制药工艺实验讲义改革1.docx
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制药工艺实验讲义改革1
生物制药工艺实验讲义
范一文吴晓英
目录
实验一庆大霉素的液体发酵………………………1
实验二离子交换法分离提取庆大霉素………………………4
实验一庆大霉素的液体发酵
一、实验目的：
学习利用液体发酵法制备庆大霉素的原理和操作方法。
二、实验原理：
庆大霉素是由放线菌属小单孢菌发酵产生的氨基糖苷类广谱抗生素，对多种革兰氏阴性菌（如大肠杆菌、沙门氏菌等）和金黄色葡萄球菌（包括β-内酰胺酶菌株）具有抗菌作用，在临床上具有广泛的应用。
本实验以紫色小单孢菌作为生产菌株，通过斜面孢子培养、种子液培养、发酵液培养，在优化的发酵条件下发酵生产庆大霉素。
该实验中，庆大霉素的含量测定采用的是磷钨酸钠紫外分光光度法。
磷钨酸钠溶液在紫外光谱的范围内有明显的吸收峰，而且其溶液的浓度在一定的范围内与其吸光度呈线性关系。
当把庆大霉素与已知过量的磷钨酸钠混合后，庆大霉素与磷钨酸钠发生反应生成白色沉淀，滤去沉淀测定其滤液的吸光度，可得未反应的磷钨酸钠量，从而确定庆大霉素的含量，建立标准曲线。
测定发酵液与磷钨酸钠反应后的滤液吸光度，则可从标准曲线上确定发酵液庆大霉素的含量。
三、实验材料与仪器
1.菌种：
紫色小单孢菌、短小芽孢杆菌
2.培养基：
（1）斜面培养基：
高氏合成一号琼脂培养基。
（2）种子培养基（g/100ml）：
可溶性淀粉1.5，葡萄糖0.5，蛋白胨0.5，酵母粉0.5，（NH4）2SO40.05，K2HPO4.3H2O0.05，NaCl0.05，MgSO4.7H2O0.05，CaCO30.1，pH7.5，121℃灭菌20min备用。
（3）发酵培养基（g/100ml）：
可溶性淀粉5.5，葡萄糖0.5，黄豆饼粉3.5，玉米粉0.5，蛋白胨0.3，KNO30.05，（NH4）2SO40.05，CaCO30.5，CoCl20.0006，甘氨酸0.01，蛋氨酸0.02，赖氨酸0.015，酪氨酸0.01,pH7.2，121℃灭菌20min备用。
3.试剂：
（1）庆大霉素标准品（中国药品生物制品检定所，纯度为638u/mg）,配置成庆大霉素标准溶液1000u/ml。
;
（2）磷钨酸钠（分析纯），配制成1×10-2g/ml水溶液；
4.主要器材：
（1）超净台
（2）培养箱
（3）摇床
（4）酸度计
（5）紫外分光光度计
（6）分析天平
（7）磁力搅拌器
（8）三角瓶、容量瓶、烧杯、移液枪等
四、实验方法
（一）实验基本流程
紫色小单孢菌斜面孢子培养种子液培养发酵液培养发酵液预处理，庆大霉素含量测定
（二）实验操作
1.孢子制备
将紫色小单孢菌转接到无菌的斜面培养基上，34℃恒温培养7天。
当孢子长成黑紫色时，可用于接种种子摇瓶。
2.种子液制备
250ml摇瓶中放入种子培养基50ml，121℃灭菌20min。
冷却后，无菌条件下接入1cm2斜面孢子，240rpm,34℃摇床培养60h获得种子液。
3.液体发酵
500ml摇瓶中放入50ml发酵培养基，121℃灭菌20min。
冷却后，无菌条件下每瓶加入12ml种子液，240rpm,34℃摇床培养6天获得发酵液。
4.发酵液预处理
用20%的H2SO4调节发酵液pH到1.5-2.0，在磁力搅拌下酸化30min，加0.1mol的NaOH中和至6.4-6.8.，然后5000r/min高速离心机离心12min，取上清液备用。
