土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸.docx

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土壤微生物生物量的测定方法氯仿熏蒸

土壤微生物生物量的濃定方法

1土壤撤生物碳的需定方法（H蒸提取一一仪器分林法）

1.1基本原理

新節土样经氯仿熏蒸后（24h）,土壤撤生物死亡细胞发生裂解，释赦岀攒生物生物量碳，用一定体枳的0.5mol/LK2S04溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定攒生物生物量碳含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸士壤测定有机碳的差值员转换系数（屉），从而廿算士壤做生物生物量碳。

1.2实验妆器

自动总有机碳（TOC）分tfi仪（ShimadzuModelTOC—500,JANPAN）、真空干煤器、烧杯、三角眦、聚乙烯熟料管、离心管、滤红、漏斗等。

1.3实验试剂

1）无乙諄氯仿（CHCLs）;

2）0.5mol/L麻酸钾溶液:

称取87gK2S04濬于1L蒸耀水中

3）工作曲线的配制:

用0.5mol/L硝酸钾落裁配制10ugC/L、30ugC/L.50ugC/L.

70ugC/L.100ugC/L系列标准碳溶液。

（其实一般情况下，

仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）

1.4操作步骤

1.4.1土壤的前处理（过筛和水分调节m）

1.4.2熏蒸

称収新卸（相肖于干土10.0°,这个可以根摇自己土样的悄猊而定）3价分别朋人25ml小烧杯中。

将烧杯朋人真空干煤器中，并放置盛有无乙醇氯仿（约2/3）m15ml杯2或3只，烧杯故入少量lifi暴彿玻同时笊人一盛有NaOHS液的小烧杯，以吸收熏蒸过程中释放出来的co2,干煤器婕部加人少量水以保持容器湿度。

盖上真空干煤器盖子，用真空泵抽真空，使氮仿沸嘴5分抑。

关冈真空干煤器W0,于25T黑喑条件下培养24小时。

1.4.2抽真空处理

熏蒸结東后，打开真空干燥器Iffl门（应听到空气进入的声音，否则熏蒸不完全，重做）,取岀盛有氯仿（可重复利用）和榆NaOH溶液的小烧杯，清常干煤器，反夏抽真空（5或6次，每«3min,毎次抽真空后最好完全扌T开干煤器盖子）,直到土攘无氯仿味道为止。

同时，另称等量的3价土壤，置于另一干煤器中为不熏蒸对照处BL（注倉：

H蒸后不可久故，应该快速覆提）

1.4.4浸提过滤

从干操器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转務到80ml聚乙烯离心管中，加人40ml0.5mol/L睛酸仲溶液（土水比为1:

4,考虎到土样的原因，就部分

蒸和不

土均为4°,即，4。

土：

16ml的确酸押溶裁，当然这个加入量舉根

据TOC仪器的进入量决定）300「/min振30min,用中速定量滤以过滤。

同时作

3f无土壤基质空白。

土壤提取液最好立即分柄，或一20弋冷冻保存（但使用前

需解冻摇匀）（注意这協分很重要，有研究结果表明：

提取液如果不立即分林,猜保存在一20T,否JM將影晌侵提液的效果，其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤缴，以免妖久杂质会堵塞仪器的管路，建炭使用那种一次性塑玛注射器.配一个0・2um的滤头■一个才1元）。

1.4.5TOC仪器测定

吸取上述土壤提取液10ul（这个要根据仪器自己的性能决定.但是一段倩况下，在濃定土壤滤裁时候，要对其进打秸澤，如果不秸释，一方面超过原来仪器的标曲，另一方面可能堵塞仪器。

）注人自朋总有机碳（TOC）分林仪上，测定提取液有机碳含量。

由于总有机碳分析仪塑号较多，不同的里号则操作程序存在较大差异，这里以本实验室使用的有机碳分折仪（ShimadzuModelTOC-一500,JAPAN）为例。

1.5its

SMBC=（Ecc^L3-Ecck）*TOC仪器的幕释倍数★原来的水士比/0.45

2土壤撤生物生物量氮（帮三密比色法）

土壤攒生物生物氮一般占土攘全氮的2%—7%,是土填中有HI—无HI态氮转化的一个重要坏节，关于土壤撤生物氮的测定常见的熏蒸浸提法有两种，一是全氮测定法，另一个是帝三8B比色法，如下

