亚硝酸盐的测定.docx

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亚硝酸盐的测定

关于双汇,春都，雨润猪肉火腿肠中水分，蛋白质,脂肪,亚硝酸盐含量的测定

一、研究对象双汇,春都，雨润猪肉火腿肠

二、研究方法:

用直接干燥法测水分含量，用凯氏定氮法测蛋白质含量,用索氏抽提法测脂肪的含量,用盐酸萘乙二胺法测亚硝酸盐含量

第一法　直接干燥法

　　1　原理

　　食品中的水分一般是指在100℃左右直接干燥的情况下，所失去物质的总量。

　　直接干燥法适用于在95～105℃下，不含或含其他挥发性物质甚微的食品。

　　2　试剂

　　2.1　6N盐酸：

量取100ml盐酸，加水稀释至200ml。

　　2.2　6N氢氧化钠溶液：

称取24g氢氧化钠，加水溶解并稀释至100ml。

　　2.3　海砂：

取用水洗去泥土的海砂或河砂，先用6N盐酸煮沸0.5h，用水洗至中性，再用6N氢氧化钠溶液煮沸0.5h，用水洗至中性，经105℃干燥备用。

　　3　操作方法

　　3.1　固体样品：

取洁净铝制或玻璃制的扁形称量瓶，置于95～105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，加热0.5～1.0h，取出盖好，置干燥器内冷却0.5h，称量，并重复干燥至恒量。

称取2.00～10.0g切碎或磨细的样品，放入此称量瓶中，样品厚度约为5mm。

加盖，精密称量后，置95～105℃干燥箱中，瓶盖斜支于瓶边，干燥2～4h后，盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。

然后再放入95～105℃干燥箱中干燥1h左右，取出，放干燥器内冷却0.5h后再称量。

至前后两次质量差不超过2mg，即为恒量。

　　3.2　半固体或液体样品：

取洁净的蒸发皿，内加10.0g海砂及一根小玻棒，置于95～105℃干燥箱中，干燥0.5～1.0h后取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量，并重复干燥至恒量。

然后精密称取5～10g样品，置于蒸发皿中，用小玻棒搅匀放在沸水浴上蒸干，并随时搅拌，擦去皿底的水滴，置95～105℃干燥箱中干燥4h后盖好取出，放入干燥器内冷却0.5h后称量。

以下按3.1自“然后再放入95～105℃干燥箱中干燥1h左右”起依法操作。

　　3.3　计算

　　式中：

X1——样品中水分的含量，%；

　　m1——称量瓶（或蒸发皿加海砂、玻棒）和样品的质量，g；

　　m2——称量瓶（或蒸发皿加海砂、玻棒）和样品干燥后的质量，g；

　　m3——称量瓶（或蒸发皿加海砂、玻棒）的质量，g。

理

　　蛋白质是含氮的有机化合物。

食品与硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。

然后碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量乘以换算系数，即为蛋白质含量。

　　1.有机物中的胺根在强热和CuSO4，浓H2SO4作用下，硝化生成（NH4）2SO4

　　反应式为：

　　2NH2+H2S04+2H＝（NH4）2S04（其中CuSO4做催化剂）

　　2.在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中

　　反应式为:

　　（NH4）2SO4+2NaOH＝2NH3+2H2O+Na2SO4

　　2NH3+4H3BO3＝（NH4）2B4O7+5H2O

　　3.用已知浓度的H2SO4（或HCI）标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量

　　反应式为：

　　（NH4）2B4O7+H2SO4+5H2O＝（NH4）2SO4+4H3BO3

　　（NH4）2B4O7+2HCl+5H2O＝2NH4Cl+4H3BO3

试剂

　　所有试剂均用不含氨的蒸馏水配制。

　　2.1硫酸铜。

　　2.2硫酸钾。

　　2.3硫酸。

　　2.42%硼酸溶液。

　　2.5混合指示液：

1份0.1%甲基红乙醇溶液与5份0.1%溴甲酚绿乙醇溶液临用时混合。

也可用2份0.1%甲基红乙醇溶液与1份0.1%次甲基蓝乙醇溶液临用时混合。

　　2.640%氢氧化钠溶液。

　　2.70.025mol/L硫酸标准溶液或0.05mol/L盐酸标准溶液。

仪器

　　定氮蒸馏装置：

如图所示。

凯氏定氮法仪器

1.安全管

　　2.导管

　　3.汽水分离管

　　4.样品入口

　　5.塞子

　　6.冷凝管

　　7.吸收瓶

　　8.隔热液套

　　9.反应管

　　10.蒸汽发生瓶

[编辑本段]

