臭豆腐发酵菌种的筛选与鉴定.docx

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臭豆腐发酵菌种的筛选与鉴定

2462007,Vol.28,No.06食品科学※生物工程

臭豆腐发酵菌种的筛选与鉴定

卢义伯，潘超*，祝义亮

（南京雨润集团技术中心，江苏南京210041）

摘要：

采用定性培养和定量培养的方法，从臭豆腐发酵乳液中分离筛选出优势菌种，并采用菌种鉴别试纸条进

行鉴定。

分析表明，荧光假单孢菌是臭豆腐发酵过程中的优势菌种，霉菌在臭豆腐发酵乳液中数量远小于细菌，

实验结果为臭豆腐的工业化生产提供了理论依据。

关键词：

臭豆腐；菌群筛选；鉴定

BacteriumScreeningandIdentifyingfromStinkyTofu

LUYi-bo，PANChao*，ZHUYi-liang

（TechnicalCenterofNanjingYurunGroup,Nanjing210041,China）

Abstract：

Dominantbacteriumisseparatedfromstinkytofuqualitativelyandquantitatively,identifiedwithindicatorpaper.

Itwasconcludedthatpseudomonas（PS.fluo./putida）isthedominantbacteriumbutamountofmouldisrelativelysmall.Thisassay

affordsthetheoreticalbasicsforindustrialproductionofstinkytofu.