2.1基本原理（药三密比色法）

Amato和Ladd（1988）研究表明新節土样熏蒸il程所释赦岀的氮，主要成分为c（-氨基酸态氮和按态氮，这两种氮形态可以用帮三闌反应定量测定，并发现熏蒸与未熏蒸土壤提取的曲三闌反应态氮的增量，与其土壤攒生物生物量碳之间存在显著的相关性。

因此，人们采用熏蒸提取前三M比色法来測定士壤徹生物生物量氮（FE-Nnin）o

2.2实验仪器

分光光度廿、硬质试菅、水浴锚、真空干燥器、烧杯、三角筋、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等

2.3实验试剂

1）无乙諄氯仿（CHsCI）；

2）0.5mol/L（K2SOd溶液：

UBSiKiT（K2SOJ87g,溶于去离子水中,稀

8至1000ml；

3）PH5.2的乙酸锂（LiOH・H2O）溶液：

称取氢氧化8（UOH.H2O）168g,加

人冰乙酸（优级纯）279ml,#H水柿'释到1000ml,用浓盐戲或50%氢氧化抽溶液调节pH至5.20

4）葫三闌溶液：

®150mlZ甲基亚叭MOS）和乙酸锂濬裁50ml加人4g水合前三闌（C9H.O3*H2O）和0.12g3原甬三圉（C18Hw06.2H20）搅拌至完全

濬解;

5）50%乙醇水落液：

吸®50ml99%乙醇干100ml容量眦中，用蒸闊水定容；

6）1mol/L的碩嚴歿［（NH4）2S0J标准储存液：

称取4.7167g分析纯碼戲皴（8

前105丫烘2h）濬于0,5mol/L磕酸钾溶液中，并用硯酸弭落液定容至1000ml,摇匀，于4T冰箱中保存。

7）O.1mol/L的»K®［（NH4）2S04］标准液：

吸取10ml1mol/L的硝殿披标准

肾存液于100ml容量毗中，用0.5mol/L睛酸押溶液定容至100ml,摇匀。

此溶液最好现配现用。

8）I作曲线的制备：

分别吸取0.00ml、0.50mkI.OOmk2.00ml、3.00mk4.00mk5.00ml0.1mol/L的碣酸钱标准液于100ml容量瓶中，用0.5mol/L液

1.5mol/L、2.0mol/L.2.5mol/L砺酸按标准氮的系列濬裁。

2.4操作步骤

2.4.1土壤的前处理（和1.4.1一样）

2.4.2熏蒸（和142—样）

2.4.3抽真空处理（fill.4.3_样）

2.4.4浸提U滤

从干煤器巾®I岀熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转務到80ml聚乙烯离心管中，加人40ml0.5mol/L碼殿御落液（土水比为1:

4,考虑到士样的原因，此部分

黒蒸和不

裁土均为2（h即，2。

士：

8ml的确88钾溶液）300i7min振葫30min,

用中速罡量滤Ittil滤。

同时作3个无土壤基质空白。

土填提JUE好立即分折,或一20T冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这SI分很重要，有研究結果表明：

提取液如果不立即分析，莆保存在一201探，否则将册晌盪提液的效果，,其次，过滤时不嬰用普通的定性或定量滤址，以免长久杂质会堵塞仪器的管路,建炭使用那种一次性塑料注鼎器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。

2.4.5分光光度廿比色测定（就处沸水浴不好控制探）

吸取0.5ml样品提取液和标准工作液，分别置T10ml的塑料离心管中，HA2ml3i5S显色剂,涡旋龜拌充分混匀，置于试管架上，在沸水中水浴15min,迅速冷却（冰浴约2min）,加人5ml柿释液（50%乙醇水濬液）,摇匀于570nm下比色。

2.5结果廿算

SMBN=（EcCHCL3-EcCK）*M»倍IT原来的水土比*5

・•总结资料

•土壤撤生物生物量氮的雷定（全氮滇定法，建浜使用此法）

注薮：

所i!