操作方法

　　1、样品处理：

精密称取0.2-2.0g固体样品或2-5g半固体样品或吸取10-20ml液体样品（约相当氮30-40mg），移入干燥的100ml或500ml定氮瓶中，加入0.2g硫酸铜，6g硫酸钾及20毫升硫酸，稍摇匀后于瓶口放一小漏斗，将瓶以45度角斜支于有小孔的石棉网上，小火加热，待内容物全部炭化，泡沫完全停止后，加强火力，并保持瓶内液体微沸，至液体呈蓝绿色澄清透明后，再继续加热0.5小时。

取下放冷，小心加20ml水，放冷后，移入100ml容量瓶中，并用少量水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混匀备用。

取与处理样品相同量的硫酸铜、硫酸钾、浓硫酸同一方法做试剂空白试验。

　　2、按图装好定氮装置，于水蒸气发生器内装水约2/3处加甲基红指示剂数滴及数毫升硫酸，以保持水呈酸性，加入数粒玻璃珠以防暴沸，用调压器控制，加热煮沸水蒸气发生瓶内的水。

　　3、向接收瓶内加入10ml2%硼酸溶液及混合指示剂1滴，并使冷凝管的下端插入液面下，吸取10.0ml样品消化液由小玻璃杯流入反应室，并以10ml水洗涤小烧杯使流入反应室内，塞紧小玻璃杯的棒状玻璃塞。

将10ml40%氢氧化钠溶液倒入小玻璃杯，提起玻璃塞使其缓慢流入反应室，立即将玻璃盖塞紧，并加水于小玻璃杯以防漏气。

夹紧螺旋夹，开始蒸馏，蒸气通入反应室使氨通过冷凝管而进入接收瓶内，蒸馏5min。

移动接收瓶，使冷凝管下端离开液皿，再蒸馏1min，然后用少量水冲洗冷凝管下端外部。

取下接收瓶，以0.01N硫酸或0.01N盐酸标准溶液定至灰色或蓝紫色为终点。

　　同时吸取10.0ml试剂空白消化液按3操作。

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计算

　　X=（（V1-V2）*N*0.014）/（m*（10/100））*F*100%　

　　X：

样品中蛋白质的百分含量，g；

　　V1：

样品消耗硫酸或盐酸标准液的体积，ml；

　　V2：

试剂空白消耗硫酸或盐酸标准溶液的体积，ml；

　　N：

硫酸或盐酸标准溶液的当量浓度；

　　0.014：

1N硫酸或盐酸标准溶液1ml相当于氮克数；

　　m：

样品的质量（体积），g（ml）；

　　F：

氮换算为蛋白质的系数。

蛋白质中的氮含量一般为15～17.6%，按16%计算乘以6.25即为蛋白质，乳制品为6.38，面粉为5.70，玉米、高粱为6.24，花生为5.46，米为5.95，大豆及其制品为5.71，肉与肉制品为6.25，大麦、小米、燕麦、裸麦为5.83，芝麻、向日葵为5.30。

