分子生物学技术原理应用复习.docx
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分子生物学技术原理应用复习
分子生物学技术原理及应用
分子生物学：
通过研究生物大分子（核酸、蛋白质）的结构、功能和生物合成等方面来阐明各种生命现象的的本质。
*系统生物学：
研究生物系统组成成分的构成与相互关系的结构、动态与发生，以系统论和实验、计算方法整合研究为特征的生物学。
*基因组学：
是研究生物基因组的组成，组内各基因的精确结构、相互关系及表达调控的科学。
*蛋白质组学：
指应用各种技术手段来研究蛋白质组的一门新兴科学，其目的是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质组成成份、表达水平与修饰状态，了解蛋白质之间的相互作用与联系，揭示蛋白质功能与细胞生命活动规律。
*示踪分子：
用于标记DNA或者蛋白质的，使之可遗传并被检测出得物质，有放射性和非放射性
*绿色荧光蛋白（GFP）：
这种蛋白质最早是在水母中发现，分子质量为26kDa，由238个氨基酸构成，第65～67位氨基酸（Ser-Tyr-Gly）形成发光团，是主要发光的位置。
在蓝色波长范围的光线激发下，会发出绿色荧光，是常用的报道基因。
*限制性内切酶：
是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸序列（一般具有双重对称的回文结构），并以内切的方式水解双链DNA的核酸水解酶。
PCR：
聚合酶链式反应利用DNA聚合酶体外扩增核酸片段的方法。
*荧光定量PCR（realtimePCR）:
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，对未知模板进行定量分析的方法。
DNA文库：
DNA或DNA的所有片断随机地连接到基因载体上,然后转移到适当的宿主细胞中,通过细胞增殖而构成各个片段的无性繁殖系（克隆）,在制备的克隆数目多到可以把某种生物的全部DNA都包含在内的情况下,这一组克隆的总体就被称为某种生物的基因文库。
*cDNA文库：
以mRNA为模板，经反转录酶催化，在体外反转录成cDNA，与适当的载体（常用噬菌体或质粒载体）连接后转化受体菌，则每个细菌含有一段cDNA，并能繁殖扩增，这样包含着细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合称为该组织细胞的cDNA文库。
内切酶:
内切酶，即限制性核酸内切酶。
亦称限制性核酸酶。
是一类能识别双链DNA分子中特定核苷酸顺序,并以内切方式水解双链DNA的核酸水解酶。
它们不同于一般的脱氧核糖核酸酶（DNase）,它们的切点大多很严格，要求专一的核苷酸顺序——识别顺序。
TAq酶：
是一种耐热的DNA聚合酶，可以耐受90C以上的高温而不失活，常见于PCR技术，用于大量扩增DNA片段。
*Southern-blot:
是一种常用的DNA定量的分子生物学方法。
其原理是将待测的DNA样品固定在固相载体（硝酸纤维膜或尼龙膜）上，与标记的核酸探针进行杂交，在与探针有同源序列的固相DNA的位置上显示出杂交信号，通过检测信号的有无、强弱可以对样品定性、定量，从而计算出转入的拷贝数
*Northern-blot:
是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northernblot的方法可以检测到细胞在生长发育特定阶段或者胁迫或病理环境下特定基因表达情况。
原理类似southern-blot。
*Western-blot：
也称为免疫印迹，是一种分析和鉴定特定蛋白质的技术，用来检测在不均一的蛋白质样品中是否存在目标蛋白的一种方法。
即将混杂的总蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至固相膜（如硝酸纤维素膜、尼龙膜和PVDF膜等）上，再用特定蛋白质抗体进行免疫反应，显色后，可显示出该特定蛋白是否存在及其表达量。
*探针：
是一小段单链DNA或者RNA片段（大约是20到500bp），用于检测与其互补的核酸序列。
