乳样保存条件对乳尿素氮浓度测定的影响.docx

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乳样保存条件对乳尿素氮浓度测定的影响

乳样保存条件对乳尿素氮浓度测定的影响

　　摘要：

研究了３种常用的防腐剂（重铬酸钾、苯甲酸钠和山梨酸钾）以及室温、冷藏和冷冻等３种不同温度的保存条件对牛奶中乳尿素氮浓度测定的影响。

结果表明，添加常规剂量和加倍剂量重铬酸钾乳样的尿素氮浓度与原乳样差异不显著（Ｐ＞０．０５），而添加行业标准量及加倍剂量苯甲酸钠、山梨酸钾的乳样中乳尿素氮浓度显著高于原乳样（Ｐ＜０．０５）；室温和冷藏温度条件下随保存时间的延长，原乳样乳尿素氮浓度迅速降低，而冷冻保存条件下原乳样乳尿素氮浓度基本不变；添加重铬酸钾的乳样在室温、冷藏和冷冻条件下，随着保存时间的延长乳尿素氮浓度均无明显变化。

乳样收集后若不能及时测定乳尿素氮浓度，建议添加重铬酸钾防腐剂，未添加重铬酸钾时冷冻保存。

　　关键词：

乳尿素氮；乳样；防腐剂；温度条件

　　中图分类号：

Ｏ６５７．３２；TS252.26文献标识码：

Ａ文章编号：

0439－８114（２０11）18－3828-03

　　ＥｆｆｅｃｔｏｆＰｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎＣｏｎｄｉｔｉｏｎｓｏｎｔｈｅＣｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＭｉｌｋＵｒｅａＮｉｔｒｏｇｅｎ

　　ＬＩＮＷｅｎ－ｙａｎ，ＺＨＡＩＳｈａｏ－ｗｅｉ，ＣＨＥＮＧＳｈｉ－ｍｉｎｇ

　　（ＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙｆｏｒＡｑｕａｃｕｌｔｕｒｅａｎｄＦｏｏｄＳａｆｅｔｙｏｆＦｕｊｉａｎＰｒｏｖｉｎｃｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ/ＦｉｓｈｅｒｉｅｓＣｏｌｌｅｇｅｏｆＪｉｍｅｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｘｉａｍｅｎ３６１０２１，Ｆｕｊｉａｎ，Ｃｈｉｎａ）

　　Ａｂｓｔｒａｃｔ：

Ｔｈｅｉｍｐａｃｔsｏｆｔｈｒｅｅｃｏｍｍｏｎｌｙｕｓｅｄｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅｓ（ｐｏｔａｓｓｉｕｍｄｉｃｈｒｏｍａｔｅ，ｓｏｄｉｕｍｂｅｎｚｏａｔｅ，ｐｏｔａｓｓｉｕｍｓｏｒｂａｔｅ）ａｔｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅs（ｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｃｈｉｌｌｅｄａｎｄｆｒｏｚｅｎ）ｏｎｔｈｅｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎｏｆtheｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎofｍｉｌｋｕｒｅａｎｉｔｒｏｇｅｎ（ＭＵＮ）ｗereｓｔｕｄｉｅｄｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＭＵＮｗｉｔｈｐｏｔａｓｓｉｕｍｄｉｃｈｒｏｍａｔｅｏｆｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｄｏｓｅｏｒｄｏｕｂｌｉｎｇｄｏｓｅhadｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗｉｔｈｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｍｉｌｋｓａｍｐｌｅ（Ｐ＞０．０５），ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＭＵＮｗｉｔｈｓｏｄｉｕｍｂｅｎｚｏａｔｅａｎｄｐｏｔａｓｓｉｕｍｓｏｒｂａｔｅｏｆｃｏｎｖｅｎｔｉｏｎａｌｄｏｓｅｏｒｄｏｕｂｌｉｎｇｄｏｓｅｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｅｏｒｉｇｉｎａｌｍｉｌｋｓａｍｐｌｅ（Ｐ＜０．０５），ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎatｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅorｃｈｉｌｌｅｄｗｏｕｌｄｍａkｅtheｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＭＵＮｒｅｄｕｃｅrapidlyｗｉｔｈｔｈｅｔｉｍｅｅｘｔｅｎｄｅｄ，ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｏｎatｆｒｏｚｅｎｗｏｕｌｄｍａｄｅtheｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＭＵＮｒｅｍａｉｎｉｎｔｈｅｉｎｉｔｉａｌｌｅｖｅｌ，ｔｈｅｍｉｌｋｓａｍｐｌｅｗｉｔｈｐｏｔａｓｓｉｕｍａｔｒｏｏｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ，ｃｈｉｌｌｅｄａｎｄｆｒｏｚｅｎｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ，ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＭＵＮｈａｄｎｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｃｈａｎｇｅ．Ｏｎｃｅｔｈｅｓａｍｐｌｅｃｏｕｌｄｎｏｔｂｅａｎａｌｙｚｅｄｉｍｍｅｄｉａｔｅｌｙａｆｔｅｒｂｅｉｎｇｃｏｌｌｅｃｔｅｄ，itwasproposedthatｔｈｅｐｏｔａｓｓｉｕｍｄｉｃｈｒｏｍａｔｅｔｏbeａｄｄｅｄｏｒｆｒｏｚｅｎｍｅｔｈｏｄtobeusedwhenthepotassiumdichromatewasn’tadded．

