微生物的液态发酵乙醇的生产过程及淀粉转化率实验.docx
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微生物的液态发酵乙醇的生产过程及淀粉转化率实验
发酵工程实验报告
微生物的液态发酵
——乙醇的生产过程及淀粉转化率实验
姓名：
××
班级：
生物技术
学号：
××
指导老师：
××
微生物的液态发酵——乙醇的生产过程及淀粉转化率实验
××
（长春师范大学生命科学学院生物技术）
【摘要】水稻是我国第一大粮食作物，水稻淀粉含量丰富，完全可以作为生产优质酒精的原料。
采用免蒸煮生料大米生产食用酒精生产方法，简化了工艺，节约了燃料，减轻了劳动强度且降低了操作难度，提高了酒精得率。
生料酿酒就是微生物利用生淀粉直接进行生长、繁殖及代谢的过程，直接将大米加曲加水糖化发酵，蒸馏而成。
【关键词】大米；发酵；生料酿酒；糖化发酵；蒸馏
WinemakingTechnology
××
（TechnologyofBiologicalLifeScienceCollegeofChangchunNormalUniversity）
[Abstract]RiceisthemajorfoodcropinChina,Thestarchcontentofriceisrich,Itcanbeusedasrawmaterialtoproducehighqualityalcohol,Withuncookedrawriceproductionofediblealcoholproductionmethod,itsimplifiestheprocess,savesfuel,reducesthelaborintensityandreducetheoperationdifficultyandimprovesthealcoholyield.Thericewithcurvedwatersaccharificationandfermentation,finallydistilledfromwine.
[Keywords]Rice;fermentation;brewing;saccharificationfermentation;distillation
前言：
可用于生料酿酒的原料多种多用，如大米，玉米，高粱，小麦，粉渣，青稞，小米，薯干均可。
原料不同，工艺也不相同。
本文主要探讨以大米为主要原料的生产工艺。
大米发酵生产酒精的原理是利用大米中富含的淀粉，通过各种酶的作用，将淀粉分解为可发酵性糖，然后经过酒母的发酵作用，将可发酵性糖转化为酒精。
大米的淀粉含量要比其它原料高，发酵容易，出酒率高，是生料酿酒的最佳原料。
1.材料与方法
1.1菌种和酶制剂
酵母菌种
糖化酶
细菌
④霉菌
1.2原料
大米
1.3实验器材
酒缸、培养箱、蒸馏装置、分光光度计。
1.4溶剂
水
2.生料酿酒工艺
原料→水→酒曲→搅拌→封口→发酵→蒸馏→成品
3.操作步骤
3.1用品的秤取
用电子秤称取8斤大米，20斤水，24g酒曲（2种）
3.2操作步骤
（1）将称好的24g酒曲拌入8斤大米中，充分搅拌。
将拌好的大米放入酒缸中，将称取好的水加入酒缸中，充分搅拌，封闭进行发酵。
（2）定时搅拌发酵前期每天搅拌一次，使发酵瓶底部的原料与糖化，发酵剂充分接触，均匀彻底发酵，使所有淀粉能充分利用。
发酵中期，搅拌醪液时一定要注意封闭隔氧。
搅棒要清洗干净，以免发酵液染菌，生酸较快，较大，影响出酒率。
发酵后期，不宜频繁搅拌，以减少酒精的挥发损失。
（3）发酵控制在25℃左右为宜。
4.发酵液的成熟检查
4.1感官检测：
（1）醪液由浑浊变清，发酵终止醪液呈淡茶色，整个发酵醪液无气泡现象。
（2）有酒香味
（3）微酸不甜
4.2米粒状态变化
（1）由原来变膨胀
（2）有膨胀变断裂
（3）最后变碎粒，有些漂浮起来，有些沉在缸底。
5.蒸馏
在老师帮助与指导下，安装好蒸馏装置，按照要求进行蒸馏。
刚开始蒸馏得到的白酒不要，倒掉，接下来蒸馏的白酒进行收取，直到没有酒流出，最后得到酿制的白酒。
然后测一下酒精的浓度，作好记录。
6.酒糟中得生理指标测定
6.1固体酒糟的烘干
