维生素C的发酵生产.docx
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维生素C的发酵生产
湖北大学
发酵工程与设备课程设计
题目维生素c的发酵生产
专业年级2008级生物工程
学生姓名陈盛
学号07100130
指导老师倪红
2011年6月10日
1.前言-------------------------------------------------1
维生素C的性质--------------------------------------------1
维生素C的功能与用途--------------------------------------1
维生素C的生产现状----------------------------------------1
维生素C的研究发展------------------------------------------------1
2.发酵机制
我国维生素C二步发酵法发酵机理----------------------------------------------2
3.发酵工艺及特点-----------------------------------------3
二步发酵法--------------------------------------------------3
二步发酵法生产维生素C的工艺流程----------------------------4
3.2.1加热沉淀法---------------------------------------------------------6
3.2.2化学凝聚法---------------------------------------------------------6
3.2.3超滤---------------------------------------------------------------6
4.菌种培养基及种子的扩大培养-----------------------------6
第一步发酵-----------------------------------------------------------6
4.1.1菌种---------------------------------------------------------------6
4.1.2一级种子扩大培养----------------------------------------------------7
4.1.3第一步发酵培养------------------------------------------------------7
第二步发酵----------------------------------------------------------7
4.2.1菌种----------------------------------------------------------------7
4.2.2二级种子扩大培养----------------------------------------------------7
4.2.3第二步发酵培养------------------------------------------------------7
5.发酵工艺中的部分设备-----------------------------------7
机械搅拌罐---------------------------------------------------7
气升式发酵罐-------------------------------------------------------7
6.无菌空气制备系统---------------------------------------9