　　Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：

ｍｉｌｋｕｒｅａｎｉｔｒｏｇｅｎ；ｍｉｌｋｓａｍｐｌｅ；ｐｒｅｓｅｒｖａｔｉｖｅ；ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ

　　牛乳中，尿素是非蛋白氮的主要来源，约占全部牛乳中所含氮的５％，其余９５％为真蛋白质［１］。

测定乳尿素氮（ＭｉｌｋＵｒｅａＮｉｔｒｏｇｅｎ，ＭＵＮ）在奶牛生产中具有重要的意义，可利用乳尿素氮来估测奶牛尿氮的排泄量［２］、奶牛的蛋白质营养状况［３，４］、加快奶牛的遗传进展［５］及提高奶牛的繁殖性能［６］。

在实际测定ＭＵＮ的过程中，需要对乳样进行一定条件的保存。

乳样进行保存方式有室温、冷藏和冷冻，并且一般收集的乳样通常会添加防腐剂，如添加０．０６％（ｍ／ｖ）的重铬酸钾等［７］。

不同保存温度条件以及防腐剂的添加对二乙酰一肟法测定结果有无影响，与此相关的研究还鲜见报道，本试验旨在研究不同种类的常用防腐剂及不同保存温度（室温、冷藏、冷冻）对乳尿素氮浓度测定的影响，为乳尿素氮分析在我国奶牛生产实践中的进一步推广应用提供基础数据。

　　１材料和方法

　　１．１材料

　　奶样：

于集美区长富牛奶供奶中心购买长富牌２５０ｍＬ袋装鲜牛奶。

　　１．２主要试剂

　　防腐剂：

重铬酸钾、苯甲酸、山梨酸等均为分析纯；尿素（ＢＵＮ）试剂盒（长春汇力生物技术有限公司生产；二乙酰一肟法测定）。

　　１．３主要仪器

　　ＵＶ－２８０２Ｈ型紫外可见分光光度计［尤尼柯（上海）仪器有限公司，中国］。

　　１．４不同防腐剂及添加剂量对MUN测定的影响

　　１．４．１样品处理原乳样：

取奶样５ｍＬ，以５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，去除上层乳脂，移取下层乳样０．８ｍＬ装入离心管中，保存待用。

添加防腐剂的乳样：

添加常规的乳样，分别取奶样５ｍＬ，各加入０．００３ｇ重铬酸钾（０．０６％，ｍ／Ｖ）、０．００５ｇ苯甲酸钠（０．１％，ｍ／Ｖ）、０．００５ｇ山梨酸钾（０．１％，ｍ／Ｖ）［７，８］，摇匀；同时添加２倍剂量防腐剂的乳样，摇匀后，同原乳样样品前处理方法操作，并保存待用。

　　１．４．２测定ＭＵＮ浓度操作步骤按照试剂盒说明操作，将试剂盒中的试剂Ⅰ和试剂Ⅱ按照体积比

　　２∶１的比例均匀混合，作为显色剂。

样本和试剂的添加量见表１。

　　混匀，置于沸水浴中加热，持续沸腾１０ｍｉｎ后取出，用冷水冲淋５ｍｉｎ，并在５１０ｎｍ下测定标准管吸光度值（Ａ标）和样品管吸光度值（Ａ样），按公式计算测定结果。

　　计算公式：

Ｃ样＝×Ｃ标（其中，Ｃ标＝７．１４ｍｍｏｌ／Ｌ）

　　１．５不同保存条件对MUN测定的影响

　　样品处理：

方法同１．４．１。

原乳样：

各７支分别冷冻、冷藏、８支常温保存。

添加含０．０６％（ｍ／Ｖ）重铬酸钾防腐剂的乳样：

各７支分别冷冻、冷藏、８支常温保存。

　　测定方法：

同１．４．２

　　１．６统计分析

　　所有数据用ＥＸＣＥＬ软件进行处理，并在ＳＰＳＳ１０．０ＡＮＯＮＶＡ模块上进行分析，显著水平为Ｐ＜０．０５。

　　２结果与讨论

　　２．１不同防腐剂及添加水平对MUN测定的影响

　　２．１．１添加重铬酸钾防腐剂的乳样与原乳样的ＭＵＮ浓度比较结果如图１所示。

由图１可知，添加常规剂量重铬酸钾防腐剂的乳样中，ＭＵＮ浓度略高于原乳样，在统计上差异不显著（Ｐ＞０．０５）；添加２倍剂量重铬酸钾防腐剂的乳样中，ＭＵＮ浓度略高于原乳样，同时也稍高于添加常规剂量重铬酸钾乳样的ＭＵＮ浓度，但与二者在统计上差异仍不显著（Ｐ＞０．０５）。

