南开大学微生物遗传学整理于1206.docx

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南开大学微生物遗传学整理于1206

基因是一个含有特定的遗传信息的核苷酸序列，是遗传物质最小的功能单位。

微生物遗传学是一门以病毒、细菌、放线菌、小型真菌以及单细胞动植物为研究对象的遗传学的分支学科。

基因组（Genomy）一种生物编码所有功能所必须的基因的结合体，基因组也指单倍体生物的一套DNA。

S.Cerevisiae全基因组序列测定的意义:

1、第一个真核生物基因组全序列测定2、当时最大的基因组全序列测定

3、S.cerevisiae有16条染色体，总长度12mb（1.2X107bp）4、最小的染色体为1号染色体230kb,

5、最大染色体为4号染色体1532kb6、包括:

蛋白质编码基因5885个，r-RNA编码基因140个,

7、t-RNA编码基因275个详细介绍见Science，vol.274，1996p.546“LifeWith6000Genes”

8、原核生物已测序的基因组都小于2mb（200万bp）:

9、流感嗜血杆菌1.8mb（180万bp）

10、λ噬菌体48.5kb11、φX1745383n.t.

三、微生物作为遗传研究材料的优越性

1．为什么在基因作用的研究中采用微生物为材料？

二倍体细胞中的遗传物质组成

2．微生物的优越性

1）独特的生物学特征：

单倍体、单细胞、易培养、繁殖快2）便于获得营养缺陷型

3）可为高等生物的遗传学研究建立基础

1．转化实验（Transformation）

第一步：

1928年,F.Griffith,Diplococcuspneumoniae,Invivo

活的R型＋杀死的S型→注射小鼠→小鼠死亡→从死亡小鼠中分离出活的S型细胞（图）

第二步：

1930~1931年,H.P.RobertSia,M.DawsonInvitro

活的R型＋杀死的S型→分离出活的S型细胞

第三步：

1933年,L.AllowayCellfrell

杀死的S型→石英沙磨碎→过滤→上清液

（Cellfrell抽提物）＋活的R型→活的S型细胞

第四步：

1940～1944年,O.T.Avery分别转化

提取S型细胞的多糖、蛋白、RNA、DNA→分别转化R型细胞→只有用DNA（1.6ng）转化可获得

转化子（图）

2病毒重建实验（VirusReconstruction）1956年，FraenkelConrat

实验材料：

TobaccoMosaicVirus（TMV和HR）,94%Protein,6%RNA

1）分别提取TMV的RNA和外壳Protein分别提取HR的RNA和外壳Protein

2）交替组装重建TMV和HR病毒

3）分别感染烟草

4）观察：

A.病症象TMV还是HR？

B.产生的子代病毒是TMV还是HR？

病毒重建实验结果：

1、RNA来自哪一个亲本，病症就象哪一个亲本

2、RNA来自哪一个亲本，产生的子代病毒也同于哪一个亲本

二、细菌染色体的结构

1、E.coliDNA全长约1300μm，是菌体细胞的1000倍。

1997年完成基因组全序列测定，大小为4.7x106bp,包括基因4100个。

2、超螺旋，高度折叠。

3、参与DNA折叠的类组蛋白（histone-likeprotein）种类：

–FIS:

factorforinversionstimulation–H-NS:

histone-likenucleoidstructoryprotein

–HU:

heat-unstablenucleoidprotein–IHF:

integrationhostfactor

特点:

1高度压缩,多层折叠E.coli细胞长度为3~5μ,其DNA长约1300μ。

2许多基因有多个拷贝E.coli复制DNA所需的时间长于细胞世代时间,因此当第一个复制周期尚未结速,第二个第三个复制周期已经开始

三、细菌染色体的复制

1.θ型复制

2.与DNA复制有关的酶和蛋白

3.染色体复制起点和复制起始阶段

4.染色体复制终止

E.coliDNAθ型复制

E.coliDNA为环形分子

每一个相继的复制周期从一个固定的起点（oriC）开始双向复制

证明:

遗传学方法,放射自显影方法

单链DNAphage基因组复制特点:

1、φX174DNA复制:

SSRF,RFRF,RFSS2、复制方式为单向不对称3、复制是半保守的

3、复制过程中仅涉及两条亲链中的一条,另一条亲链始终为环状,保持一套完整的遗传信息

一、组成和结构

•核小体（Nucleosome）:

由双链DNA和组蛋白构成的染色体基本单位。

中心为四种组蛋白各2分子的8聚体，外围缠绕着DNA分子，两个核小体之间的DNA与1分子的H1组蛋白结合。

多个核小体连接起来形成染色质，染色质浓缩、反复折叠便成为一定形状的染色体。

酵母菌核小体结构中无H1组蛋白。

二、复制特点

•真核生物细胞的生活周期分为4个时期：

G1期：

复制预备期S期：

复制期G2期：

有丝分裂准备期M期：

有丝分裂期

染色体DNA复制发生在S期。

复制是通过许多独立的复制子完成的。

复制子只有起始点，无终止点，通常采取双向复制

区别1：

与原核生物不同，真核生物的复制子相对较小，复制速度慢。

区别2：

真核生物染色体在全部复制结速之前，复制起点不会再开始新的一轮复制，而在快速生长的原核生物中，复制起点可以连续发动复制，而真核生物快速生长时往往采用更多的复制起点。

1.原核生物基因的结构

–编码区：

从起始密码子开始至终止密码子为止的一个连续编码序列，称为开放阅读框架（ORF）。

–启动子（Promoter）:

位于基因5’末端上游的一段非编码核苷酸序列，功能是与RNA聚合酶结合，

形成转录起始复合物。

―10区是RNA聚合酶核心酶与DNA分子结合部位，共有序列为：

TATAAT。

－35区是RNA聚合酶σ因子识别DNA分子的部位，共有序列为：

TTGACA。

–终止子（Terminator）:

位于基因或操纵子末端，提供转录终止信号的DNA区段。

2.真核生物基因的结构

真核生物的蛋白质编码基因以及其它基因的编码序列中，被一种称为内含子（Intron）的非编码序列所间断。

有3种RNA聚合酶，各自分工转录不同类型的基因：

PolI转录rRNA基因（5srRNA除外），PolII转录蛋白质编码基因，PolIII转录编码众多小分子RNA，包括tRNA和5srRNA。

增强子（Enhancer）：

真核生物基因表达的重要调控元件。

能使与其连锁的基因转录频率明显增强的DNA序列，长度一般为100～200bp。

具有下列特点：

1.使基因转录增强10～200倍，有的达上千倍。

2.增强效应与位置和取向无关。

3.可远离转录起始点起作用。

4.无基因的专一性，对同源、异源基因都有效。

沉默子（Silencer）：

属于负调控元件，对成簇基因的选择性表达起重要作用。

重叠基因（Overlappinggene）

一个基因的核苷酸与另一个基因的核苷酸之间存在一定程度的重叠现象。

类型1：

一个基因的序列完全包含在另一个基因序列之中。

类型2：

一个基因的末端密码区与另一个基因的起始密码区重叠出一个新的基因。

噬菌体ΦX174基因组最显著的特征是基因的重叠现象，ΦX174共有11个基因，其中基因B,K,E分别位于基因A,C,D中，但使用不同的阅读框架，见图示。

断裂基因（Splitgene）基因的编码序列在DNA分子上是不连续的，被不编码的序列所隔开。

编码序列称为外显子，不编码的序列称为内含子。

断裂基因在表达时，先转录一条包括外显子和内含子的前体mRNA（称为核内不均一RNA），经过剪切和连接，除去内含子区域，形成成熟的mRNA，便可以翻译蛋白质了。

真核生物基因多数都含有内含子，如啤酒酵母中，4％的基因含有内含子。

原核生物的基因一般没有内含子,但E.coliT4phage的胸苷酸合成酶基因中含有一个长达1017bp的内含子。

断裂基因的存在，有利于生物的变异和进化，有利于储存较多的遗传物质。

基因组（Genome）:

一种生物编码所有功能所必须的基因的结合体。

基因组也指单倍体生物的一套DNA。

结构基因组学（StructuralGenomics）研究基因和基因组的结构、各种遗传元件的序列特征、基因组作图和基因定位。

功能基因组学（FunctionalGenomics）研究基因不同序列结构的不同功能、基因表达的调控、基因与环境，基因与蛋白，基因与基因之间的相互作用。

一般来说，在微生物中，无论原核还是真核微生物，其基因组都相对比较小，其中最小的E.coli

phageMS2只有3000bp,仅含3个基因。

几种微生物及其代表生物的基因组情况见下表。

突变的应用实例：

青霉素诱变育种

1943年，首次从一只发霉的金黄瓜上分离到青霉菌，青霉素产率仅20μg/mL

1948年，经多次x射线和紫外线诱变选出wis48-701菌株，青霉素产率为900μg/mL

1949年，用氮芥诱变选出wis49-133菌株，青霉素产率为1800μg/mL

1955年，用化学诱变剂处理后，青霉素产率提高为3000μg/mL

1965年，青霉素产率8,000μg/mL1972年，青霉素产率28,000μg/mL

1990年，青霉素产率300,000μg/mL

1.突变的表现型

1）形态突变型:

包括菌落、孢子、荚膜、色泽、鞭毛、嗜菌斑

2）生理生化突变型:

包括营养要求、代谢产物生成能力、糖分解能力、温度敏感突变型

3）抗性突变型：

抗药物、抗嗜菌体、抗紫外线

4）条件致死突变型：

营养缺陷型（X-）、温度敏感突变型（Ts）对抗生素敏感（Amps）、抑制基因

突变型

2.遗传信息的改变

1）同义突变（samesensemutation）2）错义突变（misssensemutation）3）无义突变（nonsensemutation）

3.遗传物质结构的改变

1）遗传物质结构微小的改变（转换、颠换、移码）

2）遗传物质结构较大的改变（缺失、重复、倒位、易位）

基因命名的规则及要点：

1.每一基因座位用3个小写英文字母表示，并用斜体。

如：

lysine基因为lys,proline基因为pro

2）表型相同的不同基因突变，用3个小写英文字母后的大写字母表示。

如：

proA,proB,lysA,lysB

3）同一基因的不同位点突变，用基因符号后的阿拉伯数字表示。

如：

proA315,proA2033

4）如突变位点所属基因还不确切，则大写字母用一短线代替。

如：

pro-5，lys-1,短线后的数字表示菌株序号。

5）基因型的表型用大写字母表示，并加正负号。

如：

Pro+,Pro－

6）抑制基因（suppressor）突变型表示为sup+，野生型表示为sup－

7）F因子上的基因要用“；”或“/”与染色体基因分开表示，缺失用“Δ”表示，并写在却失基因之前。

如：

ΔuvrB表示与紫外线修复有关的uvrB基因缺失。

基因符号实例：

E.coliCSH13F’lacZproA+B+;Δ（lacZpro）表示：

大肠杆菌CSH13菌株染色体上的lacZ和pro基因缺失,而该菌株的F因子上携带有这两个基因。

1.随机性

就微生物的某一群体而言，基因突变的发生在时间上、个体上、基因上或位点上都有明显的随机性。

2.独立性

一个基因突变与另一个基因突变之间是互不相关的独立事件。

3.稳定性

基因突变是遗传物质发生突变的结果。

突变型基因与野生型基因一样具有相对稳定的结构，并可以稳定遗传。

4.可逆性

野生型基因突变成突变型基因，称为正向突变；突变型基因变回野生型基因,称为回复突变。

回复突变

原因有3种：

真正的回复突变;基因内抑制；基因间抑制。

5.稀有性

一般来讲，自发突变率很低。

通过理化因素的处理，可以提高突变的频率

突变率：

每一细胞每一世代或其它规定的单位时间内，发生突变的机率。

可以与DNA分子发生化学反应，并使其结构发生改变的物质，统称为诱变剂。

用诱变剂处理细胞得到突变型，则为诱发突变。

根据突变诱发机制，化学诱变剂分为碱基置换诱变剂和移码诱变剂。

碱基置换诱变剂包括碱基类似物（5－溴尿嘧啶、2－氨基嘌呤）和碱基改造剂（亚硝酸、羟胺、烷化剂）

天然碱基结构类似物－5-溴尿嘧啶

5-溴尿嘧啶是胸腺嘧啶（T）的甲基集团被溴原子取代后形成的结构类似物，通过分子的互变异构显示出其诱变活性。

见图示：

化学诱变剂亚硝酸、羟胺、烷化剂（EMS）

辐射诱变的特点1.辐射有直接作用

2.点突变出现的频率与照射剂量呈直线关系，这些剂量关系曲线都通过原点，证明任何一点辐射都足以诱发突变

3.只要总剂量不变，多次照射和一次照射的诱变效果相等。

既：

少量多次辐射和一次大量辐射的剂量效应相同。

平均致死剂量

平均每一细胞被击中一次的辐射剂量，此剂量的存活率为37％。

依据:

波松分布公式P0=e－m假定一次击中就能致死，则m=1P0=e－1=1/2.71=0.37

四、移码突变

移码突变多发生在碱基重复的DNA序列图示

五、生物因子的诱变作用

转座因子或称可动的遗传因子，是存在于基因中，具有特定结构的DNA片段，无固定的位置，能在基因组内或基因组间来回移动。

转座因子分为3类：

1.插入序列（Is）只含与转座有关的基因2.转座子（Tn）除转座基因外还带有抗药基因

3.转座噬菌体（Mu）结构复杂，分子量大

切离

转座因子从插入位置消失的过程。

准确切离引起回复突变

基因符号表示：

双冒号表示插入

lacZ21:

:

Tn3,galT135:

:

Is4,P1:

:

Tn5,λ:

:

Tn5

六、诱变作用的专一性

回复突变的专一性：

羟胺、丫啶类、缺失突变、转座子

正向突变的专一性：

热点（HotSpot）:

一个基因中突变率特别高的位点。

一、证实基因突变是自发的

1．波动实验S.E.Luria,M.Delbruck2．涂布实验3．影印实验J.Lederberg

二、自发突变的机制

三、适应突变

一、证实基因突变是自发的

基因突变的自发性是基因突变的第一规律

1.基因突变是遗传物质自我运动的结果，突变的发生是随机的。

2.突变呈多方向性。

3.环境条件可以诱发突变，但突变不一定按照环境的要求而相应的改变，两者无因果关系。

一、证实基因突变是自发的基因突变的传统观点

1、从远古以来，人们总是观察到生物界与环境无比完美的协调和适应关系。

2、细菌对抗生素惊人的“适应”现象

3、从拉马克到达尔文都持有获得性遗传观点，认为生物体对环境的变化总是有适应性、定向性和可遗传性，是可累积的、渐变的。

4、适应学说认为细菌是生命的特殊类型，不存在自发突变。

抗噬菌体细菌的出现是自发突变还是后天获得的遗传免疫性？

？

S.E.Luria通过周密的实验设计、严格的推理获得毫不含糊的结论：

细菌抗噬菌体突变是基因突变的结果，可以发生在细菌接触噬菌体之前。

波动实验借助于统计学原理设计。

见实验过程图示：

波动实验原理

•适应学说预期：

噬菌体的存在诱发了抗性细菌的出现。

把正生长的、对T1敏感的细菌（tons）培养物与T1接触后，所出现的抗T1细菌（tonr）的数量在任何生长条件下都应该是常数，既平均数＝方差。

•变异学说预期：

抗T1细菌（tonr）是在接触T1之前的生长过程中，由于基因自发突变而产生的，则

tonr出现的频率将依据1.抗性是否出现，2.出现时间的早晚而呈现巨大的波动，既平均数≠方差。

对波动实验结果的正确解释

•抗性菌落多，是突变发生的早；抗性菌落少，是突变发生的晚；抗性菌落无，是没有发生突变。

•结论：

细菌抗性的出现与接触噬菌体无关。

突变是自发的，噬菌体T1无诱发抗性细菌的作用。

涂布实验思考题

•经重新涂布的一组平皿，出现的抗性菌落多，是否可以理解为，经重新涂布后，细菌接触噬菌体的机会增多了，从而诱发成抗性的也多了呢？

为什么？

影印培养实验

•J.Lederberg建立，实验证明：

细菌对抗生素抗性的表型与菌体所接触的环境因素之间没有对应关系。

细菌并不针对某些药物而产生抗性

•细菌链霉素抗性基因strr=rpsL（ribosomalproteinsmall）编码核糖体蛋白小亚基的基因共有21个：

rpsA~rpsU,分别编码S1~S21蛋白,rpsL基因编码S12蛋白。

细菌对链霉素产生抗性的原理

•链霉素抗性菌株strr的核糖体30s亚基的s12蛋白变构，不与链霉素结合，使翻译蛋白正常。

•链霉素敏感菌株strs的核糖体30s亚基的s12蛋白是正常的，可与链霉素结合，使翻译不正常。

•已知影响翻译过程的抗生素有20余种。

二、自发突变的机制

1.DNA分子的内部运动（碱基的互变异构）2.DNA环出引起的缺失突变

3.细胞自身代谢物的干扰4.转座子

三、适应突变（Adaptivemutation）

•适应突变是指微生物细胞群体，在非致死的选择条件下，处在不分裂或缓慢分裂状态时延长培养时间，细胞发生的一种自发突变。

•目前发现，表现适应突变的基因大多是有关碳源利用、氨基酸或核苷酸合成的营养缺陷型基因，但这些突变基因都可以自发突变成为原养型基因。

适应突变实例：

E.coliFC40Δlac/（F’lac-）

•F因子上的lac基因构建成组成型表达，但该基因的第320密码子发生了移码突变，由CCCCCCC，因此表型为lac–

•将FC40菌株涂布在以乳糖为惟一碳源的平板上培养时，第二天出现1～2个lac+回复突变的菌落,继续培养至第7天时lac+回复突变的菌落就会达到40多个。

见下图：

适应突变的分子机制是什么？

•对早期和后期出现的lac+回复突变子的突变机制分析发现，这两类是不一样的。

•后期出现的lac+回复突变子被认为是适应突变所产生，大多是在lac基因区段发生了单一碱基的缺失，既发生了－1的移码突变，使原来＋1的移码突变得到了修正，表型为lac+回复子；

•而早期出现的lac+回复突变子被认为是自发突变所产生，情况比较复杂，有缺失碱基、有添加碱基还有重复，无论是哪一种，最终都是恢复原来的读码框架，而表型为lac+。

•发现与细胞中的重组蛋白有关，如recA,B,C,D四个基因。

初步认为与甲基指导的DNA错配修复系统有关,更广泛深入的研究尚在进行中。

DNA损伤修复RepairofDNADamage

一、光复活修复（Photoreactivation）

二、甲基化引导的错配修复（MethyldirectedMismatchRepair简称MDMR）

三、切除修复（ExcisionRepair）四、重组修复（RecombinationRepair）五、SOSRepair

光复活修复特点：

1是由可见光激活2酶促裂解胸腺嘧啶二聚体3具高度专一性

甲基化引导的错配修复系统（MDMR）

•MDMR是E.coli的主要修复系统之一，主要修复DNA双链中的轻微损伤，包括错配、移码、碱基类似物的替代等等，而DNA的重大损伤要靠其他的修复系统。

•参与该修复系统的蛋白主要有4种：

MutS:

与错配位点结合MutH,MutL：

结合在MutS蛋白上，形成3种蛋白复合物，MutH有核酸酶的作用，可切割DNA链

Dam：

甲基化酶，特异识别GATC序列中的A,•MDMR的修复模型见图示。

切除修复ExcisionRepair参与切除修复系统的基因

基因产物的功能

uvrADNA结合蛋白

uvrB与UvrA结合，再结合到DNA上，造成3’端切口

uvrC与UvrB结合形成复合物，造成5’端切口

uvrDDNA解旋酶，帮助移去受损伤的寡核苷酸

polADNA聚合酶I，以未损伤链为模版，填充缺口

ligDNA连接酶，封合单链缺口

SOSRepair是DNA分子在较大范围受到重大损伤时，诱导产生的一种修复机制。

借用国际通用的紧急呼救信号“SOS”（saveoursoul）来命名，表示细胞处于危机状态。

1953年JeanJ.Weigle发现：

噬菌体被uv照射后，感染E.coli，多数噬菌体死亡，存活的少数噬菌体中，突变型很少；

•如噬菌体被uv照射后，感染uv照射的E.coli，存活的噬菌体数大大增加，而且有较多的噬菌体突变。

因此前一现象称为W-复活效应（W-reactivation）,后一现象称为W-诱变效应（W-mutagenesis）。

SOS修复开始，错配碱基增加DNApolymeraseIII的校正功能失活！

SOS修复中重要的基因

据2002年文献报道，SOS修复中应答基因超过40个。

Cell有一类基因称为din基因（damageinduciblegene），都在DNA损伤后才大量表达，许多din基因参与SOS修复，但多数基因的功能尚不清楚。

recA和lexA是SOS中重要的调控基因

对recAlexA两个基因的作用机制的了解，来自下面几个实验结果：

1recA－lexA－菌株均不呈现W-效应

2E.colirecA+（λ+）uv释放λE.colirecA－（λ+）uv不释放λ

3recA+细菌在释放λ之前，λC1蛋白被降解41978年分离出RacA蛋白,MW.=40,000d.1979年分离出LaxA蛋白,MW.=24,000d.5RacA蛋白有蛋白酶活性，使LaxA蛋白发生自我切割，证明RacA蛋白是SOS中正控蛋白。

6lexA－/lexA+局部二倍体细胞中，lexA－呈显性，细胞无SOS应答能力，证明lexA基因是负控调节基因，编码阻遏蛋白。

调节机制见图2－19

umuC和umuD基因与SOS诱导的突变有关

1.灵敏度

能将少数突变型选择出来，将多数未突变类型淘汰掉。

回复突变比正向突变更容易选择：

CMMM

正向突变X+X—＋—筛选困难

回复突变X—X+＋＋筛选容易

2.代表性

–对于一种生物具有诱变作用的药物，对其它生物是否同样有诱变作用？

–对某一基因有较强诱变作用的药物，对其它基因是否也有同样的作用

3.方法要简便

爱姆斯测验（AmesTest）

1972年由BruceAmes建立，使用一套突变型的沙门氏菌：

TA1535rfaΔuvrBhisG46碱基置换TA1536rfaΔuvrBhisC207移码突变GC缺失

TA1537rfaΔuvrBhisC3076移码突变GC增加TA1538rfaΔuvrBhisD3052移码GC/CG双缺

理论依据：

认为细胞癌变是某些体细胞基因发生突变的结果。

菌株的特点：

1.均为组氨酸缺陷型，但突变类型不同，不但可以证明诱变作用，还可以检测诱变机制。

2.除组氨酸缺陷型外，又引入2个突变基因：

rfa:

深度粗糙突变型，加强细胞表面透