5.建立标准曲线
将浓度为1000U/mL的庆大霉素标准样品溶液，按顺序由0.1-2.0mL加入到100mL容量瓶中，分别加入1.5mL的磷钨酸钠溶液，稀释至100mL，静置0.5h后过滤（用滤膜过滤器过滤），在245nm波长处测定其滤液吸光度值A。
以标准品庆大霉素含量为横坐标，吸光度A值为纵坐标，做标准曲线。
图1.庆大霉素标准曲线
6.紫外分光光度法测定发酵液庆大霉素含量
取等体积的发酵处理液两份（各1.5ml）,其中一份加入磷钨酸钠溶液1.5ml,静置0.5h,稀释至100ml,滤去沉淀,另一份直接稀释至100ml作为参比液,在245nm波长处测定滤液的吸光度，从标准曲线查出庆大霉素浓度。
乘稀释比100/1.5，得原待测液的庆大霉素含量。
五、实验结果
当庆大霉素效价在0-20U/mL范围内，庆大霉素效价与吸光度有较好的线性关系。
对数据进行线性回归，得到标准曲线方程：
A=1.705-0.051C，式中，C为庆大霉素的效价U/mL，相关系数r=-0.9970。
根据方程测定发酵液中庆大霉素含量。
五、注意事项
留取部分经过预处理的发酵上清液，留作下次实验中检测抑菌效果使用。
留取20ml经过预处理的发酵上清液，留作下次实验中离子交换使用。
六、思考题
1.庆大霉素发酵液预处理的目的是什么？
2.紫外分光光度法测定庆大霉素含量的原理是什么？
3.庆大霉素的液体发酵过程中应该控制那些环节？
实验二离子交换法分离提取庆大霉素
一、实验目的
学习利用离子交换法从发酵液中分离提取庆大霉素的原理和操作方法。
二、实验原理
庆大霉素是一种弱碱性、水溶性抗生素，为多组份的复合物,其主要组份是C1、C2、C1a、C2a。
它在中性环境中，以三价阳离子的形式存在，在酸性环境中以五价阳离子形式存在，性质较稳定，亲和力比较强。
732型树脂是阳离子交换树脂，是在苯乙烯一二乙烯苯共聚基体上带有磺酸基-SO3H的离子交换树脂，它具有交换容量大，交换速度快，机械强度好等特点。
732型树脂的活性基团磺酸基-SO3H容易在溶液中离解出H+，树脂离解后，本体所含的负电基团SO3-，能吸附结合溶液中的其他阳离子。
离子交换树脂对溶液中的不同离子有不同的亲和力，对它们的吸附有选择性。
对于阳离子的吸附，高价阳离子通常被优先吸附，而低价离子的吸附较弱。
由于庆大霉素在酸性环境中是高价阳离子，能优先与活性基团进行吸附，再利用高浓度的氨水将庆大霉素洗脱下来，就达到分离纯化的目的。
本实验选用732型阳离子交换树脂吸附，初步分离后，再用711型阴离子交换树脂脱色，最后对产品进行浓缩。
三、仪器、材料与试剂
（一）仪器
1、空气浴恒温振荡器
2、旋转蒸发仪
3、高压灭菌锅
（二）材料
1、732型树脂、711型树脂若干
2、离子交换柱一根（20×1cm）
3、恒流泵一台
4、支架和夹子
5、100mL锥形瓶2个、250mL锥形瓶1个、漏斗一个
（三）试剂
1、1M盐酸溶液：
量取21mL浓盐酸，稀释至250mL。
2、0.1M盐酸溶液：
量取2.1mL浓盐酸，稀释至250mL。
3、1MNaOH溶液：
称取10g氢氧化纳，加入少量纯水溶解后，稀释至250mL。
4、1M的NH4Cl溶液：
取53.5gNH4Cl，加入少量纯水溶解后，稀释至1L。
5、5%氨水：
量取50mL25%的氨水，稀释至250mL，遮光保存。
6、0.1%稀氨水：
量取2mL25%的氨水，稀释至500mL。
