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基因与生活
暨南大学
本科生课程论文
论文题目：
基因治疗在传染病中的治疗
学院：
学系：
专业：
课程名称：
基因与生活
学生姓名：
学号：
指导教师：
2011年12月20日
基因治疗在传染病中的治疗
【摘要】传染病是目前人类所面临的一类重大疾病，在某些疾病状态下，人类还未找到理想的治疗方法，如病毒感染等。
现代基因治疗是一种应用基因工程技术和遗传学原理，对人类疾病进行治疗的新治疗法。
主要是指对致疾病基因的修正和基因增强及采用外源性细胞因子基因，核酸，基因药物进行疾病治疗的方法。
传染病的基因治疗包括：
基因疫苗，RNA干扰，胞内抗体，淋巴基因表达等。
【关键词】基因疫苗RN干扰胞内抗体淋巴基因表达
【Abstract】
【Keywords】
基因工程
基因工程是生物工程的一个重要分支，它和细胞工程、酶工程、蛋白质工程和微生物工程共同组成了生物工程。
所谓基因工程（geneticengineering）是在分子水平上对基因进行操作的复杂技术。
是将外源基因通过体外重组后导入受体细胞内，使这个基因能在受体细胞内复制、转录、翻译表达的操作。
它是用人为的方法将所需要的某一供体生物的遗传物质——DNA大分子提取出来，在离体条件下用适当的工具酶进行切割后，把它与作为载体的DNA分子连接起来，然后与载体一起导入某一更易生长、繁殖的受体细胞中，以让外源物质在其中“安家落户”，进行正常的复制和表达，从而获得新物种的一种崭新技术。
它克服了远缘杂交的不亲和障碍。
1974年，波兰遗传学家斯吉巴尔斯基（WaclawSzybalski）称基因重组技术为合成生物学概念，1978年，诺贝尔生医奖颁给发现DNA限制酶的纳森斯（DanielNathans）、亚伯（WernerArber）与史密斯（HamiltonSmith）时，斯吉巴尔斯基在《基因》期刊中写道：
限制酶将带领我们进入合成生物学的新时代。
2000年，国际上重新提出合成生物学概念，并定义为基于系统生物学原理的基因工程。
1现状
1,1我国传染病现状21世纪人类依然面临着传染病的挑战，首先是新发现传染病的挑战。
就全球而言，艾滋病是当前首恶，因其主要通过血液，吸毒，性行为传播，潜伏期长，隐袭性强，控制难度大；特别是妇女感染率高且可以垂直传播，严重危害儿童的健康。
由于艾滋病伴以控制，所以到目前为止没有一种特效药物可以治疗艾滋病。
我国2003年比2002年发病率上升44.9%，人类免疫缺陷病毒检出率提高了55%.2004新年伊始在东北亚韩国，日本及东南亚越南，泰国以及中国和美国部分地区禽流感暴发，导致大量家禽死亡，同时H5N1病毒在人群中感染率极高。
更有严重的是疯牛病（在人类称为克雅克病）的阮病毒蛋白对煮沸等常有消毒方法不起作用，病毒潜伏期长，死亡率高达100%。
这两种病毒的传染率极高，而且对人类的两种主食——牛肉，禽肉的供应造成困难。
由于人与动物关系密切，气候的变化，以及化学物品的广泛应用，微生物发生变异导致新的传染病，甚至恐怖主义分子的袭击。
其次，老的传染病对人类健康的影响同样不能忽略。
以2002年为例，WHO统计全球发生传染病攻击356824000列次，站各种疾病发生率的0.0195%，均远低于全球而言，特别是发展中国家，传染病不可忽略。
据我国疾病预防中心报道，我国传染病童年发病2320764次，死亡4520次。
传统性传染病一些情况值得我们注意：