发酵空气的标准-----------------------------------------------9
空气预处理与设备---------------------------------------------9
空气过滤灭菌的工艺流程---------------------------------------9
7.部分工艺计算-------------------------------------------10
物料衡算---------------------------------------------------10
每天发酵液体积-----------------------------------------------10
发酵罐公称体积----------------------------------------------10
种子罐容积和台数-------------------------------------------10
种子罐公称体积----------------------------------------------10
发酵罐发酵过程中热效应计算----------------------------------10
8.三废处理-----------------------------------------------11
三废生物处理的目的------------------------------------------11
废水处理方法------------------------------------------------12
生物滤过法净化处理------------------------------------------12
生物滤过池法的基本流程-------------------------------------------13
9参考文献---------------------------------------------------------------14
维生素C的发酵生产
1前言
维生素C的性质
维生素C（VitaminC，AscorbicAcid）又叫L-抗坏血酸，是一种水溶性维生素。
化学性质分子式：
C6H8O6；分子量：
；酸性，具有较强的还原性，加热或在溶液中易氧化分解，在碱性条件下更易被氧化。
物理性质外观：
无色晶体；熔点：
190-192℃；沸点：
（无）；紫外吸收最大值：
245nm；荧光光谱：
激发波长－无nm，荧光波长－无nm；溶解性：
水溶性维生素。
代谢食物中的维生素C被人体小肠上段吸收。
一旦吸收，就分布到体内所有的水溶性结构中，正常成人体内的维生素C代谢活性池中约有1500mg维生素C，最高储存峰值为3000mg维生素C。
正常情况下，维生素C绝大部分在体内经代谢分解成草酸或与硫酸结合生成抗坏血酸-2-硫酸由尿排出；另一部分可直接由尿排出体外。
维生素C的功能与用途
胶原蛋白的合成需要维生素C参加，所以VC缺乏食用富含维生素C的食物可防晒，胶原蛋白不能正常合成，导致细胞连接障碍。
人体由细胞组成，细胞靠细胞间质把它们联系起来，细胞间质的关键成分是胶原蛋白。
胶原蛋白占身体蛋白质的1/3，生成结缔组织，构成身体骨架。
如骨骼、血管、韧带等，决定了皮肤的弹性，保护大脑，并且有助于人体创伤的愈合。
坏血病血管壁的强度和VC有很大关系。
微血管是所有血管中最细小的，管壁可能只有一个细胞的厚度，其强度、弹性是由负责连接细胞具有胶泥作用的胶原蛋白所决定。
当体内VC不足，微血管容易破裂，血液流到邻近组织。
这种情况在皮肤表面发生，则产生淤血、紫癍；在体内发生则引起疼痛和关节涨痛。
严重情况在胃、肠道、鼻、肾脏及骨膜下面均可有出血现象，乃至死亡。
牙龈萎缩、出血预防动脉硬化可促进胆固醇的排泄，防止胆固醇在动脉内壁沉积，甚至可以使沉积的粥样斑块溶解。
