超声波处理对微晶纤维素水凝胶的影响.docx
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超声波处理对微晶纤维素水凝胶的影响
超声波处理对高分子微晶纤维素水凝胶的影响
NanangMasruchina，Byung-DaeParka,，ValerioCausinb
a韩国庆北国立大学木材和纸张学系,Daegu,702–701
b意大利帕多瓦大学化学科学部门，Marzolo1,35131
摘要:
本研究调查的是声波降解法处理对药物释放行为的影响特征，既由孤立的高分子微晶微纤维（CMFs）2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧基介导氧化使羧酸盐表面成负电荷制备水凝胶。
水凝胶是由负离子间相互作用诱导而制造的。
既带电的CMFs和金属阳离子（AL3*）。
声波降解法对CMFs的羧酸盐部分没有影响，但它极大地影响水凝胶药物的释放行为。
这些结果表明,声波降解法对水凝胶的药物释放行为有一定的影响。
关键词:
纤维素微纤维声波降解法离子交联水凝胶药物释放
简介
水凝胶是高亲水性的三维网络状结构材料，能够吸收大量的水分。
水凝胶被广泛用作吸附剂、净水剂、传感器、隐形眼镜、组织工程,药物传递系统[1]。
水凝胶是可以通过物理的或化学的交联作用合成的微孔型聚合物，可以分为合成聚合物或天然聚合物。
纤维素基水凝胶，由于分子量大，所以很容易被吸引，通常被制成可再生的、能生物降解的、无毒的天然聚合物[2]。
尽管细菌纤维素（BC）型水凝胶通常在许多生物医学方面应用和在药物传递系统方面有好的应用[3],然而这种BC-水凝胶的制作是一个成本高和低效的过程[4]。
另一方面,纳米纤维素材料可以从大量木材和其他木质纤维素的产品中有效分离出来（5-8）。
纳米纤维素的使用对于纤维素微纤丝（CMFS）和纤维素纳米晶须（CNWs）应用于水凝胶是一个启发的阶段。
这些纳米纤维素是最有可能成为未来先进应用的材料之一[9-11]。
引入纳米纤维素作为药物载体的基本原因是其表面具有高体积能，和负离子有很好的交换反应能力，具有潜在高效载荷和控制最优剂量的能力[12]。
药物从水凝胶中的释放是通过水凝胶分子内部的交联所形成线性结构[13]。
然而,关于研究纯纤维素水凝胶在药物释放方面的报道很少[14]。
最近,通过将纤维素分子溶解在各种有机溶剂中通过交联所形成的纤维素水凝胶被制成。
然而,这些有机溶剂的使用限制了纤维素水凝胶的应用，因为在有机溶剂中会有一些有毒的副反应。
安倍和矢野[15]的研究报道得出水凝胶的形成是将高度结晶的CNFs通过碱处理（9-15wt%氢氧化钠）来制备的。
凝胶网络是通过缠绕和接合在CNFs上形成的，然而这些综合的碱化因素可能会减低纳米纤维素在碱水溶液中的溶解性[16]。
Syverud等人研究[17]得出水凝胶的形成是通过将聚乙烯亚胺和聚乙烯N烯丙胺结合在处于孤立的CNFs纤维素上，然后通过速控体系氧化来制备的。
反应中将醛组作为公认的合适的交联反应试剂。
Dong等[18]成功地通过TEMPO体系对可调水凝胶进行氧化，合成了各种CNFs的阳离子（一价，二价和三价）。
由于是通过阴离子羧酸盐类（氧化途径）和阳离子金属盐形成的交联聚合物,导致水凝胶比较牢固。
Saito等[14]调查得出通过自对准调整水凝胶在水中的pH值在pKa以下，使CNFs表面的羧酸盐形成稳定的结构。
这种结构的水凝胶具有突出的属性,由它产生的气凝胶具有很大的表面积和超低密度。
相比于CNF基的水凝胶，在此，我们提出了一个相当简单而有效的方法来制备水凝胶,既通过引入经不同水平的声波处理TEMPO表面的电荷对阔叶漂白硫酸盐浆（HW-BKP）的不同作用来制备。