（1）发病数和发病率：
我国2002年全国传染病报告发病率2440588列次，发病率比2001年下降了5.74%，
（2）死亡率和病死率：
从死亡人数看，2002年死亡4520列，比前一年死亡3576例增加了26.4%，且2003年比2002年同期有上升了17.43%，增加了1280例。
2003年死亡人数死于SARS者349例，狂犬病1980例，且后者比2002年增高了821例，高于SARS。
（3）病种分布:
2002年和2003年发病数居前3为的均是病毒性肝炎，结核于细菌性痢疾，死亡人数居前3为的是狂犬病，肺结核及病毒肝炎。
同样，最老的传染病结核主要由于耐药增加近年全球复燃，我国亦面临结核的严重挑战。
2003年其余死亡数位居前10位的其他传染病还有新生儿破伤风，艾滋病，乙型肝炎，SARS，细菌性痢疾，出血热，流行性脑脊髓炎。
其中除SARA及艾滋病外，均是老的传染病控制不住的反复出现。
儿童传染病死亡原因亦破伤风，中毒，麻疹与流行性脑脊髓炎为主，这就影响了我国的优生政策。
1.2.1多种疾病的基因治疗目前，基因治疗的范围从过去罕见的单基因疾病扩大到常见的单基因疾病和多基因疾病的治疗。
遗传性疾病的基因治疗多数属于单基因缺陷所引起的疾病基因治疗。
FANG等以腺性病为载体，进行了以靶细胞为载体的专门研究，从而得到基因技术的一大进步。
儿恶性肿瘤的基因治疗已进行了大量的预备性试验，美国科学家勾践了重组的TLI（肿瘤侵染淋巴细胞），能表达100倍于正常水平的TNF并应用于黑色素瘤的临床试验治疗。
另外，还有应用反转录病毒将病毒素基因导入癌细胞内，只在靶细胞内表达毒素并发挥杀伤作用，但对其他细胞毒性较低。
对于艾滋病等传染类基因疾病，有研究将HIV合成酶杂合基因转染T4细胞。
结果表明：
经修饰的带有CD4受体的细胞具有抗HIV感染的作用。
还有将编码可使艾滋病HIVRNA降解的核酶基因转染人淋巴细胞，从而抑制HIV的传播。
1.2.2多种药物的基因治疗机制本身的不断深入探讨，用于基因治疗的药物形式也不断创新。
基于三链DNA形成脱氧寡核苷酸的反基因技术能够通过阻止基因转录和DNA复制而达到治疗目的。
近年来，有治疗作用的目的基因的mRNA以用作体内，体外基因治疗的研究。
1.2.3多种途径的基因治疗早探讨不同疾病的发病机制，尝试不同基因药物，进行基因治疗的同时，有研究报告有新的治疗方法。
斯坦福大学研究组采用转座子为基因载体，在患有血友病的小鼠模型上，将来自鱼的一种编码转作酶的基因鱼宿主染色体上的凝血因子IX基因相连接，是小鼠的血液状况大大改善。
基因枪法能够介导外源基因快速进入认得靶细胞。
利用这种方法可以治疗基因治疗法的基本要求。
2，基因治疗的方法
2.1基因疫苗基因疫苗以及DNA疫苗是20世纪90年代发展起来的第3代疫苗。
其原理是将编码病原体抗原的基因分离纯化，克隆到真核细胞表达质粒载体，经皮下，肌肉注射货口服等方式进入机体，基因在体内表达相对应抗原并刺激集体免疫系统产生特异性免疫应答，从而使机体获得针对病原微生物，病毒的特异性抵抗能力，达到预防和治疗传染病的目的。
与第一代和第二代相比，第三代抗原一自然像是给机体提供保护能力，并进行了无毒的生物治疗。
2.2基因治疗及方法除了以上还有DNA疫苗是利用分子生物学技术，根据编码抗原碱基序列，设计并合成特异性引物，用RT—PCR方法从病原微生物RNA分离纯化抗原基因，在通过限制性内切酶将DNA酶克隆致真核细胞表达质粒载体。
通过特定的方法将质粒载体制备成注射制剂或口服剂。