抗氧化剂可以保护其它抗氧化剂，如维生素A、维生素E、不饱和脂肪酸，防止自由基对人体的伤害。
治疗贫血使难以吸收利用的三价铁还原成二价铁，促进肠道对铁的吸收，提高肝脏对铁的利用率，有助于治疗缺铁性贫血。
防癌丰富的胶原蛋白有助于防止癌细胞的扩散；VC的抗氧化作用可以抵御自由基对细胞的伤害防止细胞的变异；阻断亚硝酸盐和仲胺形成强致癌物亚硝胺。
曾有人对因癌症死亡病人解剖发现病人体内的VC含量几乎为零。
保护细胞、解毒，保护肝脏 在人的生命活动中，保证细胞的完整性和代谢的正常进行至关重要。
为此，谷胱甘肽和酶起着重要作用。
谷胱甘肽是由谷氨酸、胱氨酸和甘氨酸组成的短肽，在体内有氧化还原作用。
它有两种存在形式，即氧化型和还原型，还原型对保证细胞膜的完整性起重要作用。
VC是一种强抗氧化剂，其本身被氧化，而使氧化型谷胱甘肽还原为还原型谷胱甘肽，从而发挥抗氧化作用。
酶是生化反应的催化剂，有些酶需要有自由的巯基（-SH）才能保持活性。
VC能够使双硫键（-S-S）还原为-SH，从而提高相关酶的活性，发挥抗氧化的作用。
从以上可知，只要VC充足，则VC、谷胱甘肽、-SH形成有力的抗氧化组合拳，清除自由基，阻止脂类过氧化及某些化学物质的毒害作用，保护肝脏的解毒能力和细胞的正常代谢。
提高人体的免疫力白细胞含有丰富的VC，当机体感染时白细胞内的VC急剧减少。
VC可增强中性粒细胞的趋化性和变形能力，提高杀菌能力。
促进淋巴母细胞的生成，提高机体对外来和恶变细胞的识别和杀灭。
参与免疫球蛋白的合成。
提高CI补体酯酶活性，增加补体CI的产生。
促进干扰素的产生，干扰病毒mRNA的转录，抑制病毒的增生。
提高机体的应急能力人体受到异常的刺激，如剧痛、寒冷、缺氧、精神强刺激，会引发抵御异常刺激的紧张状态。
该状态伴有一系列身体，包括交感神经兴奋、肾上腺髓质和皮质激素分泌增多。
肾上腺髓质所分泌的肾上腺素和去甲肾上腺素是有酪氨酸转化而来，在次过程需要VC的参与。
1．3国内外的生产现状目前，我国的二步发酵法与国外的莱氏法共存，各有优势，随着对vc发酵工艺研究深入，将进一步提高底物浓度、降低生产成本和提高发酵收率。
而新二步发酵法和一步发酵法为以后的科研生产开辟了一条新的途径，但离实际应用尚有距离，从基因工程的研究来看，不是短期可以奏效的，只有科研单位和工厂的合作，才能及早实现其工业化。
随着全球范围对Vc需求量的不断增长,其生产工艺也得到不断的改进。
Vc生产最早是使用莱氏法,此法早在30年代就研究成功。
D-葡萄糖H2/cat高压D-山梨醇黑醋菌[O]L-山梨糖CH3COCH3H2SO4·SO3双丙酮-L-山梨糖NaOClNiSO4双丙酮-2-酮-L-古洛糖酸H+3O2-酮-L-古洛糖酸1化学转化维生素C。
此法存在着工序繁多、劳动、强度大等缺点。
国外在此基础上已作改进,尤其是在装备工程上的优势,当前还用于生产。
但国内已采用我国自己发明的发酵法代替莱氏法生产Vc。
发酵法生产Vc可以分为发酵、提取和转化三大步骤。
即先从D-山梨醇发酵,提取出Vc前体2-酮-L-古洛糖酸（2-酮基-L-古龙酸,1）再用化学法将1转化为Vc。
国内外为提高Vc的质量和收率对发酵法的生产工艺一直在进行不断的改进。
1．4维生素C的研究发展VC是我国自主知识产权开发的首批西药之一，也是我国最主要的出口刨汇原料药之一。
二步发酵法是我国VC生产的主要工艺方法，然而该法不能直接以葡萄糖为发酵料，且涉及二步发酵三种菌，工序繁琐。
采用基因工程等先进技术，选育直接以葡萄糖为发酵原料的优良菌株和优化发酵条件将是我国VC生产技术研究的主要方向。
此外，目前世界上很多国家正尝试以真核生物为研究对象，利用它们合成VC的代谢途径开发更加环保的生物合成方法。
从我国的二步发酵法推广后逐步取代莱氏法这一过程可以预测，随着生物技术的不断发展和更具优势的生物合成VC方法的不断涌现，生物法必将完全取代化学法在VC生产中的地位。
