浅论不同神经功能评分标准在小鼠EAE模型评价中的比较.docx

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浅论不同神经功能评分标准在小鼠EAE模型评价中的比较

浅论不同神经功能评分标准在小鼠EAE模型评价中的比较

【摘要】　　目的：

比较不同的神经功能损伤评分标准对小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎运动功能障碍评估的效能。

方法：

应用MOG35-55多肽加完全福氏佐剂乳化后免疫20只C57BL/6小鼠，复制EAE小鼠模型，并使用3种不同的评分标准观察和评估实验动物的发病情况，对实验小鼠在发病初期、高峰期的神经功能障碍进行定量的功能损伤评价。

结果：

3种评分标准比较，在发病初期，15分法和7分法评估神经损伤症状的敏感性相当，比5分法高；高峰期，以症状评分与病理评分的相关性程度来比较3种评分法的效度，15分法效度最高，7分法次之。

结论：

Weaver’s15分法评价EAE模型神经功能损伤症状，具有明显的优势，推荐作为今后EAE研究的首选评分法。

【关键词】实验性自身免疫性脑脊髓炎动物模型评分标准

　　Abstract:

Objective:

TocompareseveralmethodsofclinicalassessmentstandardsinmicemodelofEAE.Methods:

Themicemodelsofexperimentalautoimmuneencephalomyelitis（EAE）wereestablished，andtheneuralsymptomsandpathologicalchangeswereobserved.Threeclinicalassessmentmethods，including5-point，7-pointand15-point，wereusedtoassessneurologicalfunction.Results:

Ontheearlyonset，7-point，the15-pointdiseasescorescalesweremoresensitivitythan5-pointscorescaletotheincidenceofdisease.Andthe15-pointdiseasescorescalewasstronglycorrelatedwithpathologicalchangesonEAEmodelandhadgoodvalidity.Conclusion:

The15-pointdiseasescorescalehasaobviousdominancefortheassessmentofthesymptonoftheneurologicalfunction.Therefore，the15-pointdiseasescorescaleisrecommendedasthefirstmethodtoselect.

　　Keywords:

experimentalautoimmuneencephalomyelitis；animalmodel；mice；clinicalas-sessment

　　实验性自身免疫性脑脊髓炎模型是国际公认的多发性硬化（multiplesclerosis，MS）动物模型，被广泛用于MS发病机制和评价免疫调节药物的实验研究。

EAE模型技术日益成熟，而且不同的实验动物和致敏蛋白使EAE模型呈现为不同的临床表现和病程［1］。

但由于动物对检测应答具局限性以及目前EAE模型不同评分标准较多，使得EAE模型评分就同一症状而言，其评分标准在大范围内也尚未达到规范化和统一化。

因此本实验针对目前文献中小鼠EAE模型最常用的几种评定标准进行了敏感度与效度的比较研究。

　　1材料和方法

　　动物分组和模型制作

　　动物分组及材料：

8～10周龄的C57BL/6小鼠，体重18～20g，分为EAE模型组和正常对照组，雌雄各半。

实验动物由北京军事动物研究所提供，饲养于本实验室清洁级动物房。

MOG35-55多肽由西安美联多肽技术公司合成，采用高效液相色谱仪分离纯化，纯度95%。

不完全福氏佐剂、百日咳毒素均购自美国Sigma公司；结核杆菌素购自美国Difco公司。

　　EAE模型制作：

用mol/L的PBS将MOG35-55稀释为2mg/mL，然后将稀释液与等量的完全福氏佐剂充分混合，通过三通管将乳剂抽打为油包水状态，即为诱导EAE的抗原乳剂。

EAE组小鼠于背部两侧皮下注射抗原乳剂。

对照组不予抗原处理。

免疫后第0、第48小时给予全部小鼠腹腔注射百日咳毒素，每只动物500ng/mL。

　　评价标准

　　5分法评分标准[2-3]分级0分为不发病；1分为尾巴无力；2分为轻微后肢无力；3分为严重后肢麻痹；4分为四肢麻痹；5分为濒死或死亡。

　　7分法评分标准[4-5]分级0分为不发病；1分为尾巴半瘫；2分为尾巴全瘫；3分为步态异常；4分为后肢轻瘫；5分为后肢重瘫；6分为前肢累及；7分为濒死状态或死亡。

　　15分法评分标准[6-7]将尾巴活动分为3个等级，肢体活动分为4个等级，通过累积分数得出评分。

若出现死亡则总分记为15分。

　　评价方法免疫当天起每天对小鼠称重，并采用双盲法进行神经功能评分。

由两位非实验人员观察并评价，参照评分细则进行评分。

首先由一位人员进行5分法和7分法评分，两者可以同时进行。

上述评分30min后，再由另外一位观察者进行15分法评分。

由于小鼠昼夜活动差异很大，每天均于上午8时进行评价。

　　组织取材和病理学检查EAE组小鼠于发病高峰期处死取材，对照组全部于第22天处死。

腹腔注射%戊巴比妥钠麻醉，予预冷的PBS心脏灌注至肝脏变灰白，随即取出大脑、脊髓浸入4%多聚甲醛固定。

石蜡包埋后切片，厚度5μm，取大脑视交叉层面、颈髓、腰髓层面进行HE染色。

使用Leica光镜显微镜观察病理改变。

　　对HE染色进行组织学评分，参照Okuda的病理分度标准为（400倍镜下计数）0：

没有炎症变化；1：

炎性细胞浸润仅限于血管周围和脊膜周围；2：

脊髓内轻微的炎性细胞浸润；3：

脊髓内中度的炎性细胞浸润；4：

脊髓内重度的炎性细胞浸润。

　　统计学处理方法组间计量资料进行t检验或校正t检验，发病早期敏感性评价采用Kaplan-Meier分析，效度检验使用pearson相关系数分析，10分制标准化换算=原始分/评分总分×10分。