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注意事项

（1）样品应是均匀的。

固体样品应预先研细混匀，液体样品应振摇或搅拌均匀。

（2）样品放入定氮瓶内时，不要沾附颈上。

万一沾附可用少量水冲下，以免被检样消化不完全，结果偏低。

　　（3）硝化时如不容易呈透明溶液，可将定氮瓶放冷后，慢慢加入30%过氧化氢（H2O2）2-3ml，促使氧化。

　　（4）在整个消化过程中，不要用强火。

保持和缓的沸腾，使火力集中在凯氏瓶底部，以免附在壁上的蛋白质在无硫酸存在的情况下，使氮有损失。

　　（5）如硫酸缺少，过多的硫酸钾会引起氨的损失，这样会形成硫酸氢钾，而不与氨作用。

因此，当硫酸过多的被消耗或样品中脂肪含量过高时，要增加硫酸的量。

　　（6）加入硫酸钾的作用为增加溶液的沸点，硫酸铜为催化剂，硫酸铜在蒸馏时作碱性反应的指示剂。

　　（7）混合指示剂在碱性溶液中呈绿色，在中性溶液中呈灰色，在酸性溶液中呈红色。

如果没有溴甲酚绿，可单独使用0.1%甲基红乙醇溶液。

　　（8）氨是否完全蒸馏出来，可用PH试纸试馏出液是否为碱性。

　　（9）吸收液也可以用0.01当量的酸代表硼酸，过剩的酸液用0.01N碱液滴定，计算时，A为试剂空白消耗碱液数，B为样品消耗碱液数，N为碱液浓度，其余均相同。

　　（10）以硼酸为氨的吸收液，可省去标定碱液的操作，且硼酸的体积要求并不严格，亦可免去用移液管，操作比较简便。

　　（11）向蒸馏瓶中加入浓碱时，往往出现褐色沉淀物，这是由于分解促进碱与加入的硫酸铜反应，生成氢氧化铜，经加热后又分解生成氧化铜的沉淀。

有时铜离子与氨作用，生成深l蓝色的结合物[Cu（NH3）4]2+

　　（12）这种测算方法本质是测出氮的含量，再作蛋白质含量的估算。

只有在被测物的组成是蛋白质时才能用此方法来估算蛋白质含量。

目的

　　索氏抽提法，用于粗脂肪含量的测定。

脂肪广泛存在于许多植物的种子和果实中，测定脂肪的含量，可以作为鉴别其品质优劣的一个指标。

脂肪含量的测定有很多方法，如抽提法、酸水解法、比重法、折射法、电测和核磁共振法等。

目前国内外普遍采用抽提法，其中索氏抽提法（Soxhletextractormethod）是公认的经典方法，也是我国粮油分折首选的标准方法。

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原理

　　采用索氏抽提法中的残余法，即用低沸点有机溶剂（乙醚或石油醚）回流抽提，除去样品中的粗脂肪，以样品与残渣重量之差，计算粗脂肪含量。

由于有机溶剂的抽提物中除脂肪外，还或多或少含有游离脂肪酸、甾醇、磷脂、蜡及色素等类脂物质，因而抽提法测定的结果只能是粗脂肪。

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实验材料、主要仪器和试剂

1、实验材料

　　油料作物种子、中速滤纸

2、仪器：

（1）索氏脂肪抽提器（图1）或YG-Ⅱ型油分测定器

（2）干燥器（直径15～18cm，盛变色硅胶）

　　（3）不锈钢镊子（长20cm）

　　（4）培养皿

　　（5）分析天平（感量0.001g）

　　（6）称量瓶

　　（7）恒温水浴

　　（8）烘箱

　　（9）样品筛（60目）

3、试剂

　　无水乙醚或低沸点石油醚（A.R.）

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操作步骤

1、切片

　　将滤纸切成8cm×8cm，叠成一边不封口的纸包，用硬铅笔编写顺序号，按顺序排列在培养皿中。

将盛有滤纸包的培养皿移入105±2℃烘箱中干燥2h，取出放入干燥器中，冷却至室温。

按顺序将各滤纸包放人同一称量瓶中称重（记作a）、称量时室内相对湿度必须低于70％。

2、包装和干燥

　　在上述已称重的滤纸包中装入3g左右研细的样品，封好包口，放入105±2℃的烘箱中干燥3h，移至干燥器中冷却至室温。

按顺序号依次放入称量瓶中称重（记作b）。

3、抽提

　　将装有样品的滤纸包用长镊子放入抽提筒中，注入一次虹吸量的1.67倍的无水乙醚，使样品包完全浸没在乙醚中。

连接好抽提器各部分，接通冷凝水水流，在恒温水浴中进行抽提，调节水温在70～80℃之间，使冷凝下滴的乙醚成连珠状（120～150滴/min或回流7次/h以上），抽提至抽取筒内的乙醚用滤纸点滴检查无油迹为止（约需6～12h）。