遮光保存。
7、硝酸银试剂、酚酞试剂、pH试纸
8、20%硫酸溶液：
量取31.61mL98%浓硫酸，稀释至250mL。
9、庆大霉素标准品（中国药品生物制品检定所，纯度为638u/mg）,配置成庆大霉素标准溶液1000u/ml。
（四）培养基：
（1）培养基I：
取胨5g、牛肉浸出粉3g、磷酸氢二钾3g和蒸馏水1000ml，加热融化，混合，调节pH使其值比最终的pH值略高0.2-0.4，加入琼脂20g，加热溶化过后，调节pH值使灭菌后为7.8-8.0，在115℃灭菌30分钟。
（2）营养琼脂培养基：
取胨10g、氯化钠5g和肉浸液1000ml，混合，调节pH使比最终的pH值略高0.2-0.4，加入琼脂15-20g，加热溶化过后，调节pH值使灭菌后为7.2-7.4，分装，在115℃灭菌30分钟，趁热斜放使凝固成斜面。
树脂类型：
离子交换用苯乙烯型强酸性阳离子交换树脂，编号为732#，其性能如下：
出厂
型式
粒度
mm
最高耐热
（°C）
pH范围
含水量（%）
理论交换容量（mmoL/单位树脂）
钠型
0.315~1.5
93
0~14
45~56
1.8（mL）/4.4（g）
脱色用苯乙烯型强碱性阴离子交换树脂，编号为711#，其性能如下：
出厂
型式
粒度
mm
最高耐热
（°C）
pH范围
含水量（%）
理论交换容量（mmoL/g干树脂）
氯型
0.315~1.5
60
0~14
50~60
3.72
四、实验步骤
（一）树脂的预处理：
732型树脂：
先用70-80℃热水浸泡2小时，然后用水洗至澄清为止。
取20mL树脂，置于预处理装置中。
开始浸洗时，用1MNaOH浸泡2h，然后水洗至中性，再用1MHCL浸泡2h，再水洗至中性。
最后用400mL1MNH4Cl溶液转换成NH4+型，流速为10mL/min。
然后用蒸馏水洗涤至中性。
711型树脂：
先用40℃温水浸泡2小时，然后用水洗至澄清为止。
取20mL树脂，置于预处理装置中。
开始浸洗时，用1MHCL浸泡2h，然后水洗至中性，再用1MNaOH浸泡2h，再水洗至中性。
最后用400mL1MNH4Cl溶液转换成CL--型，流速为10mL/min。
然后用蒸馏水洗涤至中性。
（二）离子交换
图1.预处理装置
图2.离子交换流程
图2.离子交换流程
（A）发酵液预处理：
用20%的H2SO4调节发酵液pH到1.5-2.0，在磁力搅拌下酸化30min，加1moL的NaOH中和至6.4-6.8.，然后5000r/min高速离心机离心12min，取上清液备用。
（B）732#静态吸附：
1、取20mL发酵上清液于100mL锥形瓶中，调节pH2-3，投入20mL已处理的732树脂，振荡吸附2h。
2、取吸附残液，进行含量测定。
小心把滤液倾出，反复用纯水漂洗树脂。
（C）饱和树脂装柱、洗涤：
1、饱和树脂洗涤干净后，装入离子交换柱内，用蒸馏水正向洗涤至洗出水清澈，备用。
2、稀酸洗将0.1M盐酸从饱和树脂上部流入，以2mL/min（50rpm）的流速进行稀酸洗涤。
酸液用量为饱和树脂体积的7倍。
3、水洗采用正、反方向冲洗，用AgNO3试剂检查有无氯离子。
4、稀氨水洗涤从上部加入0.1M稀氨水，流速与酸洗速度相同。
洗涤量为树脂体积的5~10倍。
当流出液呈碱性，即停止。
（可在废液瓶中加几滴酚酞，当变红则显示碱性）
5、水洗采用正、反方向冲洗树脂至中性。
（D）732树脂解吸及711树脂串联脱色：
