薄层色谱三种展开方式.docx

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薄层色谱三种展开方式

总的来讲平面色谱的展开有三种几何形式即线性、环形及向心，见图7-3-12。

   此外，为提高分离效率及检测灵敏度进行的展开方式的改进，设计了多种相应的展开室，现分别介绍如下。

（一）线性展开

1.上行展开

   将点样后的纸或薄层的底边置于盛有展开剂的直立型的多种规格的平底或双槽展开室中，展开剂由纸或薄层下端借毛细管作用上升至前沿。

这种展开方式适合于含粘合剂的硬板展开，是薄层色谱中最常用的展开方式。

平底及双槽展开室均有三种规格，即带不锈钢或玻璃盖的20cm×20cm，20cm×10cm及10cm×10cm三种。

见图7-3-13。

   在使用平底展开室时，可将展开室一端垫高，使展开剂集中在薄层板点有样品的一端，这样可以节省展开剂；如果薄层板需用展开剂饱和，可以将薄层板放在垫高的一端，饱和后展开时可将另一端垫高，薄层板就可以接触展开剂进行展开，见图7-3-14。

如果需要用与展开剂不同的溶剂蒸气（如挥发性酸或碱等）饱和薄层板时，可在平底展开室中放置盛有某种挥发性溶剂的小杯，效果也非常理想。

   双底展开室的优点是节省展开剂，便于预饱和以及放置展开剂于一侧槽中，另一侧槽内可放置另一种饱和蒸气用的溶剂，特别是代替在展开剂中互溶程度低，容易分层的混合展开剂。

   另一种上行展开方式是夹心式展开，由于展开室的体积大小及饱和程度影响薄层分离而设计的，见图7-3-15。

   将点样后的薄层板的两边垫以玻璃窄条，上面覆盖一块同样大小的玻璃盖板，并使其稍短于薄层板2cm，以便使展开剂浸到薄层的边缘，两片玻璃板用不锈钢夹子固定，放入展开剂中展开，这种方式不需饱和。

   小孔线形薄层技术，即将部分硅胶从薄层上除去，形成线性小孔以控制展开速度，从而增加塔板数，改善分离状况，提高呈色灵敏度。

具体作法是在距离薄层底边1cm处，用一头接水泵的玻璃吸管将硅胶一点一点地吸去，使呈一排圆形小孔或长圆形小孔（内径约2mm，孔间距离约1mm），见图7-3-16。

用此法成功地分离了高三尖杉酯碱差向异构体。

   上行展开是薄层色谱法中使用最广泛的一种展开方式，但在纸色谱法中因为需将滤纸吊起固定，或将滤纸卷成筒状才能进行，操作比较复杂，故在纸色谱法中上行法较少使用。

2.下行展开

   平面色谱法中的下行展开，多用于纸色谱法，图7-3-17为纸色谱法下行展开装置的示意图，将点样后的滤纸悬放在展开剂槽中，用粗玻棒压纸以固定，展开室底部可放饱和滤纸用的溶剂，展开剂从上而下流动，下行法中展开剂除毛细管作用外还有重力作用，因此展速比上行法相对较快。

3.双向展开

   在正方形纸或薄层上，将样品点在一角，如图7-3-18的a处，先将纸或薄层板的AB一边浸入展开剂，使它沿方向Ⅰ展开一次，取出纸或薄层板，挥去展开剂，转90°后再将纸或薄层的BC一边浸入另一种展开剂，沿方向Ⅱ作第二次展开，第一次及第二次展开时的对照品分别点在b及b'处。

这种方法常用于成分较多、性质比较接近的难分离物质的分离，如氨基酸的纸色谱常用双向展开，实际上此法是为了增加展距，调节展开剂的极性，从而提高分离能力的展开方式。

此法仅适用于定性。

4.近水平展开

   将适量展开剂倾入长方形的玻璃展开室中，见图7-3-19，将点样后的薄层板下端浸入展开剂0.5cm，薄层上端垫高使薄层与水平成5°-10°的角度，这样展开剂就由下而上进行展开。

这种展开方法适用于不含粘合剂的软板的展开。

5.水平展开

   属于水平展开的设备有下列几种

（1）CAMAG水平展开室

   样品点在高效薄层板的两边，展开剂从两边向中心展开，因而分离的样品数可以增加一倍。

展开室见图7-3-20,，此设备有20cm×10cm及10cm×10cm两种规格。

（2）CAMAGHPTLCVARIO系统

   将10cm×10cm的高效薄层板用刮板设备分割成6条，在设备的一端有6个溶剂槽，可以分别放置6种不同的展开剂；在设备的另一端有一个展开剂槽，但有6条相应于薄层的凹槽，可以设计6种不同的预平衡条件，包括不同的溶剂蒸气和相对湿度，这样可以同时选择最佳的展开剂和预平衡条件。