方法：
1）化学法：
将正常基因DNA（及其拷贝）与带电荷物质和磷酸钙、DEAE－葡萄糖或与若干脂类混合，形成沉淀的DNA微细颗粒，直接倾入培养基中与细胞接触，由于钙离子有促进DNA透过细胞有作用，某些化合物可扰乱细胞膜，故可将DNA输入细胞内，并整合于受体细胞的基因组中，在适当的条件下，整合基因得以表达，细胞亦可传代。
这种方法简单，但效率极低，一般1000－100000个细胞中只有一个细胞可结合导入的外源基因。
要达到治疗目的，就需要从病人获得大量所需的受体细胞。
当然，可以通过选择培养的方法来提高转化率。
2）物理法：
包括电穿孔法和直接显微注射法。
①电穿孔法：
电穿孔法（electroporotion）是将细胞置于高压脉冲电场中，通过电击使细胞产生可逆性的穿孔，周围基质中的DNA可渗进细胞，但有时也会使细胞受到严重损伤。
②显微注射法：
显微注射（microinjection）是在显微镜直视下，向细胞核内直接注射外源基因，这种方法应是有效的。
但一次只能注射一个细胞，工作耗力费时。
此法用于生殖细胞时，有效率可达10%。
直接用于体细胞却很困难。
在动物实验中，应用这种方法将目的基因注入生殖细胞，使之表达而传代，这样的动物就称为转基因动物，目前成功使用得较多的是转基因小鼠（transgenicmice），它可作为繁殖大量后代的疾病动物模型。
③脂质体法：
脂质体（liposome）法是应用人工脂质体包装外源基因，再与靶细胞融合，或直接注入病灶组织，使之表达。
3）同源重组法：
同源重组（homologousrecombination）是将外源基因定位导入受体细胞的染色体上，在该座位因有同源序列，通过单一或双交换，新基因片段替换有缺陷的片段，达到修正缺陷基因的目的。
如在新基因片段旁组装一Neo基因，则在同源重组后，因有Neo基因，可在含有新霉素（neomycin）的培养基中生长，从而使未插入新基因片段的细胞死亡。
对于体细胞基因治疗，体外培养细胞的时间不能过长，筛选量大，故在临床上应用也受限制难以进行。
今后如能改进技术，提高重组率，这种定点修正基因的方法仍是有前景的。
4）病毒介导基因转移：
前述的化学和物理方法都是通过传染方式基因转移。
病毒介导基因转移（viralmediatedgenetransfer）是通过转换方式完成基因转移，即以病毒为载体（vector），将外源目的基因通过基因重组技术，将其组装于病毒上，让这种重组病毒去感染受体宿主细胞，这种病毒称为病毒运载体（viralvector）。
目前应用的有两种病毒介导基因转移方法。
①反转录病毒载体：
反转录病毒虽是RNA病毒，但有反转录酶，可使RNA转录为DNA，再整合到宿主细胞基因组。
反转录病毒载体有以下的优点首先是具有穿透细胞的能力，可使近100%的受体细胞被感染，转化细胞效率高；其次，它能感染广谱动物物种和细胞类型而无严格的组织特异性；再者随机整俣的病毒可长期存留，一般无害于细胞，但也存在缺点：
这种载体只能把其DNA整合到能旺盛分裂细胞的染色体，而不适合于那些不能正常分裂的细胞，如神经元。
最严重的问题是由于病毒自身含有病毒蛋白及癌基因，就有使宿主细胞感染病毒和致癌的危险性。
因此，人们有目的地将病毒基因及其癌基因除去，仅留它们的外壳蛋白，以保留其穿透细胞的功能，试图避免上述缺点。
这种改造后的病毒称为缺陷型病毒（defectivevirus）。
这样的病毒中的反转录酶可将RNA转化为DNA，有助于该DNA顺利进入宿主细胞的基因组，而该病毒则死亡。