Keywords：

stinkytofu；bacteriumscreening；identification

中图分类号：

Q93-331文献标识码：

A文章编号：

1002-6630（2007）06-0246-04

臭豆腐是南京秦淮特色风味小吃，同时也是中国人臭豆腐发酵乳液取自农家制作的臭豆腐发酵乳

民的传统美食，受到广大青少年的青睐。

臭豆腐是中液；马铃薯葡萄糖培养基、营养琼脂培养基、假单孢

国传统发酵制品的一种[1]，具有悠久的历史，从魏代到分离琼脂北京陆桥技术有限责任公司。

明清时代均有大量史料记载[2]。

臭豆腐发酵过程中蛋白API菌种鉴别试纸条法国生物梅里埃公司；恒温

质分解成氨基酸，形成臭豆腐特有的香味，同时提高培养箱北京亚泰伟业实验器材有限公司；相差显微镜

了大豆蛋白的消化率，研究还发现发酵豆制品具有降血北京天华生物科技发展有限公司。

压的生理活性[3]。

1.2臭豆腐发酵乳液菌种定性筛选实验

我国目前臭豆腐的制作主要采用“敞口发酵”的采用划线培养的方法，将传统工艺制作臭豆腐时的

方式，即利用自然界存在的菌种进行发酵，然而这种浸泡乳液（原液）接种在营养琼脂培养基上，30℃条件下

方式使得质量不易控制[4]，况且这种制作臭豆腐乳的方培养48h。

根据菌落的生长特征，挑选形态、颜色占

式发酵周期长，易受到杂菌的污染，微生物的大量繁绝大多数的菌落两株进一步在营养琼脂培养基上进行划

殖是臭豆腐在常温下两天便会败坏的主要原因[5]。

因线培养，培养时间和温度同第一次。

第二次培养后，

此，筛选合适的菌种，在无菌的条件采用细菌直接进用相同的方法挑选菌落两株进行第三次划线培养。

行发酵，既可做到卫生安全，又可缩短发酵周期，满经过三次培养后，菌种做到了分离纯化。

将分离

足工业化生产的要求。

得到的纯菌种进行革兰氏染色，观察该菌种的组织状态

我国目前臭豆腐尚未形成规模性的工业化生产。

本并确定其阴（阳）性，为API菌种鉴别试纸条的选择提供

研究目的在于，从应用研究的角度出发，分离出臭豆依据。

将分离纯化的菌种接入到API菌种鉴别试纸条的

腐发酵乳液中的优势菌种并进行鉴定，为臭豆腐的工业20个小试管中，0℃条件下保存18h，取出观察。

对照

化生产提供理论依据。

编码字典，确定该菌种。

同样采用划线培养的方法，将臭豆腐浸泡乳液（原

材料与方法

液）接种在马铃薯葡萄糖培养基上，25℃条件下培养

1.1材料与仪器5d，以观察霉菌的生长状况。

收稿日期：

2007-01-24*通讯作者

作者简介：

卢义伯（1968-），男，工程师，研究方向为胶体化学及蛋白质工程。

※生物工程食品科学2007,Vol.28,No.06247

1.3臭豆腐菌种定量培养实验

取不同来源的臭豆腐发酵乳液两份，分别定量

测定细菌总数、假单孢菌数量以及霉菌数量，与定

性培养结果相比较，检验定性培养结果的准确性。

三种微生物培养过程中，原液均稀释至10－3、10－4、

10－5、10－6倍，吸取1ml接种至相应的培养基上进行

培养。

细菌总数的测定：

营养琼脂培养基，培养温度25～

30℃，培养时间48h；假单孢菌：

假单孢分离琼脂，

培养温度25～30℃，培养时间48h；霉菌：

马铃薯葡

萄糖培养基，培养温度25～30℃，培养时间5d。

2结果与分析

2.1菌种定性培养检测结果

2.1.1菌种的分离筛选

a

b

c

图1菌种分步培养结果

Fig.1Resultsofbacteriumcultivationstep-by-step

图1中，左边开始分别表示第一次培养、第二次

培养和第三次培养的结果。

由图1a可以看出，臭豆腐

乳第一次划线培养后，所生长的菌落大部分为圆形、白

色，说明该乳液中的优势菌种比较单一。

在后续的两

次划线培养中，均选取该颜色和形状的菌落进行培养操

作。

由图1c可以看出，菌种经过三次接种培养，做到

了菌种的纯化，排除了杂菌的干扰，为下一步革兰氏

染色观察细菌形态和菌种鉴别提供了纯菌保证。

霉菌经过5d的培养，在PDA培养基上没有生长，原

因可能是数量少或者臭豆腐发酵乳液中确实无霉菌生长。

2.1.2细菌的革兰氏染色

分离纯化出来的细菌经革兰氏染色后，用相差显微

镜进行观察。

可以看出，该菌为杆菌属，呈黄色（图2），

故确定为革兰氏阴性菌，此结果是选择菌种鉴别试纸条

的依据。

图2革兰氏染色结果

Fig.2ResultsofGramstain

2.1.3细菌的鉴别

鉴别采用API菌种鉴别试纸条，如图3所示，该

试纸条集20个生化反应于一体，分为7组，每组根据

反应的特征对应一个数字，7个数字组成一组编码，每

个编码对应一个菌种。

图3菌种鉴别结果

Fig.3Resultsofbacteriumidentification

经过0℃/18h的培养，依据各个试管中的颜色反应

（表1），确定该菌种的编号为2001004，对照编码字典，

确定对应的菌种为PS.fluo./putida，中文名称荧光假单

孢菌。

2.2菌种定量培养检测结果

定性培养中未检测出霉菌，但根据相关报道[6-7]，

霉菌在臭豆腐发酵过程中可能起一定的作用，为进一步

论证定性分析的结果，对细菌总数、假单孢菌和霉菌

分别做定量培养，结果如表2所示。

由表1可以看出，1#样和2#样的测定结果（假单孢

菌/细菌总数、霉菌/细菌总数）相近，说明实验误差控

制在最小的范围之内。

2#样的原料风味淡于1#样，由

2482007,Vol.28,No.06食品科学※生物工程

表1菌种鉴别反应结果

Table1Resultsofbacteriumidentification

试管编号试剂反应酶18h后反应颜色结果判定

ONPG邻硝基苯-半乳糖苷β-半乳糖苷酶无色阴性

ADH精氨酸精氨酸双水解酶红色阳性

LDC赖氨酸赖氨酸脱羧酶黄色阴性

ODC鸟氨酸鸟氨酶脱羧酶黄色阴性

CIT柠檬酸钠柠檬酸利用黄色阴性

H2S硫代硫酸钠H2S产生无色阴性

URE脲素脲酶黄色阴性

TDA色氨酸色氨酸脱氨酸黄色阴性

IND色氨酸吲哚产生无色阴性

VP丙酮酸盐3-羟基丁酮产生乙酰甲基甲醇粉红色阳性

GELKohn明胶明胶酶黑色素不扩散阴性

GLU葡萄糖发酵/氧化绿色阴性

MAN甘露醇发酵/氧化绿色阴性

INO肌醇发酵/氧化绿色阴性

SOR山梨醇发酵/氧化绿色阴性

RHA鼠李糖发酵/氧化绿色阴性

SAC蔗糖发酵/氧化蓝色阴性

MEL密二糖发酵/氧化绿色阴性

AMY苦杏仁苷发酵/氧化蓝色阴性

ARA阿拉伯糖发酵/氧化绿色阴性