双链DNA加热变性成为单链，随后用放射性同位素（通常用磷-32）、荧光染料或者酶（如辣根过氧化物酶）标记成为探针。
*离子交换色谱：
以离子交换树脂作固定相，在流动相带着试样通过离子交换树脂时，由于不同的离子与固定相具有不同的亲合力而获得分离的色谱法。
*气相色谱（GC）：
GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。
用于可挥发、热稳定、沸点不超过500℃的化合物。
待分析样品在汽化室汽化后被惰性气体（即载气，也叫流动相）带入色谱柱，柱内含有液体或固体固定相，由于样品中各组分的沸点、极性或吸附性能不同，造成每种组分在流动相和固定相之间形成分配或吸附不同而分离的的一种技术。
液相色谱：
不受样品挥发度和稳定性限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物高聚物的分析，分析对象为可以溶于水或有机溶剂的的各种物质，大约占有机物70%-80%。
*高效液相色谱（HPLC）：
高效液相色谱是以液体为流动相，采用高压输液系统，将具有不同极性的单一溶剂或不同比例的混合溶剂、缓冲液等流动相泵入装有固定相的色谱柱，在柱内各成分被分离后，进入检测器进行检测，从而实现对试样的分析。
*超高效液相色谱（UPLC）：
在传统的HPLC的基础上通过运用粒径低于2μm的小颗粒来提高色谱柱的柱效，从而相对于传统的液相色谱具有更高的分离度、速度和灵敏度。
流动相：
色谱过程中携带待测组分的向前移动的物质成为流动相，是与固定相处于平衡状态、带动样品向前移动的另一相用作流动相的油气体、液体、超临界流体。
固定相：
是色谱柱内不移动的惰性物质称为固定相，是色谱分析中的关键，混合物组分的分离，主要取决于固定相的选择。
*激光扫描共聚焦显微镜：
利用激光点作为荧光的激发光并通过扫描装置对标本进行连续扫描，并通过空间共轭光阑（针孔）阻挡离焦平面光线而成像的一种显微镜。
是当今世界最先进的细胞生物学分析仪器。
*二维电泳（2-DE）：
是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行等电聚焦电泳（按照pI分离），然后再进行SDS-PAGE（按照分子大小），经染色得到的电泳图是个二维分布的蛋白质图。
二维电泳是分离分析蛋白质最有效的一种电泳手段。
NCBI：
（美国国立生物技术信息中心）它的目的是建立关于分子生物学，生物化学，和遗传学知识的存储和分析的自动系统。
EMBL：
（欧洲分子生物学实验室）由欧洲30个成员国政府支持组成，目的在于促进欧洲国家之间的合作来发展分子生物学的基础研究和改进仪器设备、教育工作等。
分7个部分：
结构、分化、物理仪器、生化仪器、生物仪器、计算机和应用数学。
目前,在研究中已经建立了先进的核苷酸序列数据库。
细菌人工染色体（Bacterialartificialchromosome，BAC）是指一种以F质粒（F-plasmid）为基础建构而成的细菌染色体克隆载体，常用来克隆150kb左右大小的DNA片段，最多可保存300kb个碱基对。
1.基因克隆包括哪几个步骤
原理:
把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组DNA,然后送入受体生物中表达，从而长生遗传物质和状态的转移和重新组合。
步骤：
（1）外源基因的获得，如酶切法、逆转录法、人工合成法。
（2）选择合适的克隆载体（如质粒，噬菌体）并且和外源基因一起用限制性内切酶处理。
（3）将目的基因和克隆载体通过连接酶连接起来，形成重组载体。
（4）将重组载体导入合适的宿主细胞内，进行扩增。
（5）对获得重组载体分子的细胞进行筛选。
（6）重组子的大量培养，检测外源基因是否表达。
2.气相和液相及超高效液相色谱优缺点比较
色谱法也称色层法、层析法，是一类重要的分离分析方法。
分离原理：
当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用（力的作用）。
由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。
因此在同一推动力的作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从而按先后次序从固定相中流出。