其中悬浮的部分被称为纤维素的微纤丝。
细胞的直径估计在纳米至微米大小的范围（7.07
0.99nm
10
）[19]。
这种超声技术是利用纳米纤维在纳米大小范围来制备纤维素的一种新方法[20]。
然而，由于植物细胞壁的复杂层次结构和含有较多的氢键，通过TEMPO体系氧化得到的纤维是宽分布的聚合纳米纤维。
因此，通过采用超声波处理后的TEMPO氧化体系，可以使聚合的纳米纤维防止由于表面带负电荷所引起的静电斥力[21]。
因此，通过研究发现超声氧化悬浮的纤维素，其性能方面会影响羧酸盐类的分子量，粘度，透明度和形态。
纤维素基微纤丝（CMFS）水凝胶的形成除了由三价阳离子产生外，还包括由它们的机械性能、化学结构和内部结构产生的化合物。
最后，通过把一种药物加载到这种水凝胶中去研究控制药物释放的行为。
目前的做法是通过提出了一种非常简单、高效的生产方式既纤维基水凝胶。
实验材料
将从茂林纸业有限公司获得的干木漂白硫酸盐浆（HW-BKP）在使用前保存在一个恒定的温度25°C。
TEMPO，溴化钠（NaBr），和次氯酸钠（NaClO）是从西格玛奥德里奇购买的。
从德山纯化学品有限公司购买的硝酸铝（Al（NO3）3.9H2O）是用来作纤维素表面电荷的交联剂。
水（电导率：
6毫秒/厘米）是从一个反渗透装置Upure系统（罗技，Daegu，韩国）进行纯化处理得到的。
作为药物释放评价模型，所使用的是从奥德里奇购买的无水茶碱（分子量=180.16；纯度>98%）。
方法
通过超声处理NaBr、NaClO得到羧化纤维素钠，用TEMPO体系氧化调控使其水溶液pH在10.5[22]。
将纤维素粉末（2克）、TEMPO（0.025克）和NaBr（0.25克）溶解在150毫升水中进行稀释。
将次氯酸钠溶液（12.5%，8毫升，7.85毫摩尔/克）逐滴加入到上述溶液中启动氧化。
滴加0.5MNaOH使该混合物的PH值控制在10.5。
该反应是在室温下（23°C）反应约75分钟，直至没有PH值的进一步变化，表示反应结束。
通过滴加盐酸（0.5M）使混合物被中和。
为了获得稀溶浆，应进行多次氧化反渗透过滤洗涤。
为了获得2%（W/W）的不溶于水的TEMPO氧化纤维素悬浮液，将水（200毫升）添加到上述溶液中。
使用超声波sonomasher（功率30%，频率20320赫兹）与直径为1厘米的探针对悬浮液进行不同处理（即，20，40，和60分钟）。
为了防止机器过热，超声处理过程中应间隔10分钟操作。
羧基含量测定
根据Saito等人用电导滴定法对CMF的羧基含量的报告[22]。
简单来说，就是将0.05%固体纤维素溶解在80毫升去离子水中，然后加5毫升的0.01MNaCl制成CMF悬浮液。
通过加入0.1M的盐酸，使悬浮液的PH值被调整到2.5至3，然后以0.1毫升/分钟加入0.01M的NaOH使pH升至11。
对于电导滴定典型的曲线如图1所示。
其中电导率一直在下降，直到加入NaOH使酸被中和后才开始增加。
在（V1）到（V2）之间，该电导率始终保持不变。
此外，通过进一步加入NaOH溶液电导率有所增加。
电导率的变化可以用热导仪记录（sevengo，梅特勒托莱多，中国）。
作为比较，该仪器除了可以分离悬浮CMF的碳纳米纤维，通过将其12.300g离心40min（labogene1580离心机，gyrozen，有限公司，大田，韩国），同时还能测量羧酸酯基团的含量。
羧酸盐的含量通过方程组
（1）进行测定，如下：
羧基含量
=
（1）
粘度和透明度
测量悬浮液的粘度用的是超声Brookfield粘度计（模型DV-II+Pro）。
5厘米直径2号主轴能用来精确的测量粘度。
测量时是在温度22°C下进行的，用250毫升的样品，采用的转速是60rpm使用的是15%的1–扭矩。