将用到的酒槽及所用到的器具用自来水洗刷干净，然后倒扣自然晾干，做好准备，以备用。
6.2样品预处理
样品经自来水洗净晾干后，去皮，切成小粒，用乳钵捣碎、匀浆，用百分之一天平称取5g置于250ml锥形瓶中，加入150ml85％的乙醇，超声振荡15min。
样液经定量滤纸过滤，并用85%乙醇淋洗至滤液透明为止，弃去滤液，将滤纸上残渣转入250ml三角瓶中，加入100ml水和30ml6mol／LHCl，置沸水浴中水解2h。
用碘-碘化钾溶液检查水解液是否水解完全，用6mol／LNaOH调pH7.0后，过滤于250ml容量瓶中，并用水淋洗残渣，最后加水将滤液定容到250ml，作为待测液。
6.3标准曲线的制备
于6支25ml比色管中，分别准确加入0、1.00、2.00、3.00、4.00、6.00ml的葡萄糖标准溶液（相当于0，0.50，1.00，1.50，2.00和3.00mg葡萄糖），各加3.50mlDNS显色剂，加水至10ml，混匀后，置于沸水浴中5min后，取出流水冷却，再加水定容至25ml刻度，混匀。
以空白管溶液调零，在520nm波长下测定各管吸光度值。
以葡萄糖含量（mg）对吸光度值作标准曲线或进行线性回归。
6.4样液测定
取0.50ml待测液按标准曲线制备方法测定，根据样品吸光度值查标准曲线或由回归方程求出所取试液中葡萄糖含量（mg）。
按下式计算甘薯鲜样中淀粉多糖含量（%）。
甘薯鲜样中淀粉多糖含量（%）=试液中葡萄糖含量（mg）×250×100样品量（g）×0.50×1000×0.9。
6.5显色反应时间
在其他条件相同时，试验了不同水浴时间对显色液吸光度值的影响。
实验表明，沸水浴时间在5min内时，显色液吸光度值随水浴时间延长而迅速增加，而在5min时达最大值，其后吸光度值趋于稳定。
所以选择沸水浴时间5min。
6.6标准品对照试验
取淀粉标准应用液，同葡萄糖标准制备标准曲线，得二者斜率之比为0.89，说明按本法葡萄糖与淀粉的转化率为0.89，与理论值0.90接近，因此，可以选用葡萄糖标准代替淀粉标准制作标准系列。
6.7淀粉转化
1准确称取烘干磨碎的丢糟样品Zomg,称取六份.无损失地倒入干燥的大试管中,加入25ml2%盐酸溶液,用玻璃塞盖好,将大试管浸入沸水浴中加热,并不断摇动,经5一2.0小时后,取其中一个试管的固体颗粒置于自瓷比色板中‘加2滴碘一碘化钾试剂,检查淀粉水解是否完全,如固体颗粒不显蓝紫色,说明水解已完全.如水解不完全,再继续置于沸水浴中加热0.5小时,并再行检查,直至水解完全为止。
转移和沉淀蛋白质:
样品冷却后,将试管中的水解液全部转移到100ml容量瓶中,并用蒸馏水冲冼试管3一4次,加一滴甲基红指示剂,用10%氢氧化钠溶液将溶液中和至微碱性（用滴管加到溶液由红变淡黄）,再慢慢加入smls%硫酸锌溶液及sml0.3mol几氢氧化钡溶液沉淀蛋白质,振荡后静置,直至溶液上层出现澄清溶液,再加儿滴03mof几氢氧化钡溶液直至无白色沉淀出现为止,然后加水至容量瓶刻度定容,混匀放置过夜。
用吸量管吸取上层清液sml放入50ml容量瓶中,加水稀释到刻度。
2准确称取2-5g磨碎、过40目筛的样品，置于放有慢速滤纸的漏斗中，用30mL乙醚分三次洗去样品中的脂肪，弃去乙醚。
再用乙醇溶液约150mL分数次洗涤残渣，以除去可溶性糖类。
滤干乙醇后用100mL水将残渣转入250mL锥形瓶中，加入盐酸（1+1）30mL，连接好冷凝管，置沸水浴中回流2h。
回流完毕后，立即置流动水中冷却至室温，加入2滴甲基红指示剂，将水解液调至近中性（先用40%NaOH溶液调至黄色，再用盐酸（1+1）校正至水解液刚变红色为宜；若水解液颜色深，可用精密pH试纸测试，调至pH约为7）。
加中性Pb（Ac）2溶液20mL，摇匀。
放置10min，使蛋白质等干扰物质沉淀完全。
再加等量的Na2SO4溶液，以除去多余的铅盐。
摇匀后将全部溶液及残渣转入500mL容量瓶中，用水洗涤锥形瓶，洗液合并于容量瓶中。
用水定容至刻度，混匀、过滤（初滤液弃去）。
7.实验结果
以下是酿制酒的过程记录，包括酒的气味、颜色以及米的状态的改变。
酿制
天数
图片记录
当天观察到的现象
第一天
米粒黏性强。