为了保持我国在世界VC生产上的优势地位，必须加强VC生产的基础研究工作。
2发酵机制（二步发酵法）
我国维生素C二步发酵法发酵机理20世纪70年代初，中国科学院微生物研究所和北京制药厂合作，研制成功了“二步发酵法”制备VC的新工艺。
该法以生物氧化过程代替莱氏路线中的部分纯化过程，简化了生产工艺，降低了生产成本，减少了“三废”污染多年以来一直被国内厂家使用。
二步发酵法生产VC可以分为发酵、提取和转化三大步骤即D-山梨醇先经细菌氧化为L一山梨糖，再通过细菌发酵生成VC前体2-KLG，最后用化学法将2-KLG转化为VC。
在几十年的工艺发展中，二步发酵法工艺不断地得到了改进。
混合发酵中大菌和小菌的关系我国维生素C二步发酵法涉及小菌和大菌2个菌株。
其中小菌为产酸菌，但单独培养传代困难，且产酸能力很低;大菌不产酸，但可促进小菌生长和产酸，为小菌的伴生菌。
魏东芝等曾提出大菌为小菌提供某种生长因子促进小菌生长的设想。
冯树等〔川研究证实，大菌胞内液和胞外液均可促进小菌生长，缩短小菌生长的延迟期;大菌的胞外液可促进小菌产酸，表明大菌通过释放某些代谢活性物质促进小菌产酸，并已从大菌胞外液中分离出一种可促进小菌产酸的蛋白。
该活性蛋白的形成规律和作用机制尚在探索中。
在混合发酵中，大菌不代谢L一山梨糖，其I洲一山梨糖的消耗是小菌生长和代谢的结果。
L一山梨糖在转化合成2一酮基一L一古龙酸的同时也可形成其它副产物或代谢为c（无和践<）[川。
李强等报道〔23]，该混合发酵体系中氮源代谢与单一菌种发酵相比有其特殊性，尿素的加入有2个作用:
作为生理碱性物质调节pH值和为菌体代谢提供一部分氮源。
巨大芽抱杆菌由营养体转变为芽抱，体系蛋白含量随发酵时间延长而不断增加。
体系中17种氨基酸按其变化规律分为3类，其变化规律与混菌的生长规律相吻合。
L一山梨糖代谢途径及酶学研究我国维生素C二步发酵中L一山梨糖的代谢途径尚无报道。
有关的酶学研究进行得很少。
蒋宇扬等从维生素c生产菌中分离出2一酮基一L一占龙酸还原酶，并对其性质进行了研究。
该酶存在于小菌胞质中，分子量为90KDa，由2个分别为53K〕和32KI）a的亚基组成。
在整个发酵过程中其活性和比活与生产菌的生长保持同步，其合成不受L一山梨糖和ZK6A的诱导，为小菌的组成酶。
赵巍等已得到2一酮基一L一古龙酸还原酶的基因片段并对其进行了克隆。
单菌发酵L一山梨糖生成ZKGA的研究中国科学院沈阳应用生态所焦鹏、王书锦等近年致力于vc二步发酵法第二步单菌发酵L一山梨糖生成ZKGA的研究。
他们采用高效快速分离筛选新体系，从103个样品中分离筛选到J26，91一2，91一4等多株可单独利用L一山梨糖产ZKGA的新菌株。
初步发酵实验表明:
J26经10批次发酵平均产ZKGA达57以L，转化率达%;91-2，91一4菌株的摇瓶发酵实验的产酸量分别达到45以L和29酬L，转化率分别达到52%和34%。
3发酵工艺及特点
二步发酵法20世纪70年代初，中国科学院微生物研究所和北京制药厂合作，研制成功了“二步发酵法”制备VC的新工艺。
该法以生物氧化过程代替莱氏路线中的部分纯化过程，简化了生产工艺，降低了生产成本，减少了“三废”污染多年以来一直被国内厂家使用。
二步发酵法生产VC可以分为发酵、提取和转化三大步骤即D-山梨醇先经细菌氧化为L一山梨糖，再通过细菌发酵生成VC前体2-KLG，最后用化学法将2-KLG转化为VC。
在几十年的工艺发展中，二步发酵法工艺不断地得到了改进。
二步发酵法生产维生素C的工艺流程
3.2.1加热沉淀法加热沉淀法是2-KLG分离提纯的传统工艺，分离手段较为落后。
此工艺通用氢型树脂，调pH至蛋白质的等电点后加热除蛋白。
采用此工艺会造成有效成分在高温下降解损失，且发酵液直接通过树脂柱，造成树脂表面污染，降低树脂的交换容量和收率。
两次通过树脂柱带进了大量水分，也增大了浓缩耗能。
3.2.2化学凝聚法化学凝聚法是通过加入化学絮凝剂来除去蛋白质、菌体、色素等杂质，避免了加热沉淀时有效成分的损失。