每个数据需要重复测量三个参数。
悬浮液的透光率是利用紫外-可见分光光度计测定的（optizen3220uv–，大田农药残留快速检测仪有限公司，韩国）。
纤维素悬浮液的浓度应控制在0.3%（重量/体积）。
收集的数据所使用的是波长在200至1000纳米之间测得的。
图1电导滴定法计算羧基的典型曲线方程。
插图显示典型的悬浮CMF和CNF图像。
细胞悬浮液的凝胶化是通过添加三价阳离子（Al3+）进行的。
既将50毫米的Al（NO3）3，1.6毫摩尔/克溶液，轻轻的加入到纤维素微纤丝的顶部，不搅拌悬浮液。
在烧杯的悬浮液中加入（25毫升）的阳离子发生迅速的凝胶反应。
然后将水凝胶放在室温下保存一段时间。
再将水凝胶从烧杯中取出，用去离子水冲洗几次到确保没有自由的阳离子为止。
水凝胶性质的测定
流变仪（火星，哈克，德国）是用来测量水凝胶的储存和压缩强度。
标准的流变试验是使用刀片把仪器切成圆形管（直径为4厘米，厚度为1厘米）。
得到的线性粘弹性的应变率为0.01%。
稳定的剪切试验的进行是在室温下使用35毫米直径的板，板之间的距离为0.1到100弧度/秒进行重复测量。
此外，分析水凝胶试样的压缩强度时是通过对细胞悬浮液添加三价阳离子（Al3+），然后剪切成4厘米尺寸的直径和2厘米的厚度来进行的。
在室温下进行重复测量时使用的是应变率为0.1%/分钟进行测量的。
全反射红外光谱的测量
使用全反射红外光谱（alpha-p模型（ATR-IR），布鲁克Optics，德国）测定低毒冷冻干燥的水凝胶的吸光度。
测定的吸光度是在400到4000cm-1的波数范围内。
为了增强噪声比的信号，每个样品平均扫描24次。
FE-SEM分析
用场发射扫描电子显微镜（SEM）（日立S-4800，日本）方法分析研究水凝胶内部的形态。
将水凝胶样品浸入液氮中冷冻，用现有的FE-SEM观察，然后使用烘干机（韩国fda8508，ilshinbiobase，有限公司，）来生产气凝胶。
将气凝胶样品的断裂面用碳胶带安装在样品存根中，然后用（HPC-1SW，真空离子镀膜机日本东京设备公司）涂摸5秒钟。
图像的加速度是用5伏的电压获得的。
比表面积和孔径分析
将气凝胶样品（0.01–0.02g）放置在323K的细胞样品中，脱气5小时。
比表面积和孔气凝胶的大小分别采用在相对蒸气压为77K下的N2吸附法测定，然后在0.02-1范围内解吸。
特定的表面积是使用布鲁诺尔-埃米特-特勒（BET）的方法进行测定的。
此外，纤维素型气凝胶的平均孔径是利用巴雷特joynerhalenda氮解吸等温线（BJH）方法进行估计的。
纤维素气凝胶的的直径（D）是采用式
（2）进行估计的，假设原圆筒状的纤维的密度是
=1460公斤立方米[23]：
（2）
在这里，
c是纤维素的密度,BET是指特殊的表面积。
纤维素结晶度的X射线衍射分析
纤维素水凝胶结晶性的评价是通过将气凝胶样品进行X射线衍射（XRD）测定的。
XRD的测量是用X射线衍射仪（D/max-2500，理学，日本）进行的。
将cuka-1射线在波长为1.541A下进行分析。
通过2U反射模式既用速率为68/分钟步长0.028扫描获得的数据应在108到408的范围内。
使用方程（3）从相应的X射线衍射谱线计算结晶度[24]：
结晶度
=
（3）
其中，I200是纤维素在228和238之间的最大峰强度，Iam是纤维素原纤维在188和198之间的最小峰强度。
水凝胶溶胀率
将约0.2克的气凝胶样品浸入200毫升的水中膨胀。
测定定量的水分从吸收前后的质量差异以及反应的时间。
将样品仔细筛选，多余的水用滤纸除去。
用式（4）计算膨胀比（SR）：
SR=
（4）
其中，Wo和Wt分别是样品在水中溶胀前后的重量。
药物释放的研究