所以推荐使用常规剂量的重铬酸钾防腐剂来保存乳样。

　　２．１．２添加苯甲酸钠防腐剂的乳样与原乳样的ＭＵＮ浓度比较结果如图２所示。

由图２可知，添加常规剂量苯甲酸钠防腐剂的乳样中，ＭＵＮ浓度略高于原乳样，在统计上差异显著（Ｐ＜０．０５）；添加２倍剂量苯甲酸钠防腐剂的乳样中，ＭＵＮ浓度显著高于原乳样（Ｐ＜０．０５），也高于添加常规剂量苯甲酸钠防腐剂的乳样（Ｐ＞０．０５）。

所以不推荐使用苯甲酸钠来保存乳样。

　　２．１．３添加山梨酸钾防腐剂的乳样与原乳样的ＭＵＮ浓度比较结果如图３所示。

由图３可知，添加常规剂量山梨酸钾防腐剂的乳样中，其ＭＵＮ浓度略高于原乳样，在统计上差异显著（Ｐ＜０．０５）；添加２倍剂量山梨酸钾防腐剂的乳样中，其ＭＵＮ浓度显著高于原乳样（Ｐ＜０．０５），也高于添加常规剂量山梨酸钾防腐剂的乳样（Ｐ＞０．０５）。

所以不推荐使用山梨酸钾防腐剂来保存乳样。

　　２．２不同保存条件对MUN测定的影响

　　２．２．１原乳样在不同的保存条件下ＭＵＮ浓度的变化情况结果如图４所示。

由图４可知，对于未添加防腐剂的原乳样，在常温的保存条件下，原乳样的ＭＵＮ浓度逐渐下降，尤其在前６ｄ的下降幅度很大，6d之后的变化幅度逐渐减小，并维持较低水平；在冷藏的保存条件下，4~１０d变化幅度较大，１２d之后的变化不大，也是在较低的水平；在冷冻的保存条件下，原乳样的ＭＵＮ浓度变化不大，保持在初始水平。

　　２．２．２添加重铬酸钾防腐剂的乳样在不同的保存条件下ＭＵＮ浓度的变化情况结果如图５所示。

由图５可知，对于添加常规剂量重铬酸钾防腐剂的乳样，在常温、冷藏和冷冻保存条件下，乳样的ＭＵＮ浓度变化都不大，差异不显著（Ｐ＞０．０５）。

　　Ｍｉｅｔｔｉｎｅｎ等［９］报道，未加防腐剂的乳样在室温条件下，ＭＵＮ浓度逐渐降低，2ｄ后降低了５０％。

Ｈａａｇ［１０］的研究发现，室温下保存乳样８ｄ后，ＭＵＮ浓度降低了５８％。

虽然不同研究室温下ＭＵＮ浓度下降的幅度有些差异，但都表明室温下的乳样测定应该及时进行，以避免ＭＵＮ浓度下降造成测定误差加大。

　　而郭同军等［１１］在对牛奶保存方法和采样时间对乳尿素氮变化的影响研究中发现，与鲜样相比，添加防腐剂保存的乳样和通过冷冻方法保存的乳样ＭＵＮ浓度都上升，其排序为：

添加防腐剂的ＭＵＮ浓度＞冷冻方法保存乳样的ＭＵＮ浓度＞鲜样的ＭＵＮ浓度。

加防腐剂保存乳样的ＭＵＮ浓度与鲜样的ＭＵＮ浓度差异极显著（Ｐ＜０．０１），与冷冻保存样ＭＵＮ浓度差异不显著；冷冻保存样的ＭＵＮ浓度与鲜样ＭＵＮ浓度差异极显著（Ｐ＜０．０１）。