季光辉等采用化学凝聚法对VC发酵液进行预处理，使2-KLG的滤液质量提高，提取前步收率提高5．2，VC总收率提高2．5以上。
陈雷等以壳聚糖为主凝剂，聚丙烯酰胺为助凝剂，通过化学凝聚法除蛋白工艺，提取收率由原来的76提高到82，古龙酸优级品率由原来的35提高到6O，成本比原来降低2O。
但是，化学凝聚法也存在不足，主要表现在处理后的发酵液离心后所得的上清液中仍然存在一定量的蛋白，如发酵液染菌则处理的效果更不明显，上清液浑浊，严重影响产品的质量和收率。
此外，所用的化学絮凝剂也可能对环境造成污染。
3.2.3超滤超滤是一种新兴的膜处理技术，此法具有操作方便、节能、不造成新的环境污染等优点，因此在2-KLG的分离提纯中的应用日益广泛。
此法与加热沉淀法不同的是，可在常温下操作，可减少有效成分的损失；在用膜除蛋白的过程中，无任何新的化学物质加入，可减少对树脂的污染和损耗，降低酸碱用量，减少三废排放。
与化学凝聚法不同的是，在处理染菌的发酵液时仍可达到较好的处理效果。
我国的东北制药厂1995年从丹麦引进目前全国最大膜面积的平板超滤装置后，2-KLG的分离提纯成本比原先的化学凝聚法节约了600万元，其收率和生产的自动化、连续化程度也明显提高。
随着新型膜材料技术的开发，如陶瓷膜、不锈钢膜等的应用，超滤法的应用效果会有进一步的提高。
同时，国内外正在探索反渗透、纳滤等后序处理新工艺的应用，以完善工艺联结。
4菌种的制备及种子的扩大培养（此部分介绍实验室种子的制备、种子罐种
子的制备工艺及技术参数要求）
第一步发酵
4.1.1菌种一步发酵中所用菌种为生黑葡萄糖酸杆菌（Gluconobactermelagenus），简称黑醋菌。
最常用的生产菌株为R—30，其主要特征是：
细胞椭圆至短杆状，革兰氏染色阳性，无芽孢大小为一umx。
端生草根鞭毛运动，菌落边缘整介，微显浅褐色。
生长最适温度为34℃±l℃，氧化D-山梨醇的发酵收率可达98％以上。
4.1.2一级种子扩大培养种子培养基成分为：
山梨醇20％，酵母膏％，碳酸钙%，无机盐溶液％。
其中，无机盐溶液的组成为：
MgSO4·7H2O1.25g／100mL，（NH4）H2PO47．5g／100mL，KH2PO45g／100mI,K2SO41.25g／6.7,121℃,30min灭菌。
4.1.3第一步发酵培养发酵液培养基成分为：
酵母膏％，碳酸钙％，玉米浆％，复合维生素B％，山梨醇浓度视需要而定。
在发酵过程中，控制发酵温度（34±1）℃，初始～。
该氧化反应的耗氧量较大，所以通气比要求1:
1VVM以上。
即使在通气量较大，且搅拌转速较高的条件下，发酵至4h后溶解氧浓度急剧下降，甚至接近于零。
直到10h左右才逐渐回升。
当溶解氧浓度回复至最高点，成水平直线时，表示该反应已达终点。
D-山梨醇转化为L-山梨糖的生物转化率达98%以上。
发酵液经低温60℃灭菌20min,冷却至30℃，作为第二步发酵的原料。
第二步发酵法
4.2.1菌种第二步发酵采用的菌种为由大、小两株细菌组成的混合菌种。
小菌为氧化葡萄糖酸杆菌（GluconobacterOxydans）,大菌可采用巨大芽孢杆菌（Bacillusmegateriam）,称2980菌，或蜡状芽孢杆菌（Bacilluscereus）,称152菌，或浸麻芽孢杆菌（Bacillusmacerans）,称169菌。
也可采用其他一些杆菌与小菌混合培养。
但工业上使用最多的是2980及152菌混合菌。
氧化葡萄糖酸杆菌的主要特征为：
细胞椭圆至短杆状，革兰氏染色阳性，无芽孢。
30℃培养2d后大小为（~）μm×（~）μm，单个或成对排列。
在葡萄糖培养基上生长极微弱，甘露醇培养基上生长良好。
4.2.2二级种子扩大培养种子培养基成分为：
酵母膏%,牛肉膏%，玉米浆%，蛋白胨%，尿素%，山梨糖%，另加某些无机盐。
PH6.7,121℃,30min灭菌。
4.2.3第二步发酵培养发酵液培养成分为：