将茶碱药物（0.02%瓦特/湿水凝胶）加入到经过超声波处理的水凝胶中，经搅拌后加入到纤维素悬浮液中。
这是混合悬浮液化的过程。
载药水凝胶被切断成一个长方体的形状，尺寸分别为1厘米，3厘米和1厘米。
然后将样品浸泡在一个装满蒸馏水的烧杯中。
将样品放在约3.5毫升蒸馏水的烧杯中，并采用紫外光谱仪（optizen3220uv，大田农药残留快速检测仪有限公司，韩国），在紫外/可见光谱为273nm波长下每小时测定水中的药物浓度。
将样品定量加入到烧杯中，通过在不同时间测得的的药物浓度，使用标准曲线（R2=0.999）进行校准。
由方程（5）计算得到药物的累积释放率：
累积释放
=
（5）
其中，Wdt是药物在时间t的质量，W
是样品在水凝胶中载药总重量。
所有的药物释放试验样品必须重复进行。
结果与讨论
氧化纤维素羧酸酯基团的含量
纤维素被TEMPO体系所氧化而产生的以负纤维素为主的羧酸盐基团将C6伯羟基表面的羧基进行反应形成了少量的二次醛基。
超声处理的氧化纤维素的不同羧基含量如图2。
经过TEMPO体系氧化的纤维素的羧基含量从0.15毫摩尔/克的HW-BKP增加到0.67毫摩尔/克。
超声处理氧化的细胞在不同时间羧基细胞的含量没有改变。
然而，当将碳纳米纤维进行分离出CMFs的悬浮液时,碳纳米纤维的羧基含量被确定为高达0.82毫摩尔/克，事实上这可能是由于碳纳米纤维有比CMFs更大的表面积，这表明碳纳米纤维具有更多的负交联电荷。
图2在不同处理时间处理的氧化纤维素的羧基含量
细胞形态
用光学显微镜观察悬浮细胞的形态如图3所示。
图3不同超声处理的氧化纤维素悬浮液照片。
插图说明纤维凹陷（气球状结构）是由于超声波处理纤维素表面带电基团及它们之间的静电斥力。
值得注意的是，用超声波处理降低悬浮液中CMFs的分数，这表明在悬浮液中碳纳米纤维含量的增加。
随着处理时间的增加，纸浆纤维逐渐从原纤化变成较小的碎片，超细的纤维，到最后是纳米纤维。
正如预期的那样，长时间超声处理，CMF的悬浮液变得更加的透明。
这可能是由于超声的颤动效应。
在超声处理的CMF悬浮液体中，由于超声导致的高强度声空化，导致生长气泡的破裂，从而提供了一种超声化学能量约为10–100kJ/mol[1]的影响。
在超声空化中，由于气泡的破裂产生瞬时强烈的局部加热和高压过程[25]。
表面阴离子电荷的存在促进了颤动过程，从而导致纤维素微纤丝内部的静电斥力[20]。
60min超声处理的典型的气球状结构（黑色箭头）从图3可以看出。
气球的宽度是原纸浆的两倍以上。
这种现象类似于uetani和Yano使用高速搅拌机处理在纳米纤维中观察到的的物理现象[26]。
CMF悬浮液的粘度和透明度
CMF悬浮液的粘度随着超声处理时间的增加而升高（图4a）。
初始粘度的上升可能是由于高表面积的CNF比例增加使之与水介质强烈的互动[27]。
此外，随着超声波处理时间的增加，CMF的悬浮液的透明度由15%增加到45%（图4b）。
在分离纯化的CNF悬浮液中透明度比在CMF悬浮液中较高（85%）；因此，透明度的增加表明超声波处理形成的细胞悬浮液中有纳米碳纤维。
CMF和CNF悬浮液外观的比较如图1可见。
纤维素水凝胶的力学性能
超声时间（min）波长（nm）
图4超声处理对悬浮液粘度（a）和透明度（b）的影响。
纤维素水凝胶的力学性能是通过储能模量分析确定（G0），损耗模量（G00）和压缩强度是利用流变仪确定的。
这些测量数据的研究结果如图5。
微凝胶G0，G00的剪切速率没有显著的变化（图5a），这表明CMF的悬浮液与被添加的阳离子发生了交联。
高价的铝阳离子可能会导致相邻多个羧酸基团产生更大的静电引力，并在原纤维上产生聚合[18]。
在应用频率方面，G0值总是高于G00值，表示其中有一个稳定相互作用。