由于病毒整合基因组是随机的，所以还是可能激活细胞的原癌基因，以及因随机插入发生插入突变。
在反转录病毒载体中，最常用于人类的是莫洛尼（Mooney）鼠白血病病毒（murineleukemiavirus;Mo-MLV），其人工构建的结构。
②DNA病毒介导载体（DNAviralmekiatedvector）：
DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳头瘤病毒、疱疹病毒等，一般认为这类病毒难于改造成缺陷型病毒。
牛乳头瘤病毒重组后，可不插入宿主染色体中引起插入突变，又可在宿主染色体外独立复制，并表达出基因产物。
有人发现，因缺少E1区而致复制缺陷的腺病毒，可在表达E1基因的细胞中繁殖。
后来证明，载有外源DNA的复制缺陷腺病毒呈现相同繁殖的特点。
1993年美法等国成功采用腺病毒载体进行心、脑、肺、肝内胆管和肌肉组织的体内基因转移。
它代表了基因治疗的新方向。
美国设计了一个新的腺病症载体，它是用一个化学连接器即赖氨酸链（lysinechain）将DNA栓在病毒外壳上，这样组成的运输器，通过一个表面抗体而进入细胞核，使宿主基因与治疗基因共同表达。
这个新病毒载体称为腺病毒多赖氨酸DNA复合体（adenovirus-polylysineDNA-complex）。
采用复制缺陷的腺病毒进行基因治疗有以下优点：
①该病毒可感染分裂和非分裂的细胞，并能得到大量基因产物，对神经细胞、心肌细胞等基因缺陷的纠正有特殊意义；
②病毒颗粒相对稳定，并易于纯化和浓缩，且感染力不降低；
③可有效转导多种靶细胞后而少游离于细胞基因组外，并持续表达；
④已用于基因治疗的Ad5属腺病毒C亚群，无致癌性。
2.3RNA干扰RNA干扰主要是利用双链RNA在mRNA水平关闭特意序列基因表达或是时期沉默的过程。
RNA干扰最早在植物中发现，被认为他是抵抗病毒感染的一种天然免疫防御机制。
当前将RNA切割成22~23个核苷酸序列，然后没有与序列结合，由于这些序列引导致特意的mRNA上，从而降解mRNA，是特异基因沉默，抑制基因表达。
3基因治疗在传染病防治中的应用
3.1DNA疫苗乙肝病毒表面抗原基因疫苗在国外已经进入I期临床试验，其结果显示：
该疫苗可在体内有效表达HBsAg，并可诱导强烈的反应，产生高校抵抗。
3.2胞内抗体在传性疾病尤其是病毒感染中德应用越来越受到人们的关注。
抗HIV结构和功能蛋白scFv基因导入HIV感染的淋巴细胞后能干扰HIV病毒转录和复制，而对细胞生长和CD4的人骨肉瘤细胞，可抵抗HIV的感染。
抗HIV逆转录酶和抗整合酶的胞内抗体课一直酶活性，减少病毒复制。
4问题与发展
基因治疗在感染性疾病的体内外实验生物治疗中均显示了疗效。
尤其是基因疫苗对机体的保护作用已得到了公认，但是正在进入临床广泛应用上有一些距离。
4.1基因编码抗原的表达问题。
基因疫苗使用时进入机体的是一段DNA片段，其作用的发挥须要DNA在细胞内有小转炉和翻译成相对应的蛋白，如何能使DNA高效率进入机体细胞并得到高效率转录和翻译。
4.2DNA疫苗目前的动物实验显示其免疫效果存在较大的个体差异。
总的来看其免疫性不高。
4.3RNA干扰目前虽然是一个热门话题，但是研究工作才起步。
4.4基因治疗的安全性进一步的研究。
4.5基因转移的副作用和抗体形成问题还没有解决。
参考文献
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