密切关系得出科学的推测。

二、已具备的条件（含已具备的知识、技能、特长、实验条件、研究基础等）

申请者在平时的学习中广泛涉猎了生物化学、分子生物学、细胞生物学及遗传学等多学科的知识，对生物信息学分析软件及相关网站如DNAMAN,Promoter2.0PredictionServer，MaizeGDB,NCBI、Uniprot等较为熟悉且能熟练运用。

近一年来，申请人一直在河南省/教育部植物逆境生物学重点实验室和棉花生物学国家重点实验室进行科研训练，已经掌握了分子生物学等多种实验技术，并且实验室已拥有完成生物化学、细胞生物学、功能基因组学和分子生物学等相关领域的实验设备，能够保证项目的顺利实施。

指导老师苗雨晨教授长期从事植物逆境胁迫信号转导，尤其对模式植物拟南芥谷胱甘肽过氧化酶家族进行了深入研究，PlantCell,PlantPhysiology等杂志上发表论文多篇，具有较好的工作基础，为该项目的顺利开展提供了技术保障，有可能取得突破性的进展。

3、项目实施方案及进度安排（按月份列出）

2013.6-2013.9：

根据玉米中七个GPX基因的碱基序列进行生物信息学分析；包括基因Promoter区各转录元件（TATA-box,CAAT-box,GC-box，增强子，沉默子等）的确定，基因ESTclones,基因染色体定位，科学预测基因组织定位，基因表达的亚细胞定位，基因的胁迫响应元件等；

2013.10-2014.1：

基因表达组织定位及亚细胞定位相关载体构建及转化，相关基因原核表达载体的构建；

2014.2-2014.6：

研究玉米GPXs的表达定位，以及环境胁迫下谷胱甘肽过氧化物酶活性变化；

2014.7-2014.12：

qRT-PCR分别分析不同胁迫因子（如干旱、盐、冷、脱落酸等）处理下，这些基因表达情况，进一步确定GPXs家族应答各种环境胁迫的可能性；

2015.1-2015.3：

撰写论文和研究报告；

四、项目经费预算及用途

序号

经费科目

经费预算（元）

预算依据

实验耗材

3100

跑蛋白用玻璃板（2000元）、实验用EP管（500元）、移液器枪头（500元）、玻璃试管等（100元）

实验试剂

10000

蛋白纯化柱子（5000元）、载体构建所需内切酶及连接酶（2500元）、SDS蛋白电泳试剂（1600元）、引物（500元）、转基因辅助因子（400元）

实验仪器损耗

5000

河南大学大型仪器使用收费标准（5000元）

论文出版费

2000

论文发表普通标准（2000元）