　　2结果

　　发病情况EAE组20只小鼠，全部发病。

EAE组动物在免疫后第12天陆续开始发病，表现为食欲下降、体重减轻、皮毛不光滑、精神萎靡，并相继出现神经系统症状，表现为尾部无力拖垂、步履蹒跚或拖行、大小便失禁。

免疫后第16～第20天到达疾病高峰期，达到高峰期后将小鼠处死。

　　不同评分标准的比较

　　神经功能评分情况：

EAE组中最早在免疫后第12天开始发病，大多数小鼠均集中在免疫后第15～第18天发病，并于2～4d后达到疾病高峰。

采用小鼠神经功能评分5分法、7分法、15分法分别对EAE小鼠的发病潜伏期、达峰期、高峰期评分分别进行评价。

对潜伏期的评价：

三种评分方法差异无显着性；对达峰期评价：

15分法为d，与之相比，7分法和5分法达峰期缩短，其中5分法为d，两组间差异有显着性。

因为三种评分的总分值不同，将三个评分换算为标准分10分后，可见5分法高峰期评分最高，7分法次之，15分法最低，但差异无显着性。

动态神经功能评价曲线可见5分法和7分法在疾病进展阶段评分结果较平缓；而15分法在发病后不同时间点均有明显变化，呈渐进性进展过程。

　　不同评分标准敏感度的比较：

实验组动物于免疫后第12天陆续发病，至第18天实验组全部小鼠均发病。

统计不同发病诱导期内三种评分标准对小鼠神经功能损伤的评估结果，分析各时期三种评分标准的敏感度，可见发病初期7分法和15分法评价的症状发现率比5分法高。

通过Kaplan-Meier分析比较三种评分方法发病早期各时间点（免疫后第12～第18天）症状发现率，5分法和7、15分法差异有显着性，说明7分法和15分法早期发现症状的敏感性高于5分法。

　　不同评分标准与病理评分相关性比较:

HE染色显示EAE组小鼠的大脑、颈段、腰段脊髓中有大量炎性细胞浸润，血管周围袖套样改变，脊膜增厚，脊髓尤为明显（见图2A）。

对照组小鼠大脑和脊髓未见异常（见图2B）。

用三种评分法评出的每只小鼠最高临床评分与相应小鼠脊髓病理评分的相关性比较来进行效度检验，结果显示用15分法评分标准评估的最高神经功能损伤评分与病理改变相关性较高，效度更好。

5分法和7分法与病理相关性较差。

　　3讨论

　　EAE模型的成功复制和EAE动物神经功能损伤的客观科学评价是中枢系统炎症研究中必须掌握的一项重要的技术平台，无论是用于MS的发病机制研究还是用于神经药理作用观察实验；EAE神经功能损伤评定，更是客观测量动物的病情变化或整体评价药物作用强弱的量化工具，它的科学性和效能直接影响到对实验结果的分析与评价。

　　5分法最早由Kono等[2-3]建立，并成为EAE模型神经功能损伤评分的主流。

此评分法根据EAE小鼠的神经功能损伤大体变化程度而划分，方法较为粗略简单，容易掌握。

然而，5分法以及7分法的评分标准是每个分值分别代表一个独立的标准，当EAE小鼠下肢重瘫同时累及前肢时，此时评分3分或4分很难界定，常常由2分直接跳至4分，因此EAE小鼠的损伤程度的差异性难以体现，神经功能损伤进展的过程也揭示不足。

后继研究者对Kono’s5分法进行了修订，推出许多改良的5分法[9-10]，这些评分在5分法分级基础上，加予分来评价过渡症状。

　　Hooper’s7分法在5分法的基础上进行细化，将尾巴肌力增加为2个等级，后肢肌力增加为3个等级。

但本实验结果表明，5分法和7分法在各项评估结果上无明显差异，说明7分法并没有改善5分法的缺点，对于EAE小鼠的损伤程度的差异性亦未能很好体现。

7分法亦衍生出8分法、9分法[11-12]等评分标准。

　　2000年Weaver建立了15分法，对症状等级进行了进一步细化，并首次采用累积计分法，Weaver等发现，EAE小鼠表现双后肢重瘫累及前肢和双后肢轻瘫累及前肢时，用5分法评价时分值均为4分，但在15分法中则评分介于7～14分之间，因此15分法更能反映EAE小鼠的发病轻重程度。

通过本实验研究，总结了15分法几个特点：

①15分法比5分法、7分法更能反映EAE模型的疾病进展情况。

不同于以往每个分值分别代表一个独立的标准，15分法对每个肢体均进行定量评分，采用累积法计分，更好地体现了EAE的渐进性进展病程，在评价中重度神经功能损伤时尤其明显。

②15分法有较好的敏感度和效度。

EAE小鼠起病一般从尾巴开始，逐渐累及四肢。

7分法和15分法均对小鼠尾巴肌力细化，故对早期评估小鼠神经功能损伤的敏感性比5分法高。

与病理相关性比较发现，较之5分法和7分法，15分法所得的高峰期评分与病理评分有较好的相关性。

③15评分法较客观，该法无需特殊设备，易于推广，但观察人员应进行一定的训练，以尽量减少主观因素的影响。

从结果来看，15分法评分几乎包括了EAE小鼠发病过程中所有行为变化。

通过本实验，我们认为Weaver’s15分法更适合EAE神经功能损伤的量化评价，是值得推荐的EAE小鼠评分标准。

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