抽提完毕后，用长镊子取出滤纸包，在通风处使乙醚挥发（抽提室温以12～25℃为宜）。

提取瓶中的乙醚另行回收。

4、称重

　　待乙醚挥发之后，将滤纸包置于105±2℃烘箱中干燥2h，放入干燥器冷却至恒重为止（记作c）。

结果与计算

　　粗脂肪含量（%）=（b－c）/（b－a）×100

　　式中：

a：

称量瓶加滤纸包重（g）

　　b：

称量瓶加滤纸包和烘干样重（g）

　　c：

称量瓶加滤纸包和抽提后烘干残渣重（g）

附注

（1）测定用样品、抽提器、抽提用有机溶剂都需要进行脱水处理。

　　这是因为：

第一，抽提体系中有水，会使样品中的水溶性物质溶出，导致测定结果偏高；第二，抽提体系中有水，则抽提溶剂易被水饱和（尤其是乙醚，可饱和约2％的水），从而影响抽提效率；第三，样品中有水，抽提溶剂不易渗入细胞组织内部，结果不易将脂肪抽提干净。

（2）试样粗细度要适宜。

　　试样粉末过粗，脂肪不易抽提干净；试样粉末过细，则有可能透过滤纸孔隙随回流溶剂流失，影响测定结果。

　　（3）索氏抽提法测定脂肪最大的不足是耗时过长，如能将样品先回流1～2次，然后浸泡在溶剂中过夜，次日再继续抽提，则可明显缩短抽提时间。

　　（4）YG-Ⅱ型油分测定器容量大，适合于样品较多的选种鉴定工作使用，温度控制在70℃左右，8h可提取完毕。

　　（5）必须十分注意乙醚的安全使用。

　　抽提室内严禁有明火存在或用明火加热。

乙醚中不得含有过氧化物，保持抽提室内良好通风，以防燃爆。

乙醚中过氧化物的检查方法是：

取适量乙醚，加入碘化钾溶液，用力摇动，放置1min，若出现黄色则表明存在过氧化物，应进行处理后方可使用。

处理的方法是：

将乙醚放入分液漏斗，先以1/5乙醚量的稀KOH溶液洗涤2～3次，以除去乙醇；然后用盐酸酸化，加入1/5乙醚量的FeSO4或Na2SO3溶液，振摇，静置，分层后弃去下层水溶液，以除去过氧化物；最后用水洗至中性，用无水CaCl2或无水Na2SO4脱水，并进行重蒸馏。

操作细节

　　1、如何利用残余法测定油料作物种子中的粗脂肪含量？

　　残余法测定油料作物种子中的粗脂肪含量，是用低沸点有机溶剂（乙醚或石油醚）回流抽提，除去样品中的粗脂肪，以样品与残渣重量之差，来计算粗脂肪含量。

　　2、测定过程中为什么需要对样品、抽提器、抽提用有机溶剂都要进行脱水处理？

　　进行脱水处理的原因有三：

第一，抽提体系中有水，会使样品中的水溶性物质溶出，导致测定结果偏高；第二，抽提体系中有水，则抽提溶剂易被水饱和（尤其是乙醚，可饱和约2％的水），从而影响抽提效率；第三，样品中有水，抽提溶剂不易渗入细胞组织内部，结果不易将脂肪抽提干净。

　　3、在实验过程中安全使用乙醚应注意哪些问题？

　　抽提室内严禁有明火存在或用明火加热。

乙醚中不得含有过氧化物，保持抽提室内良好通风，以防燃爆。

　　4、测定样品粒子粗细有什么要求？

　　试样粗细度要适宜。

试样粉末过粗，脂肪不易抽提干净；试样粉末过细，则有可能透过滤纸孔隙随回流溶剂流失，影响测定结果。

（一）亚硝酸盐测定

　　2　原理

　　样品经沉淀蛋白质、除去脂肪后，在弱酸条件下亚硝酸盐与对氨基苯磺酸重氮化后，再与N－1－萘基乙二胺偶合形成紫红色染料，与标准比较定量。

　　3　试剂

　　实验用水为蒸馏水，试剂不加说明者，均为分析纯试剂。

　　3.1　氯化铵缓冲液：

1L容量瓶中加入500mL水，准确加入20.0mL盐酸，振荡混匀，准确加入50mL氢氧化铵，用水稀释至刻度。

必要时用稀盐酸和稀氢氧化铵调试至pH9.6～9.7。

　　3.2　硫酸锌溶液（0.42mol/L）：

称取120g硫酸锌（ZnSO4?