随着处理时间的增加，G0，G00的值也增加。
高表面积的碳纳米纤维的存在促进了与相邻的纤维素微纤丝的聚合和交联。
正如预料的那样，水凝胶的抗压强度遵循一个类似储能模量的趋势（图5b）。
此外，我们不能从超声波处理的氧化纤维素水凝胶中获得其中的颤动过程。
图5纤维素水凝胶的机械存储能（a）G0）压缩强度损耗模量（G00）（b）
纤维素水凝胶的化学基团
图6不同的超声处理制备纤维素水凝胶的ATR-IR光谱。
不同超声处理冷冻干燥水凝胶的ATR-IR光谱，如图6所示。
超声处理时间不影响水凝胶的位置和吸收强度，说明增加处理时间没有引起水凝胶的化学变化[28]。
据报道延长超声处理，会诱导各种超微结构的缺陷，如缩短，打结，和引起在制浆过程中的颤动[29]。
然而，处理氧化纤维素纸浆会导致产生1630，1636和1743，1769厘米的新的高峰，分别为羧酸盐羧酸基团。
因此，这些新功能基的出现清楚地证明了氧化反应的成功。
这些阳离子诱导的细胞也导致该–COO–拉伸交联，向高波数转变明显，这是由于阳离子和羧酸基团离子键之间形成了表面改性纤维素[30]。
由于羧基的原因在1743–1769
周围出现一个新的肩峰。
根据Dong等人的报道这是由于溶液中的金属盐在低PH值下水解的羧酸基团加入水凝胶中形成了Al3+。
[18]。
该报道还认为–COOH在水凝胶中形成的基团也可以影响该水凝胶的溶胀行[31,32]。
其在3344到3349cm-1和1160
分别出现了宽峰，表明受到拉伸和弯曲，其中CH2伸缩频率出现在2912–2917厘米范围内。
样品在1038
有两个共同拉伸高峰，高峰在897厘米是由于纤维素链
-c-o-c-化学键的原因。
纤维素水凝胶的结晶度
由于纤维素水凝胶的溶胀行为是由于纤维素晶体堆积密度的影响，利用该冻干纤维素水凝胶来计算相应的的结晶度。
图7显示的是微凝胶形态的典型X射线。
正如预想的那样，衍射图的所有微凝胶呈现一二峰型，峰的位置几乎相同。
图7（a）典型的XRD衍射图（b）结晶纤维素气凝胶
这种X射线衍射图是典型的纤维素2
反射，包括14.98
，15.78
，和22.68
被分别加到101，10-1，和002模型上[33]。
使用这些衍射图谱，纤维素水凝胶的结晶度使用式（3）进行量化。
结果在图7b中可见。
这表明，超声处理时间不影响微凝胶离子交联形成结晶排列。
根据Briois等人的研究[29]，超声至少需要3小时，才能将纤维素的晶形变体。
在我们的研究报道下的纤维素最多需要进行1小时处理，因此，如果能够获得微纤维素水凝胶，这种凝胶可以说是属于节能型水凝胶。
水凝胶形态的SEM分析
冻干凝胶的内部形态（气凝胶的特点是利用FE-SEM）。
图8显示了使用三种不同的超声方法扫描凝胶图像。
图8使用不同的超声时间制备纤维素水凝胶的SEM图像。
箭头表示纳米纤维素微纤丝。
总体而言，水凝胶的内部结构是有一些孔间隙的[34]。
前面所讨论的CMF悬浮液的粘度和透明度，其中水凝胶内部的图像也证实了碳纤维存在（图8中箭头所示）。
随着处理时间增加水凝胶的结构变得更加具有多孔性。
这些多孔结构通过直接或间接的离子交联相互作用制成纤维素。
所有的水凝胶都具有层状结构，是由冻结的水分子和冻干的纤维素诱导形成的[35]。
使用短的处理时间可以保留得到如图所示的许多纤维纸浆（图8中箭头）凝胶，更长的超声观察得到更为层状结构的凝胶。
这些观察表明，CNF的存在部分影响水凝胶的内部结构。
水凝胶的表面积和孔径
通过比较超声时间对纤维素水凝胶内部结构的影响如具体的纤维直径，凝胶的孔隙半径和表面积（图9）。
超声时间（min）超声时间（min）
图9（a）纤维直径和比表面积（b）不同声波处理时间的凝胶的孔隙半径