气相色谱：
主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。
用于可挥发、热稳定、沸点不超过500℃的化合物（20%-25%）
优点：
1用毛细管柱色谱可得到很高的柱效
2有很灵敏的检出器，如ECD和较灵敏的通用检测器如TCD\FID
3流动相为气体，无毒，易于处理，固定相种类多
4运行和操作容易
5仪器制造难度小
缺点：
1.只能分析挥发性的物质，只能分析20%的化合物；
2.不能用于热不稳定物质的分析。
液相色谱：
不受样品挥发度和热稳定性的限制，它非常适合分子量较大、难气化、不易挥发或对热敏感的物质、离子型化合物及高聚物的分离分析，分析对象为可以溶于水或有机溶剂的各种物质，大约占有机物的70%-80%
优点：
1几乎可以分析各种物质
2可以用于热不稳定物质的分析
缺点：
1色谱柱不能很长，柱效不会很高
2没有较灵敏的通用检测器
3流动相有毒，费用较高，固定相种类少
4运行和操作比较难
5仪器制造难度大
超高效液相色谱：
在传统的HPLC的基础上通过运用粒径低于2μm的小颗粒来提高色谱柱的柱效突破了传统色谱的技术瓶颈，使色谱分离的解析度达到新的高度。
优点：
1高分离度
2高速度
3高灵敏度
缺点：
由于使用了小粒径颗粒，且为了达到高效目的，使用时所产生的压力也自然成倍增大。
故液相色谱的输液泵也相应改变成超高压的输液泵。
3.Western-blot
又称蛋白印迹，是一种分析和鉴定特定蛋白质的技术，用来检测在不均一的蛋白质样品中是否存在目标蛋白的一种方法。
即将混杂的总蛋白经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至固相膜（如硝酸纤维素膜、尼龙膜和PVDF膜等）上，再用特定蛋白质抗体进行免疫反应，显色后，可显示出该特定蛋白是否存在及其表达量。
具体的实验过程如下（以在PVDF膜上直接显色为例）：
（1）利用SDS-PAGE方法进行蛋白质的分离
根据目的蛋白的性质，利用电泳方法将其进行分离。
为提高电转移的效率，通常采用SDS/PAGE技术。
分离实验结束后，首先将样品墙的上边缘用小刀去除，然后在胶板的右上角切一个小口以便定位，小心放入转移缓冲溶液中待用。
（2）利用电转移的方法将蛋白质转移到硝酸纤维膜或者尼龙膜。
准备PVDF膜：
根据胶的大小剪出一片PVDF膜，膜的大小应略微小于胶的大小。
将膜置于甲醇中浸泡1分钟，再移至转移缓冲溶液中待用。
制作胶膜夹心：
在一浅盘中打开转移盒，将一个预先用转移缓冲溶液浸泡过的海绵垫放在转移盒的黑色筛孔板上，在海绵垫的上方放置经转移缓冲溶液浸湿的3MM纸，小心地将胶板放在3MM纸上，并注意排除气泡。
将PVDF膜放在胶的上方同时注意排除气泡，再在膜的上方放上一张同样用转移缓冲溶液浸湿过的3MM纸并赶出气泡，放置另一张浸泡过的海绵垫，关闭转移盒。
将转移盒按照正确的方向放入转移槽中，转移盒的黑色筛孔板贴近转移槽的黑色端，转移盒的白色筛孔板贴近转移槽的白色端，填满转移缓冲溶液同时防止出现气泡。
电转移：
连接电源,在4°C条件下维持恒压100V，1小时。
（3）免疫检测：
利用目的蛋白对应的一抗进行抗原抗体反应，然后再利用酶标的抗抗原（二抗）与一抗反应。
最后加入显影剂进行显色反应。
封闭：
倒出TBS/PBS缓冲溶液,加入封闭缓冲溶液,轻轻摇动至少1小时。
清洗：
倒掉封闭缓冲溶液，并用TBS/PBS缓冲溶液清洗1-3次,每次5-10分钟。
一抗：
倒掉TBS/PBS缓冲溶液，加入适量的一抗溶液，轻轻摇动1小时以上。
清洗：
从容器中倒出一抗溶液，用TTBS/PBST缓冲溶液清洗3次，每次10分钟。
二抗：
倒出TTBS/PBST缓冲溶液，加入适量的二抗溶液，轻轻摇动30分钟左右。
清洗：
从容器中倒出二抗溶液，用TTBS/PBST缓冲溶液清洗3次，每次10分钟。
检测：
倒掉TTBS/PBST缓冲溶液，并加入显影剂，轻轻摇动PVDF膜，观察显影情况，当能够清晰的看到显色带时，用蒸馏水在30分钟内分三次清洗PVDF膜以终止显色反应的继续进行。
（4）实验结果：
检查膜上显色结果，蓝紫色带所对应的即是目标蛋白的位置。
4.利用大肠杆菌表达系统表达蛋白质