的试剂和全自动91氏定氮仪的试剂一样，具休见农化分林课本

2.4.1土壤的前处理（和141一样）

2.4.2熏蒸（和142—样）

2.4.3抽真空处理（和143—样）2.4.4浸提过滤

从干爍器中取出熏蒸和未熏蒸土样，将土样完全转務到80ml聚乙烯离心管

中，加人40ml0.5mol/L硯酸仲溶液（土水比为1:

4,考虑到土样的原因.就部分

用巾速定量滤Iftil滤。

同时作3个无土壤基质空白。

土壤提®«E好立即分折,或一201冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）（注意这部分很重要，有研究结果表

明：

提取液如果不立即分析，情保存在一20七※，否酬將影晌浸提液的效果，,其次，过滤时不要用普通的定性或定量滤址，以免长久杂质会堵塞仪器的管路,建奴便用那种一次性塑料注肘器，配一个0.2um的滤头，一个才1元）。

2.4.5全自动凯氏定氮仪的测定

吸®10ml滤液与消煮管中，加人^SOj-CuSOq-Se混合催化剂1.08g,M人4ml浓麻酸；同时设置2—3空白（10ml的0.5mol/l的K2SO.„加人K2S04—CuSO4-Se混合催化剂1.08g,加入4ml浓睛酸）；在高温消化（3401消煮3个小时）至澄清后朋置2-3ho烈后用全自动凯氏定氮仪測定浸提液中的全氮含量。

2.5结果it算

En=（Vs-Vo）*Ch2SM*14*1000*（16/10）-Ws

式中：

E“为全氮，V。

为漓定空白对照所消耗的标准砖戲体枳（注意：

消煮一批土徉至少需要3个对照※）,Vs为漓定士样所消耗的标准碼酸体枳，Ch2SW为砸酸浓0（&个浓标定的,具体见农化分析课本），14为氮的摩尔质量,1000

为干克转化成克，16/10为从16ml的提取液中吸®10ml,Ws为干土重

所恥土壤撤生物生物量氮BKE严一EF）/o,54

见《士壤債主物研究原理与方法》，主编：

林先贵中科院士壤研究所

3土壤撤生物生物量磷（无机磷割定法）

Brookes等（1982）报道士攘熏蒸处理所释故岀来的磷大部分为无机确酸盐,可被0.5mol/LNaHC03等提取剂提取,而目熏蒸和未熏蒸土攘之间无机确的差异,能够反映土攘锁生物生物量磷的高低。

于是，Brookes等建立了土®04物生物量磷的熏蒸提取无机磷测定法。

3.1基本原理

新鲜土壤经氯仿熏蒸后（24h）,采用0.5mol/LNaHCO3igiff提取被杀死的土壤

愧生物生物量磷，在asfliii混合试剂作用下提取液中正确酸与姐酸络合形成确SI杂名酸（在一定酸度条件下），可用确姐比色法测定提取液最好全晞含量。

根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机确量的差值和转换系数（如，这个系数很重要，因为如果设有泄个系数，所濃定的结果就是士壤的速效暮，但是士壤徹生物羸蒸后释放的隊大多数是无机隊，而速效隊包括全部*落性暮、部分吸附态陽及有机盗療，有的土壤中还色括某些沉淀态硯，因nt速效硯和无机确的II不一梓，

