菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RTPCR检测方法的建立.docx

菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RTPCR检测方法的建立.docx

《菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RTPCR检测方法的建立.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RTPCR检测方法的建立.docx（23页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

菠萝凋萎相关病毒实时荧光定量RTPCR检测方法的建立

园艺学报2014，41（6）：

1257–1266http:

//www.ahs.ac.cn

ActaHorticulturaeSinicaE-mail:

yuanyixuebao@

收稿日期：

2014–01–27；修回日期：

2014–03–27

基金项目：

公益性行业（农业）科研专项经费项目（201203021）；海南省重大科技项目（ZDZX2013020-3）；海南省科学事业费项目（琼

财预[2013]131号）；海南省重点科技计划应用研究及产业化项目（ZDXM20130031）

*通信作者Authorforcorrespondence（E-mail：

hefanhn@）

菠萝凋萎相关病毒–2实时荧光定量RT-PCR检

测方法的建立

胡加谊1,2，罗志文2，范鸿雁2，李向宏2，刘志昕3，何凡2,*

（1海南大学环境与植物保护学院，海口570228；2海南省农业科学院热带果树研究所，农业部海口热带果树科学观

测实验站，海口571100；3中国热带农业科学院热带生物技术研究所，海口571101）

摘要：

菠萝凋萎相关病毒（Pineapplemealybugwiltassociatedvirus-2，PMWaV-2）是引起的菠萝凋

萎病（Mealybugwiltofpineapple，MWP）的重要病原。

本研究中根据PMWaV-2外壳蛋白基因序列设计

特异性引物和探针，建立基于TaqMan探针的实时荧光定量RT-PCR检测方法。

该方法能高灵敏检测出阳

性样品，对阴性样品及空白对照均无荧光反应；灵敏度比普通PCR高100倍；重复性试验表明批内和批

间变异系数均在1.85%以内，表明本方法是一种操作简便、特异性强、灵敏度高、重复性较好的PMWaV-2

定量检测方法。

关键词：

菠萝；菠萝凋萎病毒–2（PMWaV-2）；TaqMan探针；实时荧光定量RT-PCR；检测

中图分类号：

S668.3；S432文献标志码：

A文章编号：

0513-353X（2014）06-1257-10

DevelopmentofaReal-timeFluorescentQuantitativeRT-PCRMethodfor

theDetectionofPineapplemealybugwiltassociatedvirus-2

HUJia-yi1,2，LUOZhi-wen2，FANHong-yan2，LIXiang-hong2，LIUZhi-xin3，andHEFan2,*

（1CollegeofEnvironmentandPlantProtection，HainanUniversity，Haikou570228，China；2InstituteofTropicalFruit

Trees，HainanAcademyofAgriculturalSciences/HaikouInvestigationStationofTropicalFruitTrees，Ministryof

Agriculture，Haikou571100，China；3InstituteofTropicalBioscienceandBiotechnology，ChineseAcademyofTropical

AgriculturalSciences，Haikou571101，China）

Abstract：

Pineapplemealybugwiltassociatedvirus-2（PMWaV-2）isanimportantpathogenthat

causesMealybugwiltofpineapple（MWP）.Thisstudyestablishedareal-timequantitativeRT-PCR

methodwithTaqManprobebasedonspecificprimersofconservednucleotidesequenceofPMWaV-2coat

proteingene.Theresultsshowedthatthemethodishighlysensitivetopositivesample，buthasno

fluorescencesignaltohealthsampleandwatercontrol.Thesensitivityofreal-timequantitativeRT-PCRis

about100timeshigherthanregularPCR.Three-timerepeatsrevealedthatthecoefficientsofvariation

betweentheintra-andinter-assaywerebothwithin1.85%，indicatingasimple，specificity，high

sensitivity，andreliablereproducibilitydetectionmethodtoPMWaV-2.