H2O），用水溶解，并稀释至1000mL。

　　3.3　氢氧化钠溶液（20g/L）：

称取20g氢氧化钠用水溶解，稀释至1L。

　　3.4　对氨基苯磺酸溶液：

称取10g对氨基苯磺酸，溶于700mL水和300mL冰乙酸中，置棕色瓶中混匀，室温保存。

　　3.5　N－1－萘基乙二胺溶液（1g/L）：

称取0.1gN－1－萘基乙二胺，加60%乙酸溶解并稀释至100mL，混匀后，置棕色瓶中，在冰箱中保存，一周内稳定。

　　3.6　显色剂：

临用前将N－1－萘基乙二胺溶液（1g/L）和对氨基苯磺酸溶液等体积混合。

　　3.7　亚硝酸钠标准溶液：

准确称取250.0mg于硅胶干燥器中干燥24h的亚硝酸钠，加水溶解移入500mL容量瓶中，加100mL氯化铵缓冲液，加水稀释至刻度，混匀，在4℃避光保存。

此溶液每毫升相当于500μg的亚硝酸钠。

　　3.8　亚硝酸钠标准使用液：

临用前，吸取亚硝酸钠标准溶液1.00mL，置于100mL容量瓶中，加水稀释至刻度，此溶液每毫升相当于5.0μg亚硝酸钠。

　　4　仪器

　　4.1　小型粉碎机。

　　4.2　分光光度计。

　　5　操作方法

　　5.1　样品处理

　　称取约10.00g（粮食取5g）经绞碎混匀样品，置于打碎机中，加70mL水和12mL氢氧化钠溶液（20g/L），混匀，用氢氧化钠溶液（20g/L）调样品pH＝8，定量转移至200mL容量瓶中加10mL硫酸锌溶液，混匀，如不产生白色沉淀，再补加2～5mL氢氧化钠，混匀。

置60℃水浴中加热10min，取出后冷至室温，加水至刻度，混匀。

放置0.5h，用滤纸过滤，弃去初滤液20mL，收集滤液备用。

　　5.2　测定

　　5.2.1　亚硝酸盐标准曲线的制备：

吸取0，0.5，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0，2.5，5，10，15，20，25μg亚硝酸钠），分别置于25mL带塞比色管中。

于标准管中分别加入4.5mL氯化铵缓冲液，加2.5mL60%乙酸后立即加入5.0mL显色剂，加水至刻度，混匀，在暗处静置25min，用1cm比色杯（灵敏度低时可换2cm比色杯），以零管调节零点，于波长550nm处测吸光度，绘制标准曲线。

　　低含量样品以制备低含量标准曲线计算，标准系列为：

吸取0，0.4，0.8，1.2，1.6，2.0mL亚硝酸钠标准使用液（相当于0，2，4，6，8，10μg亚硝酸钠）。

　　5.2.2　样品测定：

吸取10.0mL上述滤液（5.1）于25mL带塞比色管中，自5.2.1“于标准管中分别加入4.5mL氯化铵缓冲液”起依法操作。

同时做试剂空白。

　　6　计算

　　式中：

X1——样品中亚硝酸盐的含量，mg/kg；

　　m1——样品质量，g；

　　m2——测定用样液中亚硝酸盐的质量，μg；

　　V1——样品处理液总体积，mL；

　　V2——测定用样液体积，mL。

　　结果的表述：

报告算术均值的二位有效数。

　　7　允许差

　　相对相差≤10%。

数据：

直接干燥法：

干燥前干燥后再次干燥后第三次干燥之后

双汇31.9528.9628.7428.74

春都30.9827.9027.6627.66

雨润31.2028.2127.8627.86

亚硝酸盐测定的

关于标准曲线的数据

0.00:

0.048

0.20:

0.062

0.40:

0.074

0.60:

0.095

0.80:

0.106

1.00:

0.120

1.50:

0.159

2.00:

0.195

2.50:

0.234

关于样品的：

（你们今天测得就是，昨天测得这个我觉得有点问题）

关于蛋白质和脂肪的数据得问别的组要，因为咱们是分工合作的，呵呵

（三）亚硝酸盐的测定

1、实验原理

亚硝酸钠有较好的水溶性，可用水浸取，亚硝酸盐在酸性条件下与对氨基苯磺酸发生重氮反应形成重氮苯磺酸（无色），重氮盐再与萘乙胺发生偶氮反应生成红色化合物，该化合物颜色的深浅与样品中亚硝酸盐的浓度成正比，故可进行比色定量分析。

2、仪器：

恒温水浴；烧杯；玻璃棒；温度计；250mL容量瓶；25mL比色管；移液管；721分光光度计；

3、试剂：

（1）缓冲液：

分析纯HCl2mL加水40mL混匀后加分析纯浓氨水5mL，再加水至100mL定容；

（2）溴甲酚紫指示剂：

溴甲酚紫0.1g溶于100mL水中；

（3）饱和硫酸铝钾：

分析纯KAL（SO4）220g加80mL水，微加热溶解用上清液；

（4）亚硝酸钠标准液（2ug/mL）：

精确称取在硫酸干燥器中放置24h后的分析纯亚硝酸钠0.1000g，加水溶解至1000mL，加氯仿数滴，摇匀，临用时取2mL定量至100mL，此液相当于亚硝酸钠2ug（2ug/mL）；

（5）0.1%萘乙二铵：

称取0.1g萘乙二铵溶于10mL醋酸中，蒸馏水定容至100mL，避光保存。

（用前现配，或贮于冰箱内可保存数月）；

（6）1%对氨基苯磺酸溶液：

对氨基苯磺酸1g溶于10%醋酸至100mL（加热助溶）。

室温低于20℃时，用前在水浴上加热溶解。

4、操作步骤

（1）肉制品样品处理：

将研细的火腿肠称取5g→250mL烧杯中，+100mL蒸馏水→80℃水浴中时时搅拌20分钟→取出于烧杯中加入三种试剂（5mL缓冲液；2滴指示剂；4滴饱和硫酸铝钾）颜色刚好消失→转入250mL容量瓶中，冷却后定容→过滤（棉花）；

（2）标准系列管及样品管的制备：

取25mL比色管6支，按下表顺序加试剂后定容至25mL。

表2-1样品测定及标准曲线制作过程中试剂添加表

加入试剂

样品管

标准系列管

0

1

2

3

4

样品滤液mL

5

亚硝酸钠mL

0

0.5

1.0

1.5

2.0

1%对氨基苯磺酸mL

每管2.5

0.1%萘乙二铵mL

每管0.5

亚硝酸钠的相应含量ug

0

1.0

2.0

3.0

4.0

（3）测定及制作标准曲线：

将以上各管加蒸馏水至刻度，混匀，静止20分钟后，于480nm处测其光密，并绘制标准曲线（以亚硝酸盐含量为横坐标，以吸光值为纵坐标）。

（4）计算：

样品中含亚硝酸钠（mg/kg）=

式中：

A——样品管相当亚硝酸钠的含量（ug）；

W——为样品重（g）；

V1——样品处理后的定容体积（mL）；

V2——样品管中样品滤液的体积（mL）；

V3——比色样品的体积（mL）。

附：

国家标准规定：

作为发色剂使用量。

硝酸钠肉类制品≤0.5g/kg；

亚硝酸钠肉类罐头≤0.15g/kg；

亚硝酸钠肉类制品≤0.15g/kg。

mg\g

残留量以亚硝酸钠计，肉类罐头不得超过0.05g/kg，肉制品不得超过0.03g/kg。