Ai_o_^j_n及外加无机晞的回收率（Rpi＞作为校正系数，从而估算土壤锁生物生物量磅。

3.2实验设备

分光光度廿、便质试管、水浴鋸、真空干煤器、离心机、烧杯、三轴败、聚乙烯塑料管、离心管、漏斗等

3.3实验试剂

1）无乙BMIfi（CHsCI）；

2）0.5mol/L碳酸氢抽（NaHCOs）浸提液：

濬解NaHC0342.0g于800ml水中,以0.5mol/LNaOH溶液调节浸提液的pH至&5,再用蒸耀水稀释至1000mlo此溶液曝于空气中可因失去CO2而使pHig高，可于液面加一层矿物曲保存。

此溶液肾存于塑料毗中比在玻璃筋中容易保存，若恫存趙社一个月，应检查

pH是否改变;

3）磅酸二氢钾濬液［p（KH2P04）=250ugp/ml］：

稀取1.0984g分析纯曦酸二

氢却（称量前105T烘2~311探）,沼干去离子水并定容至1000ml；

4）fflifIn试剂：

（间鲍士旦的土攘农化分折课本）

5）确标准液：

准确称取在105"箱中煤干的KliPOj分析纯）0.2195g,溶解在400ml水中，加浓麻酸5ml（加硝酸放置霉菌，可是落液长»］«#）,转人1000ml容量曲中，加水定容至刻度。

此濬液为50ug/ml确标准液。

吸取上

述确标准液25ml,定容至250ml,即得5u”mL磷标准液（此溶液不可久存※）

6）工作曲线：

准确吸取5ug/ml磷标准液0、0.5ml、1mk2ml、3mk4ml、5ml

分别®A25ml容量JR中,加水至S20ml,然后加ffli«In试剂4ml,最后用水定

容至25mlo30min后开始进行比色。

各败比色液睛的浓贋分别为0ug/mk0.1ug/mk

0.2ug/mk0.4ug/mk0.6ug/mk0.8ug/mk1.0ug/ml8?

o

3.4操作步骤

3.4.1土壤的前处理（和1.4.1一样）

3.4.2熏蒸（和142—样）

3.4.3抽真空处理（和1.4.3_样）

3.4.4浸提过滤

从干煤器中取岀熏蒸和未熏蒸土程，将土样完全转杨到250ml聚乙烯提取毗中，加入200ml0.5mol/LNaHC03浸提液（土水比为1:

20,考虑到土样的不足，H个部分称®2g土，比值为2g±:

40mlNaHCOs）,300r/min振清30min,用慢速定量滤Iftil滤。

同时作3个无士填基质空白。

士壤提取液最好立即分林，或一20七袴竦保存（但使用前需解冻摇匀）o

3.4.5无机睛的回收率（很重要※）

另称取经前处理相当干干土2.0g±样2卅，分别故人三个50ml聚乙烯提取毗，inA0.2ml250ugp/mlK二氢卽濬液,flMA40ml0.5mol/L碳酸氢抽（NaHCOa）浸提液，同±»ff提取。

用于测定外加正磷酸盐态无机陽的回收率（Rpi）,以校正土壤对熏蒸处理所释赦出来的I#生物生物量隋的吸附和固定。

土

攘提取液也立即分折，或一201冷冻保存（但使用前需解冻摇匀）。

3.4.6分光光度廿比色测定

吸取10ml提取液（依样晶的含睛而定）干25ml容量汕中，加人适量的

1.0mol/LHCI中和,HCI溶液的加入量通常为提取液体枳的1/2,应置4h

并同隙振蒲，以排除濬液中的CO2。

补充去离子水至20ml,JO人4ml混合显色剂,再加水定容，摇匀。

显色完全（约30min）后，在882nm»长处进行比色。

3.5结果廿算

土壤撤生物生物量RBp=EpV（Kp*Rpi）单位为mg/kg

式中Ept为熏蒸和未熏蒸的土壤差值,IP：

（E严7鋼,E严（Ep^）=W1（分光光度廿的值）"2.5（容量«的稀S倍数广4（40nl浸提液中®10ml）*20（水土比）,Rpi=[（外加KH2P04溶液土壤的測定值一未熏蒸土壤的差值）/25]*100%,其测定和算法也是和E严宙）一样；Kp为转化系数，取值为0.4