Keywords：

pineapple；PMWaV-2；TaqManprobe；real-timequantitativeRT-PCR；detction

1258园艺学报41卷

菠萝凋萎病（Mealybugwiltofpineapplewilt，MWP）是世界各菠萝主产区的重要病害之一，对

经济栽培造成严重影响（Carter，1934，1942，1945）。

菠萝凋萎病的发生被认为是菠萝凋萎病毒

（Pineapplemealybugwiltassociatedvirus）和粉蚧共同危害的结果，全世界已报道了5种菠萝凋萎

病毒，即PMWaV-1、PMWaV-2、PMWaV-3、PMWaV-4和PMWaV-5（Gambleyetal.，2008）和两

种传毒粉蚧，即菠萝洁白粉蚧（Dysmicoccusbrevipes）和新菠萝灰粉蚧（D.neobrevipes）。

目前，在

中国已见报道的菠萝凋萎病毒有PMWaV-1、PMWaV-2和PMWaV-3（吴丽亭等，2009，2010；李

运合等，2010）。

夏威夷大学的学者经研究首次提出PMWaV-2为菠萝凋萎病的重要病原之一（Sether

etal.，1998，Sether&Hu，2002）。

国内有学者报道，PMWaV-2和菠萝粉蚧共同作用是引起菠萝凋

萎病的最重要原因，其发病率可高达60%，可造成25%~30%的经济损失（龚标勋，2002）。

病毒

病的防治目前还没有疗效明显的药剂，对发病植株做到提前检测和及早诊断，及时作出病害防治措

施，对减少田间损失就显得尤为重要。

目前用于菠萝凋萎病毒的检测方法主要有免疫电镜检测

（Gunasinghe&German，1989）、酶联免疫吸附（Huetal.，1996）、组织免疫印记（Huetal.，1997）

和反转录—聚合酶链反应（Reversetranscription-polymersechainreaction，RT-PCR）（Walkmanetal.，

1995；Setheretal.，2001，2005）等技术，但这些方法都存在较大的限制因素，诸如免疫电镜成本

太高，血清学方法病毒粒子提纯困难，组织免疫印迹容易出现假阳性，RT-PCR的后期处理易交叉

污染等。

实时荧光定量PCR技术（Real-timefluorescentquantitativepolymerasechainreaction，FQPCR）

是1996年由美国AppliedBiosystems公司研发的一种在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信

号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

该方法具有可

定量、高特异性、高敏感性、高通量等优点，非常适合于植株体内病毒的定量检测（徐小刚和刘雅

婷，2009），目前国际上尚无应用重组质粒作为标准品构建标准曲线达到对PMWaV-2定量检测的报

道，国内也无关于PMWaV-2实时荧光定量RT-PCR检测的报道。

鉴于菠萝凋萎病对中国菠萝产业

造成较大的损失，急需建立一种高灵敏度的检测方法。

2013—2014年作者根据PMWaV-2外壳蛋白

（coatprotein，CP）基因的保守序列设计引物和TaqMan探针，通过制备重组质粒标准品构建标准

曲线，建立起一套基于TaqMan探针PMWaV-2的实时荧光定量RT-PCR检测体系。

1材料与方法

1.1材料

本试验于2013—2014年在海南省海口市中国热带农业科学院热带生物技术研究所进行。

菠萝

植株样品及PMWaV-2阳性样品均为海南省农业科学院热带果树研究所提供。

RNA提取试剂盒为

Bioteke公司的多糖多酚植物总RNA提取试剂盒；反转录酶为TransGen公司的Transscriptfiret-strand

cDNAsynthesissupermix；Trans5αCell购自TransGen公司；pMD18-T载体、TaqDNA聚合酶、DNA

MarkerDL2000、RealMasterMix（Prob）均购自TaKaRa公司；琼脂糖凝胶回收试剂盒与质粒提取

试剂盒均购自AXYGEN公司；TaKaRaTP600PCR仪；Stratagene公司的MX3005荧光PCR仪；美

国Thermo公司NanoDropND-2000C微量紫外分光光度计。

1.2引物和探针的设计合成

根据NCBI报道的PMWaV-2外壳蛋白基因（HE983618、EU769116、JN995534、JX645775、

JN995535、JN995533、DQ225114）的保守序列设计特异性TaqMan探针和引物（表1），探针5′标

记荧光基团FAM，3′标记淬灭基团TAMRA，预计扩增片段大小168bp。

6期胡加谊等：

菠萝凋萎相关病毒–2实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立1259

表1PMWaV-2实时荧光定量RT-PCR引物和探针

Table1Theprimersandprobedesignedforreal-timefluorescentquantitativeRT-PCRofPMWaV-2