增加超声时间可以增加凝胶的比表面积，而纤维直径随着超声时间的增加而减少（图9a）。
这些结果表明CNF特性的增加，与高达66平方米/克的表面积，超声时间过程的延长[31]有关。
这些结果是通过FE-SEM观察得到的一致的关于形态方面特征的结论，这表明使用超声处理20分钟到60分钟得到的微晶纤维素的聚合是得到广泛应用的。
气凝胶的孔径也是使用巴雷特乔伊娜（BJH孔径分布）的方法估计的（图9b）。
除了超声处理40分钟外，超声时间没有显着影响水凝胶的孔隙半径。
它被认为是交联水凝胶中孔隙半径较小的。
然而，从FE-SEM分析报告中可以看出（图8），气凝胶是具有多孔层状结构的纤维集合体。
因此，不能在纤维素的应用中假设有一个均匀的圆柱形的结构[23]。
水凝胶的溶胀行为
从水凝胶制备气凝胶的溶胀中比较水凝胶的吸水特性（图10）。
时间（min）
图10采用不同的超声波时间处理水凝胶的溶胀行为
气凝胶吸附完所有的水形成片层结构并达到平衡溶胀的时间在5分钟之内。
这种现象是与氧化纳米纤维素的网络结构溶胀快速有关的[36]。
由于微晶纤维素的存在，其中有许多亲水性羟基基团，以及在ATR-IR下水凝胶中存在的有羧酸基团，导致高吸水性水凝胶在初始时刻就能吸水。
初始的吸水后，随着时间的增加，水凝胶溶胀没有再继续。
这可能要归因于CMFs的高结晶度，防止了细胞溶胀。
溶胀率最低的样品需要使用60分钟才能制备。
使用较长的处理时间来溶胀的原因是由于是在一个比例更大的水凝胶薄膜中形成的，这导致增加了分子的交联，导致产生一个更密集和更紧凑的水凝胶网络的形成。
增加了水渗透到水凝胶的难度。
作为这样的一个结果，水凝胶的吸水性能显著下降，导致相应的膨胀比减少。
然而，这可能是由于水凝胶中纤维素具有较小的孔隙半径，超声处理40分钟并没有观察到变化。
水凝胶药物释放
纤维素水凝胶的多孔结构，高表面积，强吸收水分的能力使其作为药物载体的释放可以得到控制。
茶碱药物从水凝胶中累积释放的时间如图11。
时间（min）
图11不同超声时间对茶碱载水凝胶的释药行为
药物的释放速度是相当低的小于（20%），这可能是由于水凝胶具有相对恒定的溶胀（平衡状态）和通过短曝光时间（即24小时）的扩散来释放药物的。
对于所有的水凝胶，药物在6小时内急剧累积释放，并进一步一直增加释放到最后释放完毕。
采用超声处理60分钟的时间来制备的水凝胶得到的是释放行为最慢的水凝胶。
这些药物的释放特性是具有相当一致的溶胀行为如图10所示的水凝胶。
因此，这些结果表明，水凝胶的特性，如形态，表面积，孔隙大小，水凝胶的完整性，和表面电荷，对药物的释放行为有一个显著的影响。
结论
纤维素水凝胶的成功制作是一个简单的方法，就是通过把其中正三价金属阳离子添加到CMF悬浮液中，然后由TEMPO体系氧化，用不同时间的超声氧化制备纤维素纸浆。
CMFs的羧酸盐组的含量是不受超声时间处理的影响。
然而，超声波处理时间的比例会影响其在CMF悬浮液中的纳米碳纤维，这反过来又影响了水凝胶的内部结构。
增加处理时间会导致存储模量的增加，而压缩强度，微凝胶的表面积，计算纤维直径会减小。
延长处理时间不影响纤维素水凝胶的化学结构和结晶度。
因此，水凝胶的内部结构对药物的溶胀行为和释放行为都有显著的影响，这表明水凝胶的内部结构可以通过超声时间来控制和操纵药物从水凝胶中的释放行为。
鸣谢
这项研究得到了韩国和意大利双边联合的支持，研究方案通过了韩国国家研究基金会（NRF）和得到朝鲜（NRF）的资助。
由教育部，科学，技术（批准号：
2013k1a3a1a25037202）Valerio批准。
感谢意大利外交部，每拉作用德尔direzione兴业Sistema的支持。
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