瓶子中的米饭被压实后，与瓶内壁紧贴。
第二天
1.玻璃瓶的上部出现水珠玻璃瓶与瓶盖的缝隙间闻到微微的带有酸酸的气味。
2.米粒含有水分较柔软。
将瓶子倒转时，米饭与瓶底慢慢分开，表明黏性比起昨天减弱并有极少量的液体。
下层约1cm的米粒比上面的米粒湿润。
3.左右摇晃瓶子，发现瓶内壁米饭之间有轻微的缝隙。
第三天
1.仍然散发出酸酸的气味，米粒很湿润，但米饭表面的米粒却比较干燥。
2.米饭发酵出来的酒几乎漫过米饭约3/5的地方。
第四天
1.米饭4/5的部分被酒浸泡，米粒呈奶白色。
1/5的部分没有被酒浸泡显得比较干燥，米粒白中带有微黄。
2.打开瓶盖时闻到浓厚的酸酸的酒味。
酒呈白色浑浊，约43mL。
米粒和酒都是甜中带有一股酸味。
3.米饭4/5的部分的米粒非常柔软，如同白粥的米粒一样。
第五天
有非常浓厚纯正的酒味，米饭非常柔软，能够塑造轻易任何形状。
第六天
1.被酒浸泡的米饭之间有时会冒出气泡，说明米饭内部的间隔正减少。
2.用干净的筷子刮开米饭的表面，发现米饭已经形成一个比较结实的饭团。
第七天
1.米饭团微黄，酒和米饭团之间有许多小气泡。
2.今天酿出来的酒比起前两天都有明显的下降，表明大米的发酵差不多完成。
第八天
今天的总酒量减少了。
可能的原因：
（1）倒酒的时候没有完全到出，产生误差。
（2）米饭团把部分的酒吸收了，导致酒的减少。
标准曲线于6支25ml比色管中，分别准确加入0、1.00、2.00、3.00、4.00、6.00ml的葡萄糖标准溶液（相当于0，0.50，1.00，1.50，2.00和3.00mg葡萄糖），
比色管
吸光值
6
3.383
3.294
3.367
5
2.929
2.866
2.894
4
2.106
2.076
2.084
3
1.195
1.176
1.189
2
0.347
0.330
0.345
1
0
0
0
液体糟
菌
3.283
3.289
3.2490
糖
3.389
3.333
3.299
糖
1.099
菌
2.987
米
3.352
淀粉转化
8.结果分析与讨论
8.1实验总结
本实验的最终目的是将大米直接加曲，加水糖化发酵、蒸馏而成，其特点是采用生原料，不经蒸煮糊化，不需配槽，整个发酵过程是在液态中进行此法具有投资省，操作简便，清洁卫生，出酒率高的特点，效益明显。
在酿酒过程中，我们组用了两种酒曲，一组是自己制备的菌种，另一组是用的糖化酶和酵母。
很明显自己制备的菌种发酵能力不足，可能由于菌株筛选的不是很好。
最终经过发酵蒸馏酒后，测量液体槽和固体槽中的淀粉含量，计算淀粉转换率。
8.2讨论
8.2．1实验的可靠性
本实验大米发酵是在密闭液态环境中进行的，所以前期发酵过程中没有充分混匀，和空气充分接触致使发酵不足。
发酵酒曲有一组用的是前两次实验制备的菌种，可能制备的不是很好，所以发酵能力不足。
但是除去这些因素，实验结果还是可靠的。
8.2.2实验中的问题及原因分析
发酵过程中出现的问题：
大米，水和酒曲的混合液没有充分混匀，与空气充分接触。
所以要注意观察发酵缸，保证每过一段时间就充分混匀。
②蒸馏过程中的问题：
如果大米发酵的不好，液体中淀粉含量高，蒸馏过程中需要多加几层纱布，以免蒸酒失败。
③淀粉含量测定过程：
各实验器具清理不干净，各实验试剂加入的量要控制好，时间要控制好。
以免影响实验结果。
9.注意事项
1.大米，水和酒曲要按比例加入发酵缸中。
2.发酵前三天必须每天对发酵缸进行搅拌，保证与空气的充分接触，为后期发酵做准备。
3.发酵缸口不能系的太紧，以免发酵太剧烈致使瓶子破裂。
4.酒糟中测量淀粉转换率时，加入的试剂需注意用量。
10.参考文献
[1]沈萍，陈向东主编.微生物学实验[M].第四版.高等教育出版社.
[2]刘德海，杨玉华，李新杰.生料酿酒工艺的研究[J].中国酿造，2001,2.
[3]许育民，杨天宝，王杨，孔红建、。
、以大米为原料的生料酿酒工艺[J].现代商贸工业，2003,5.
[4]许克平.免蒸煮生料酿酒技术[J].农村经济与科技.1999,2.
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