1、准备711树脂脱色柱将处理后的711树脂装入交换柱，以蒸馏水洗涤，检验有无氯离子，备用。
2、732树脂解吸及串联脱色经处理后的732饱和树脂，从上部通入5%的氨水，以0.4mL/min（10rpm）的流速进行解吸，至呈碱性时，即串联入711柱内进行脱色。
严密注意711柱流出液中庆大霉素的出现，当有样品时，（接洗脱液的三角瓶内滴入酚酞，当洗脱液变红时）即开始收集。
收集脱色液体积为饱和树脂体积的6倍量。
（E）脱色液浓缩：
脱色液采用旋转蒸发仪进行浓缩、除氨。
（F）紫外分光光度法测定庆大霉素含量。
（方法同实验一）
（G）配制双层培养基，以标准品为对照，分别检查发酵液、提取液的抑菌效果。
1.短小芽孢杆菌菌悬液的制备和保存：
取短小芽孢杆菌试验用菌种斜面1支，按无菌操作要求加入灭菌水2ml，将菌苔洗下，摇匀，取出1ml接种于盛有30ml营养琼脂培养基的100ml三角瓶中，在35-37℃培养7日，用革兰氏染色法涂片镜检，应有芽孢85%以上，用灭菌水20ml将芽孢洗下，制成悬液，在65℃水浴中加热30分钟，即得，置5℃冰箱中保存，可使用6个月。
2.双碟的制备：
取直径约90mm、高16-17mm的平底双碟，分别注入加热融化的培养基I20ml,使在碟底内均匀摊布，放置水平台上使凝固，作为底层。
另取培养基适量加热融化后，放冷至50-60℃，加入菌悬液适量（能得清晰的抑菌圈为度）,摇匀，在每1双碟中分别加入5ml，使在底层上均匀摊布，作为菌层。
放置水平台上冷却后，在每1双碟中均匀安置牛津杯（内径6.0±0.1mm，高10.0±0.1mm，外径7.8±0.1mm）3个，用陶瓦圆盖覆盖备用。
3.抑菌效果检查：
无菌条件下，分别将经过预处理的发酵液、分离纯化的提取液以及同等单位的庆大霉素标准溶液加入牛津杯内，34℃培养16小时后观查结果，比较抑菌效果。
图2.抑菌效果对比
a：
标准液；b：
发酵液；c：
纯化液
（三）树脂再生
732型树脂：
1、用蒸馏水洗涤树脂，直至pH值为中性为止。
2、洗净树脂后，然后通入1M盐酸溶液，对树脂进行再生。
检测洗出液为酸性为止。
3、流速控制在2mL/min，树脂再生完毕，然后用蒸馏洗至中性即可（pH试纸检验）。
再生后，732型离子交换树脂为氢型。
711#树脂：
1、用蒸馏水洗涤树脂，直至pH值为中性为止。
2、洗净树脂后，然后通入1MNaOH溶液，对树脂进行再生。
检测洗出液
为碱性为止。
3、流速控制在2mL/min，树脂再生完毕，然后用蒸馏水洗至中性即可（pH
试纸检验）。
再生后，711型离子交换树脂为氢氧型。
五、实验结果
1、提纯液中庆大霉素含量测定结果
2、抑菌检查结果（图、说明）
六、注意事项
保留预处理之后的发酵上清液、离子交换后的提取液各一份，以备抑菌实验用。
七、思考题
1.离子交换法提取发酵液中庆大霉素的原理是什么？
2.影响庆大霉素提取的因素有哪些？
实验安排
第一次实验（半天）:
学生完成庆大霉素发酵培养基的制备、灭菌、种子液转接、摇瓶发酵培养等实验步骤。
第二次实验（半天）:
学生完成发酵液预处理、紫外分光光度法测定发酵液效价、离子交换树脂预处理等实验步骤。
第三次实验（全天）：
学生完成庆大霉素发酵液的分离提取、提取液浓缩、紫外分光光度法测定浓缩液液效价、配制双层平板、检查抑菌效果（24h后观察记录结果）。
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