优点：
积累了相对充分的研究工作，有多种表型的宿主菌和相应的载体可供选择应用；易于进行遗传操作和高效表达；操作安全，致病能力低；生长速度快；培养基廉价，生产成本低；清楚宿主的遗传背景；表达水平高。
缺点：
缺乏真核生物的转录后和翻译后加工机制，不宜表达真核生物的蛋白；缺乏表达蛋白复性系统，表达蛋白无特异性空间结构,常形成不溶性包涵体（inclusionbody）；表达产物不稳定，易被细菌蛋白酶降解；细菌的内毒素（热源）不易除去，会造成人畜发热。
外源蛋白在大肠杆菌表达系统中的表达过程：
1.选择合适的大肠杆菌表达载体（如分泌型表达载体pET28a）。
2.将编码目的蛋白的基因片段和载体通过连接酶连接，构建重组表达载体。
3.将重组表达载体转化大肠杆菌表达宿主（如DE3）
4.大量培养，诱导表达
5.对表达的蛋白质进行分离纯化。
5.聚合酶链反应（PCR）
PCR技术的基本原理是特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：
①模板DNA的变性：
模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：
模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：
DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。
每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。
6.荧光定量PCR和常规PCR的比较
常规PCR技术：
是一种体外扩增核酸片段的一种方法可以对终产物进行定性分析，但是无法进行定量分析。
常规PCR特点：
特异性强，灵敏度高，简便、快速，对标本的纯度要求低。
荧光定量PCR技术：
在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，对未知模板进行定量分析的方法。
特点：
特异性强，灵敏度高，可直接对产物进行定量，可解决PCR污染问题，自动化程度高，操作简单。
它们主要区别是：
常规PCR技术：
对PCR扩增反应的终产物进行定性及定量分析，是终点定量。
荧光定量PCR技术：
对PCR扩增反应中每一个循环的产物进行定量分析，是起点定量。
两种荧光定量化学染料染色：
SYBR®GreenI是一种双链DNA小沟结合染料，与双链DNA结合时才发光，游离时不发光。
在传统PCR反应体系中，加入过量SYBR荧光染料，SYBR荧光染料能特异性地掺入DNA双链，发射荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发射任何荧光信号，这样就保证了荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。
当PCR循环复制时DNA双链也成倍增长，同样SYBR染料的荧光的信号也随之增倍，通过实时监测整个PCR进程中荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析。
TaqMan原理：
聚合→链取代→Taq酶的5’→3’外切活性→聚合完成
TaqMan荧光探针：
PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的荧光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。
探针完整时，报告基团发射的荧光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5'－3'外切酶活性将探针酶切降解，使报告荧光基团和淬灭荧光基团分离，从而荧光监测系统可接收到荧光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个荧光分子形成，实现了荧光信号的累积与PCR产物形成完全同步。
再通过实时监测整个PCR进程荧光信号的积累，与标准曲线对比进行定量分析。
7.激光共聚焦扫描显微镜与普通荧光显微镜
一、荧光显微镜的成像原理
荧光显微镜是一种较为常用的的光学显微镜.