表2菌种定量培养检测结果

Table2Resultsofbacteriumquantitativecultivation

指标

样品

细菌总数（CFU/ml）假单孢菌（CFU/ml）霉菌（CFU/ml）假单孢菌/细菌总数（%）霉菌/细菌总数（%）

1#样3×1072×1074.5×10466.670.15

2#样1.73×1071.16×1073.3×10467.050.19

检验结果可知，1#样的微生物数量多于2#样，说明微

生物在臭豆腐发酵过程中起到了重要作用。

在细菌总数

中，假单孢菌的数量占到了2/3以上，推断假单孢菌是

臭豆腐发酵过程中的主要菌种，而霉菌数量小于细菌总

数三个数量级，细菌在发酵过程中的作用大于霉菌，此

数据再次验证了定性培养的结果。

3讨论

微生物包括细菌、霉菌和病毒，其中细菌是主要

的一类，真菌包括霉菌和酵母菌，而病毒则基本不存

在于食品中。

对臭豆腐乳中优势菌种的筛选鉴定研究较

少。

郭华等通过研究分离出奈瑟氏菌属和环状芽孢杆菌

属[8]。

台湾的研究者从臭乳中分离出了两种菌，分别为

A2和S3，并且制作了适合这两种菌生长的混合液，该

混合液可以用于臭豆腐的生产，该研究已申请了美国专

利[9]。

实验中分离鉴定出荧光假单孢菌。

荧光假单孢菌是

假单孢菌属中的一个菌种，适合于在液体中生长。

假

单孢菌属分解蛋白质的能力较强，在以蛋白质为主要成

分的食品上生长良好，是水体中分解蛋白质的主要细菌

之一。

假单孢菌是致肉腐败的主要微生物，腐败产物

主要是腐胺，腐败产生的恶臭味和臭豆腐的臭味相似，

然而未见有关大豆蛋白质分解产生腐胺的报道，荧光假

单孢菌发酵臭豆腐是否会产生腐胺，臭味来源是否和肉

类腐败类似，有待发酵实验的进一步证实。

霉菌在腐乳发酵过程中起主要的作用，腐乳的发酵

方式与臭豆腐的发酵方式类似。

然而在本实验中霉菌的

数量远小于细菌，霉菌在臭豆腐发酵过程中是否起作

用，需做进一步的研究。

王友永[5]等在研究臭豆腐的保

鲜时，采用PDA培养基培养出了霉菌菌珠，但对霉菌

的作用没有做进一步的分析。

臭豆腐风味的形成是一个复杂的过程，利用的主要

是蛋白酶和脂肪酶[4]，是一种或几种微生物共同作用的

结果，关于臭豆腐的研究报道相对较少。

本实验筛选

出一种优势菌种，然而离开了为数不多的其他细菌或霉

菌，荧光假单孢菌单一菌种是否可以完成臭豆腐发酵过

程形成传统臭豆腐的风味，需做进一步论证。

参考文献：

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酵工业,2005,31（7）:

97-100.

※生物工程食品科学2007,Vol.28,No.06249

不同方法制备PVA载体进行固定化细胞

发酵酒精的研究

陈功，王联结

（陕西科技大学生命与科学工程学院，陕西咸阳712081）

摘要：

本研究分别用PVA（聚乙烯醇）冷冻法和PVA-H3BO3交联法制备固定化细胞载体进行发酵酒精，结果表明：

PVA冷冻法制备的载体多次发酵时性能稳定，酒精含量最高可达8.37%，实现了重复利用，大大降低了生产成本；

PVA-H3BO3交联法制备的载体单批次发酵效果较好，酒精含量为8.26%，残糖为0.18%，但多次发酵载体变形严

重，不适宜重复利用。

关键词：

聚乙烯醇；固定化细胞；酒精发酵

StudyonEthanolFermentationbyImmobilizedCellwithPVACarrierbyDifferentPreparingMethods

CHENGong，WANGLian-jie

（CollegeofLifeScienceandEngineering,ShaanxiUniversityofScienceandTechnology,Xianyang712081,China）

Abstract：

ThispapercarriedonethanolfermentationbyimmobilizedcellwithPVA（polyvinylalcohol）carrierbyeitherfreezing

orcrosslinkingwithH3BO3.Theresultsshowedthatthecarrierpreparedbyfreezingmethodownsstablecapabilitywhencarried

throughnumerousfermentationandthehighestethanolconcentrationcanachieve8.37%,realizingre-fermentationandcost

reductiongreatly.ThecarrierpreparedbycrosslinkingwithH3BO3hasbettereffectononebatchfermentation,whiletheethanol

concentrationcanachieve8.26%,withresiduesugar0.18%,butthecarrierbecomesmetamorphosedseriously,soitisnot

suitableforre-fermentation.

Keywords：

polyvinylalcohol；immobilizedyeast；ethanolfermentation

中图分类号：

Q932文献标识码：

A文章编号：

1002-6630（2007）06-0249-03

选择适宜的固定化细胞载体是实现工业化的关键，高分子化合物，如琼脂、明胶和卡拉胶等，虽强度得

而载体的好坏又取决于载体的机械强度、寿命和包埋微到改善，但价格偏高。

聚乙烯醇作为包埋载体的优点

生物细胞的容量和活性。

固定载体中应用最广泛的是海有机械强度高、化学性能稳定、抗微生物分解能力强、

藻酸钙，虽易成形、无毒、成本低廉，但强度差，对微生物无毒、价格低廉和使用寿命长等一系列优点，

使用寿命短，对醪液中PO43－敏感[1]。

其他的一些天然近年来在国内外获得了广泛的研究[2]。

本实验将PVA冷

收稿日期：

2006-04-30

作者简介：

陈功（1981-），男，硕士研究生，研究方向为酶及细胞的固定化与发酵工程。

[3]MEGUMIK,KUMIT,SHINKICHIT,etal.AngiotensinI-[6]牛天娇,马莺.中国传统发酵豆制品中微生物的发掘与利用[J].中

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