引物名称

Primer

引物探针序列（5′→3′）

Sequence

退火温度/℃

Annealingtemperature

PMWaV-2-FCGTGAGTGAGGTGGTTGAG59

PMWaV-2-RGCAAAGAACTGCTTGGGT55

ProbeFAM-TGGCTCATCACGGAGTACCCAAGC-TAMRA66

1.3菠萝总RNA提取和RT-PCR

称取0.1g的菠萝叶片基部白色组织，用Bioteke公司的多糖多酚植物总RNA快速提取试剂盒

（离心柱型）提取菠萝叶片总RNA，取5µLRNA于1.5%琼脂糖凝胶电泳检测；用ND-2000C紫外

分光光度计测定其浓度，并将叶片总RNA置–80℃冰箱中备用。

以提取的菠萝叶片总RNA为模板，按康为世纪有限公司TransScriptⅡReverseTranscriptase

说明书反转录合成第一链cDNA。

20µL反转录体系为PrimerMix2µL、2.5mmol·L-1dNTPMix4

µL、RNase-freeH2O3.5µL、5×RTBuffer4µL、RibonucleaseInhibitor0.5µL、SuperRT1µL和RNA

模板5µL。

混合溶液于42℃水浴1h，85℃孵育5min结束反应。

以反转录合成的cDNA为模板进行PCR扩增，20µL扩增体系包括Taq（5U·µL-1）0.2µL，

10×PCRbuffer（含Mg2+）2µL，dNTPMixture（2.5mmol·L-1）1µL，PMWaV-2-F（10µmol·µL-1）

0.5µL，PMWaV-2-R（10µmol·µL-1）0.5µL，cDNA1µL和ddH2O14.8µL。

PCR反应条件为：

94℃

预变性3min；94℃30s，55℃30s，72℃20s，循环35次；72℃10min，4℃停止。

PCR产物

用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，拍照并比对序列。

1.4质粒标准品的制备

以总RNA反转录合成的第一链cDNA为模板，以特异性引物PMWaV-2-F/PMWaV-2-R扩增获

得其特异性目的片段，将获得的目的片段克隆到pMD18-T载体上，转化大肠杆菌感受态，挑取阳

性克隆于LB液体培养基中，37℃200r·min-1振荡培养6h以上。

提取质粒，经菌液PCR、测序确

定目标序列。

核酸蛋白测定仪测定阳性质粒的浓度，并按照公式C=A/B×6.02×1014（其中C为

copies·µL-1，A为以OD260分析得到的浓度ng·µL-1，B为质粒DNA分子量）计算质粒浓度拷贝数，

–20℃保存作为标准品备用。

1.5探针适用性验证

以菠萝凋萎病显症叶片总RNA反转录合成的第一链cDNA为模板，质粒DNA为阳性模板，健

康菠萝叶片总RNA反转录合成的cDNA为阴性对照，水为空白对照进行实时荧光定量PCR反应，

即25µL反应体系包括PremixExTaq（probeqPCR）（2×）12.5µL，PMWaV-2-F（10µmol·L-1）0.5

µL，PMWaV-2-R（10µmol·L-1）0.5µL，ROXreferenceDye（50×）0.5µL，Probe（10µmol·L-1）

1µL，模板1µL，ddH2O9µL。

反应程序为：

95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，

72℃延伸20s，40个循环。

1.6标准曲线的建立

以10倍梯度稀释的质粒标准品为模板，取终浓度为6.16×108~6.16×103copies·µL-1的6个质

粒样品，按1.5中的实时荧光定量反应体系在Mx3005荧光定量PCR仪上检测，得出各自的荧光扩

增曲线，仪器软件自动生成标准曲线。

1260园艺学报41卷

图1RT-PCR检测PMWaV-2

M：

MarkerDL2000；1：

CP基因片段扩增；

2：

CP基因片段重复扩增；CK-：

阴性对照。

Fig.1DetectionofPMWaV-2byRT-PCR

M：

MarkerDL2000；1：

FragmentofCPgeneamplification；

2：

FragmentofCPgenerepeatamplification；

CK-：

Negativecontrol.