基本原理:
基本原理:
利用一定波长的激发光对样品进行激发，使之产生一定波长的荧光，从而用于对样品结构或其组分进行定性、定位、定量观察检测。
二、激光扫描共聚焦显微镜的成像基本原理
1）.普通荧光显微镜的不足
荧光标本稍厚时，普通荧光显微镜不仅接收焦平面上的光量，而且来自焦平面上方或下方的散射荧光也被物镜接收，这些来自焦平面以外的荧光使观察到的图像反差和分辨率大大降低（即焦平面以外的荧光结构模糊、发虚，原因是大多数生物学标本是层次区别的重叠结构）。
2）激光共聚焦扫描显微镜的成像原理：
1.采用点光源照射标本，在焦平面上形成一个轮廓分明的小的光点；
2.该点被照射后发出的荧光被物镜收集，并沿原照射光路回送到由双向色镜构成的分光器；
3.分光器将荧光直接送到探测器。
光源和探测器前方都各有一个针孔，分别称为照明针孔和探测针孔。
两者的几何尺寸一致，约100-200nm；相对于焦平面上的光点，两者是共轭的，即光点通过一系列的透镜，最终可同时聚焦于照明针孔和探测针孔。
4.这样，来自焦平面的光，可以会聚在探测孔范围之内，而来自焦平面上方或下方的散射光都被挡在探测孔之外而不能成像。
5.以激光逐点扫描样品，探测针孔后的光电倍增管也逐点获得对应光点的共聚焦图像，转为数字信号传输至计算机，最终在屏幕上聚合成清晰的整个焦平面的共聚焦图像。
8.蛋白质组学研究技术和双向电泳
蛋白质组学研究技术方法：
1.样品制备（细胞裂解，除去杂质，蛋白质溶解）
2.进行二维电泳（2-DE）
3.进行差异分析，选择感兴趣的蛋白，胰蛋白酶处理
4.对感兴趣的蛋白质进行质谱分析
5.对获得的肽指纹图谱进行数据库检索分析
6.进行功能分析
分析蛋白质之间的相互作用关系：
酵母双杂交，噬菌体展示，亲和层析耦联质谱技术，免疫共沉淀耦联质谱技术，蛋白质芯片技术。
酵母双杂交的原理：
典型的真核转录因子，含有二个不同的结构域:
DNA结合结构域（BD）和转录激活结构域（AD）。
BD结构域可识别DNA上的特异序列，并使AD结构域定位于所调节基因的上游。
AD可同转录复合体的其他成分作用，启动它所调节的基因的转录。
BD结构域和AD结构域在结构上可以分开，功能上相互独立。
当BD结构域和AD结构域相互分开时，仍分别具有各自的功能，但不能激活转录。
只有当被分开的BD结构域和AD结构域通过适当的途径在空间上相互接近时，才能重新呈现完整的转录因子活性，并激活基因表达。
利用基因工程技术分别将两个蛋白质和AD结构域和BD结构域融合表达。
若两个蛋白质之间存在相互作用二者互相靠近，就会导致AD结构域和BD结构域相互靠近，激活报告基因的转录表达（宿主一般为营养缺陷型，而报告基因是指导合成该营养物质的基因）。
生物信息学方法：
SWISS-MODEL
6、研究蛋白质组学的技术手段?