这与本研究的结果差异较大，可能是测定方法差异所致。

　　在鲜乳中占活动优势的微生物主要是一些细菌、酵母菌和少数霉菌［１２］。

大多数的细菌、放线菌、真菌都能产生脲酶，能分解尿素为氨［１３］。

牛奶中添加了防腐剂（重铬酸钾）或冷冻保存可能是抑制了产生脲酶的一些微生物（主要是细菌和霉菌）的生长繁殖，从而可以长时间保持牛奶ＭＵＮ的浓度不变。

室温下未加防腐剂的乳样ＭＵＮ浓度2d后急剧下降，很可能是此时产生脲酶的细菌和真菌大量繁殖所致。

　　由此可见，冷冻条件保存和添加适宜的防腐剂的乳样在测定ＭＵＮ浓度时不会造成影响，可在２周内维持不变，未添加防腐剂的乳样在室温条件下应及时测定。

　　３小结

　　在乳样的保存过程中，不论是常规剂量还是２倍剂量的重铬酸钾都能保持乳样的ＭＵＮ浓度。

乳样中添加苯甲酸钠、山梨酸钾的测定结果却显著高于原乳样。

对于室温、冷藏、冷冻这３种常用的保存乳样的方式，室温和冷藏都会使ＭＵＮ浓度随时间推移降低幅度增大，冷冻能够保持乳样ＭＵＮ浓度保持不变。

　　参考文献：

　　［１］杨凤．动物营养学（第二版）［Ｍ］．北京：

中国农业出版社，２００６．

　　［２］ＺＨＡＩＳ，ＬＩＵＪ，ＷＵＹ，etal．ＰｒｅｄｉｃｔｉｎｇｕｒｉｎａｒｙｎｉｔｒｏｇｅｎｅｘｃｒｅｔｉｏｎｂｙｍｉｌｋｕｒｅａｎｉｔｒｏｇｅｎｉｎｌａｃｔａｔｉｎｇＣｈｉｎｅｓｅＨｏｌｓｔｅｉｎｃｏｗｓ［Ｊ］．ＡｎｉｍａｌＳｃｉｅｎｃｅＪｏｕｒｎａｌ，２００７，７８（４）：

３９５－３９９．

　　［３］ＷＡＴＴＩＡＵＸＭＡ，ＫＡＲＧＫＬ．Ｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｆｏｒａｌｆａｌｆａａｎｄｃｏｒｎｓｉｌａｇｅ－Ｂａｓｅｄｄｉｅｔｓ：

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　　［５］ＷＯＯＤＧＭ，ＢＯＥＴＴＣＨＥＲＰＪ，ＪＡＭＲＯＺＩＫＪ，ｅｔａｌ．Ｅｓｔｉｍａｔｉｏｎｏｆｇｅｎｅｔｉｃｐａｒａｍｅｔｅｒｓｆｏｒｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｏｆｍｉｌｋｕｒｅａｎｉｔｒｏｇｅｎ［Ｊ］．ＪＤａｉｒｙＳｃｉ，２００３，８６：

２４６２-２４６９．

　　［６］ＨＯＪＭＡＮＤ，ＫＲＯＬＬＯ，ＡＤＩＮＧ，ｅｔａｌ．Ｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎｍｉｌｋｕｒｅａａｎｄｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ，ｎｕｔｒｉｔｉｏｎ，ａｎｄｆｅｒｔｉｌｉｔｙｔｒａｉｔｓｉｎＩｓｒａｅｌｉｄａｉｒｙｈｅｒｄｓ［Ｊ］．ＤａｉｒｙＳｃｉ，２００４，８７：

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　　［７］吴志广，李建国，李秋凤，等．日粮氮氨酸锌水平对奶牛生产性能和血液指标的影响［Ｊ］．中国兽医学报，２００８，２８（２）：

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　　［８］ＧＢ２７６０－２００７食品添加剂使用卫生标准［Ｓ］．

　　［９］ＭＩＥＴＴＩＮＥＮＰＶ，ＪＵＶＯＮＥＮＲＯ．Ｄｉｕｒｎａｌｖａｒｉａｔｉｏｎｓｏｆｓｅｒｕｍａｎｄｍｉｌｋｕｒｅａｌｅｖｅｌｓｉｎｄａｉｒｙｃｏｗｓ［Ｊ］．ＡｃｔａＡｇｒｉｃＳａｃｎｄ，１９９０，４０：

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　　［１０］ＨＡＡＧＴ．Ｔｈｅｖａｌｕｅｏｆｕｒｅａａｎａｌｙｓｉｓｉｎｃｏｗｍｉｌｋｅｓｐｅｃｉａｌｌｙｉｎｃａｓｅｏｆｒｅｇｕｌａｒｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｓ［Ｄ］．ＪｕｓｔｕｓＬｉｅｂｉｇＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙＧｉｅｓｓｅｎ，１９８８．

　　［１１］郭同军，王加启，卜登攀，等．牛奶保存方法和采样时间对乳尿素氮变化的影响［Ｊ］．中国奶牛，２００８，６（１）：

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　　［１２］杨洁彬，李淑高，张簇，等．食品微生物学［Ｍ］．第二版.北京：

北京农业大学出版社，１９９５．

　　［１３］闵航，赵宇华．微生物学［Ｍ］．杭州：

浙江大学出版社，１９９８．