玉米浆%，尿素%，无机盐及山梨糖。
第二步发酵为混合菌种发酵。
由于大、小菌两者的最适培养条件是不同的，所以操作适宜条件是兼顾大、小菌两者的条件。
通常操作温度为30℃；初始pH控制在左右。
该反应虽属氧化反应，但对氧的消耗并不很大。
气升式发酵罐非常适合该发酵过程。
溶氧浓度在20%即可。
山梨糖的初始浓度对产物的生成影响较大。
间歇发酵时初始山梨糖浓度超过80g/L，会对产物产生抑制[15]。
所以要取得最高浓度2KGA，需采用高浓度山梨糖流加发酵的方式。
若采用建立在数学模型基础上的流加控制策略，课获得高浓度的2KGA，二步收率可达83%[16]。
5.发酵工艺中的部分设备
机械搅拌罐第一步发酵采用机械搅拌发酵罐（图5）。
机械搅拌通风发酵罐是利用机械搅拌器的作用，使空气和醪液充分混合促使氧在醪液中溶解，以保证供给微生物生长繁殖、代谢所需要的氧气。
气升式发酵罐第二步发酵采用气升式发酵罐（图6）。
在反应器内没有搅拌器，其中央有一个导流筒，将发酵液分为上升区（导流筒内）和下降区（导流筒外），在上升区的下部安装了空气喷嘴，或环型空气分布管，空气分布管的下方有许多喷孔。
反应溶液分布均匀，基质和溶氧均匀分散，使基质在发酵罐内各处的浓度均匀，溶解氧恒定。
图5机械搅拌发酵罐
图6气（带）升式发酵罐
6.无菌空气制备系统
微生物在生产过程中需要氧气，因此需要通入空气。
然而空气是氧气、二氧化碳、氮气等的混合物，其中还有水汽及悬浮的尘埃，包括各种微粒、灰尘及微生物。
这就需要对空气严格灭菌，达到无菌状态，才能使用。
在发酵工业中，大多才用过滤介质灭菌的方法制备无菌空气。
发酵空气的标准
发酵需要连续的、一定流量的压缩无菌空气。
空气流量﹝VVM，单位时间（min）单位发酵液体积（m3）内通入的标准状态下的空气体积（m3）﹞一般在，压强为，克服下游阻力。
空气质量要求相对湿度小于70%，温度比培养温度高10-30℃，洁净度100级，或失败率1/1000。
空气预处理与设备
（1）采风塔在工厂的上风头，高度一般在10m左右，设计流速8m/s。
可建在高压机房的屋顶上。
（2）粗过滤器安装在空压机吸入口前，前置过滤器。
作用是截留空气中较大的灰尘，保护压缩机，减轻总过滤器的负担，也能起到一定的除菌作用。
介质为泡沫塑料（平板式）或无纺布（折叠式），流速。
要求是阻力小，灰容量大。
（3）空气压缩机作用是提供空气流动的动力。
常用往复式、螺杆式、涡轮式空压机。
（4）空气储罐消除压缩空气的脉动，用于往复式空压机。
螺杆式和涡轮式空压机提供均匀连续空气可省去。
设置在空压站附近。
（5）冷却器空气压缩机出口气温一般在120℃，必须冷却。
在潮湿季节，除湿。
空气冷却器的传热系数为105W/（m2·℃）。
采用双程或四程结构，两级串联使用。
第一级循环水冷却，第二级低温水（9℃）冷却。
设置在发酵车间外。
压缩空气每经过1m管道，温度下降。
空气过滤灭菌的工艺流程
图7空气过滤灭菌的工艺流程
7.部分工艺计算
物料衡算根据质量守恒定律，以生产过程或生产单元设备为研究对象，对其进出口处进行定量计算，称为物料衡算。
通过物料衡算可以计算原料与产品间的定量转变关系，以及计算各种原料的消耗量，各种中间产品、副产品的产量、损耗量及组成。
物料衡算的基础：
物料衡算的基础是物质的质量守恒定律，即进入一个系统的全部物料量必等于离开系统的全部物料量，再加上过程中的损失量和在系统中的积累量。
∑G1=∑G2+∑G3+∑G4
∑G1：
——输人物料量总和；∑G2：
——输出物料量总和；∑G3：
——物料损失量总和；
∑G4：
——物料积累量总和。
当系统内物料积累量为零时，上式可以写成：
∑G1=∑G2+∑G3
物料衡算是所有工艺计算的基础，通过物料衡算可确定设备容积、台数、主要尺寸，同时可进行热量衡算、
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