1.7特异性试验

以含PMWaV-2CP基因目的片段的重组质粒为阳性模板，分别对含有PMWaV-1和PMWaV-3

等病毒的cDNA模板进行实时荧光定量RT-PCR扩增，同时设置阴性对照。

1.8灵敏度试验

将质粒标准品按10倍梯度稀释，取终浓度为6.16~6.16×109copies·µL-1等10个浓度的质粒

标准品作为模板，按1.5中的实时荧光定量反应体系在Mx3005荧光定量PCR仪上检测，得出荧光

定量PCR所能检出的最低模板拷贝数。

同时按照1.3中PCR反应体系进行普通PCR的灵敏度测试

实验，与所建立的荧光定量PCR的灵敏度进行比较。

1.9重复性试验

将质粒标准品按10倍梯度稀释，取6.16×102~6.16×106copies·µL-1等5个稀释浓度的样品为

模板进行实时荧光定量PCR反应。

将以上不同浓度的质粒DNA模板每天进行1次实时荧光定量PCR

反应，连续3d即3次重复，考察不同试验的批次差异性。

根据获得的Ct值计算平均Ct值、标准

差和变异系数。

1.10田间样品检测

应用已建立的方法对采自田间的11份菠萝样品进行实时荧光定量RT-PCR检测。

2结果与分析

2.1菠萝叶片总RNA提取与RT-PCR检测结

果

健康和染病菠萝叶片中提取的总RNA经

1.5%琼脂糖凝胶电泳检测，18S和28SRNA条

带清晰可见，无弥散，经紫外分光光度计测定，

其OD260/OD280比值为2.05，符合下一步试验

要求。

以反转录生成的第一链cDNA为模板扩增

PMWaV-2CP基因目的片段，所设计的引物在

常规PCR体系和程序下能够清晰、敏捷地扩增

出与预测片段大小一致的片段（图1），经测序

分析及Blast比对，确定所获得的序列为

PMWaV-2CP基因目的片段。

2.2探针适用性检测

以含有PMWaV-2目的片段的重组质粒为阳性模板，经实时荧光定量RT-PCR检测，可观察到

明显荧光信号强度的增长，而健康（阴性）对照和空白对照荧光吸收值均没有变化（图2），表明所

设计的引物和探针适用于PMWaV-2的实时荧光定量RT-PCR检测。

6期胡加谊等：

菠萝凋萎相关病毒–2实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立1261

图2实时荧光定量RT-PCR探针适用性试验

Fig.2Probeapplicabilityofreal-timefluorescentquantitativeRT-PCRforPMWaV-2

2.3标准曲线的建立

以10倍梯度稀释的阳性质粒为标准模板进行PMWaV-2实时荧光定量RT-PCR反应。

其扩增曲

线随着阳性质粒模板浓度的稀释倍数增大，Ct值呈现递增趋势如图3所示，在6.16×108~6.16×103

copies·µL-1浓度范围内，标准品浓度与Ct值之间具有良好的线性关系，曲线斜率为–3.267，决定

系数R2=0.997，直线方程为Y=–3.267log（X）+43.33，扩增效率为102.3%，由此建立的标准曲

线可以用于PMWaV-2的检测。

图3PMWaV-2实时荧光定量RT-PCR标准品动力曲线图

Fig.3Strandcurveofreal-timefluorescentquantitativeRT-PCRforPMWaV-2

2.4实时荧光定量RT-PCR检测的特异性

用本试验所建立实时荧光定量RT-PCR检测体系，分别以PMWaV-2CP片段的重组质粒和含

PMWaV-1、PMWaV-3等病毒的cDNA样品为模板进行实时荧光定量RT-PCR扩增。

结果如图4，除

了含PMWaV-2目的片段的阳性质粒出现良好的特异性扩增曲线，PMWaV-1、PMWaV-3和阴性对照

检测结果均无荧光吸收值的变化，表明本试验所建立的实时荧光定量RT-PCR检测方法能够特异性

地检测PMWaV-2。

2.5实时荧光定量RT-PCR检测的灵敏度

普通RT-PCR的最低检出限测为6.16×103copies·µL-1（图5），实时荧光定量RT-PCR最低检

出为61.6copies·µL-1（图6），表明实时荧光定量RT-PCR检测灵敏度为普通RT-PCR的100倍。

1262园艺学报41卷

图4PMWaV-2实时荧光定量RT-PCR特异性试验结果

Fig.4ThespecificityofRT-qPCRforPMWaV-2

图5PMWaV-2普通RT-PCR检测灵敏度

Fig.5GeneralRT-PCRforPMWaV-2

M：

Marker2000；1：

6.16×1010copies·µL-1；2：

6.16×109copies·µL-1；3：

6.16×108copies·µL-1；4：

6.16×107copies·µL-1；

5：

6.16×106copies·µL-1；6：

6.16×105copies·µL-1；7：

6.16×104copies·µL-1；8：

6.16×103copies·µL-1；

9：

6.16×102copies·µL-1；10：

6.16×101copies·µL-1；CK-：

Negativecontrol.

2.6重复性

通过对6.16×102~6.16×106copies·µL-1稀释梯度的质粒DNA实时荧光定量RT-PCR的扩增曲

线（图7）和进行统计学分析（表2），发现同一批次试验各梯度的变异系数均小于1.25%，表明该

方法具有较好组内的重复性。

而批次间重复性试验结果表明，各梯度批间差异系数均小于1.85%，

表明该方法的批间重复性较好，可以用于菠萝叶片PMWaV-2的定量检测。

表2重复性试验统计结果

Table2Intral-assayandinter-assayreproducibilityofreal-timefluorescentquantitativeRT-PCRforPMWaV-2

组内重复Reproducibilityofintral-assay组间重复Reproducibilityofinter-assay质粒拷贝数/（copies·µL-1）

PlasmidconcentrationCtSDCV/%CtSDCV/%

6.16×10620.460.0930.4520.590.0940.46

6.16×10524.170.2971.2324.380.4461.83

6.16×10427.110.1830.6827.340.3611.32

6.16×10331.090.1480.4831.260.3211.03

6.16×10233.630.2790.8333.450.4941.48

6期胡加谊等：

菠萝凋萎相关病毒–2实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立1263

图6PMWaV-2单重实时荧光定量RT-PCR的灵敏度

Fig.6ThesensibilityofsingleRT-qPCRforPMWaV-2

图7实时荧光定量RT-PCR扩增曲线重复性

Fig.7Thereproducibilitytestofreal-timefluorescentquantitativeRT-PC