1：
蛋白质分离技术
（1）:
二维凝胶电泳（2D-SDS-PAGE）：
第一向为等电聚焦（IEF），根据蛋白质的等电点不同而将其分离，第二向SDS-PAGE，根据其分子量的大小而将其分离。
由于其具有大规模快速分析和鉴定蛋白质的能力以及有较好的可重复性和可比性，相对于蛋白质微列矩阵把其称为蛋白质宏观矩阵。
（2）:
差异凝胶电泳（DIGE）
（3）:
单向电泳（SDS-PAGE）
（4）:
毛细管电泳（capillaryelectrophoresisCE）
2：
蛋白质鉴定技术:
（1）传统方法：
蛋白质微量测序、氨基酸组成分析
新型方法:
生物质谱（MS）：
从细胞、组织或生物体液中提取的蛋白质样品经过二维凝胶电泳分离后，所分离的蛋白点用胰蛋白酶降解进行质谱分析就可以得到该蛋白的肽谱图，根据肽谱图对蛋白质数据库进行检索，即可识别和鉴定所检测的蛋白质。
基本原理：
样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。
（离子源、质量分析器和离子检测器）
（2）联合技术精确鉴定蛋白质
A:
两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF）
B:
傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS）
C:
表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS）
3:
蛋白质组学研究的生物信息学
A:
构建和分析双向凝胶电泳图谱B:
数据库的搜索与蛋白鉴定
常用数据库1）:
瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库。
2）:
目前应用最普遍的数据库是NCBInr和MSDB数据库。
蛋白鉴定的软件1）:
Mascot
（2）:
ProFound3）:
ProteinProspector
4:
蛋白质相互作用分析技术
⏹揭示蛋白质组成员间的相互作用、相互协调的关系，并深入了解蛋白质的结构与功能的相互关系，以及基因结构与蛋白质结构功能的关系。
⏹具体技术
1．酵母双杂交系统
1989年Field和Song等人在酵母细胞中设计的分析蛋白质相互作用的方法。
主要特点:
最主要的应用是快速、直接分析已知蛋白之间的相互作用及分离新的与已知蛋白作用的配体及其编码基因。
优点:
（1）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。
（2）真实反应体内蛋白质间相互作用情况
（3）可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞浆、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能的蛋白。
（4）敏感性高
缺点：
（1）.假阳性结果
某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合体，从而引起报告基因的表达，产生"假阳性"结果。
（2）.限于核内表达的蛋白质的相互作用
双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，而许多蛋白间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、二硫键形成等，这些反应在核内无法进行。
另外有些蛋白的正确折叠和功能有赖于其他非酵母蛋白的辅助，这限制了某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白等的研究。
2.噬菌体展示技术:
在编码噬菌体外壳蛋白基因上连接一单克隆抗体的DNA序列，当噬菌体生长时，表面就表达出相应的单抗.将这种单克隆抗体做成亲和柱，当被分离的蛋白通过亲和柱子时，所含有的目的蛋白就会和相应的的抗体结合，而被特异分离。
3.亲和层析耦联质谱技术:
将某种蛋白质以共价键固定在基质（如琼脂糖）上，含有与之相互作用的蛋白质的细胞裂解液过柱，先用低盐溶液洗脱下未结合的蛋白质，然后用高盐溶液或SDS溶液洗脱结合在柱子上的蛋白质，最后用多维液相色谱耦联质谱技术鉴定靶蛋白的结合蛋白
4.免疫共沉淀耦联质谱技术:
以细胞内源性靶蛋白为诱饵，用抗靶蛋白抗体与细胞总蛋白进行免疫共沉淀纯化靶蛋白免疫复合物，凝胶电泳分离后，质谱鉴定靶蛋白的结合蛋白。
5.蛋白质芯片技术:
将高度密集排列的蛋白分子作为探针点阵固定在固相支持物上，当与待测蛋白样品反应时，可捕获样品中的靶蛋白，再经检测系统对靶蛋白进行定性和定量分析。
蛋白质合成机制：
1：
氨基酸的激活2：
肽链合成的启动3：
肽链的延长4：
肽链合成的终止和释放5：
肽链额折叠和加工处理
RNA聚合酶转录作用过程可以分为三个阶段：
起始、延长及终止。
1.起始：
RNA聚合酶的σ因子识别DNA启动子的识别部位，RNA聚合酶核心酶则结合在启动子的结合部位。
转录作用开始时，根据DNA模板链上的核苷酸的序列，NTP根据碱基互补原则依次进入反应体系。
在RNA聚合酶的催化下，起始点处相邻的前两个NTP以3′、5′一磷酸二酯键相连接。
随后，σ因子从模板及RNA聚合酶上脱落下来，于是RNA聚合酶的核心酶沿着模板向下游移动，转录作用进入延长阶段。
脱落下的σ因子可以再次与核心酶结合而循环使用。
2.延长:
在RNA聚合酶的催化下，核苷酸之间以3′、5′一磷酸二酯键相连接进行着RNA的
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