（3）GAMAGVARIOKSChamber

   为20cm×20cm的普通薄层设计的水平展开室，见图7-3-21，这种展开室节约展开剂，对同一块板上的几条样品带可用几种流动相同时展开，便于选择最佳展开剂；可在展开时用适当的溶剂蒸气或水蒸气对薄层进行饱和，也可进行夹心展开。

（二）环形展开

   展开剂自圆心向四周展开，U型展开室是为高效薄层环形展开专用的设备，见图7-3-22。

   这种展开方式展距短、展速快、节约展开剂、分离效率高，圆心式展开时斑点的比移值（Rfe）与线性展开的比移值（Rf）间的关系为：

（Rfc）2=Rf，因此适用于Rf值较小的组分的分离。

（三）反圆心式展开

   反圆心式展开是样品点在薄层的周围，展开剂自四周向圆心展开，展速快，可提高Rf值较大组分的检测灵敏度和定量准确性；反圆心式展开的专用反）型展开室见图7-3-23。

   用于高效薄层的展开方式的比较见表7-3-3。

表7-3-3HPTLC不同展开方式的比较（

（四）多次展开

1.单向多次展开（UMD）

   这是多次展开中最简单的一种，当一次展开后化合物得不到很好的分离时，可将展开后的薄层除去展开剂，再用相同展开剂沿同一方向进行相同距离重复展开，这种操作可以反复进行直至分离满意为止。

此法在纸色谱中曾被研究应用过。

经过几次展开，斑点的比移值（nRf）可用下式表示：

此处n为展开次数，用斑点间距离（△X）对展开次数n作图，可获得最佳间距的展开次数。

一般二次展开即可，能得到最佳的分离，但还不能使斑点十分浓集。

这种技术在薄层色谱中也得到广泛应用，Picman在硅胶板上用此法从银胶菊中分离了倍半萜内酯异构体；从苍耳中分离了苍耳素和苍耳明。

2.增量多次展开（IMD）

   此法是指在同一块薄层上，用同一种展开剂，沿同一方向，展距递增的重复展开。

增量多次展开常采取增加薄层长度的分数展开方式（如展开至1/4，1/2，3/4长度），以至最后为整个薄层长度。

增量多次展开能提供比一般薄层色谱好得多的分离度，在短时间内得到较多次展开，有利于斑点的浓集及Rf值较小的组分的分离。

在固定条件下，狭窄的斑点意味着分离效率及灵敏度的增加。

Szabady等人对他们的实验结果进行了数学论证，并将实验值与计算值进行了比较。

3.阶式展开

   阶式展开也叫分级展开，也是多次展开的一种，当样品中存在的各成分的极性相差很大时，很难用一种展开剂在同一块薄层上得到分离。

如用两种或两种以上极性不同的展开剂分别展开几次，则可以将极性相差很大的组分在一块薄层板上分离。

利用此法进行分离的例子很多，其中以朱敏在高效薄层板上分离定量元胡中11种异喹啉生物碱的例子最为成功，作者第一次用乙醚-环己烷-甲醇（5:

3:

0.5）展开，除去展开剂后，用碘蒸气薰0.5min，在波长280nm处测定四氢黄连碱、紫堇碱、延胡索乙素、毕扣扣灵及海罂粟碱等5种生物碱，扫描后将薄层放入氨气中薰10min，取出后稍挥一下表面蒸气；第二次用乙醚-环己烷-甲醇（5:

3:

0.5）展开，挥去展开剂后于波长280nm处测定原阿片碱、隐品碱及!

（别隐品碱等）种生物碱；第三次用甲苯-氯仿-甲醇-二乙胺（7:

2:

1:

0.3）展开，挥去展开剂后于350nm处测定黄连碱、小蘖碱及巴马亭3种生物碱。

图7-3-24为不同品种元胡及11种异喹啉生物碱的薄层色谱图。

   结果表明，不同种元胡中所含生物碱的种类及含量均有明显差异，从而造成质量上的差别，故所得结果对资源利用很有意义，也证明阶式展开是解决复杂多组分的一种简便有效的方法。

   Matysik等报道的用阶式梯度薄层色谱分离洋地黄提取物中的地高辛等C种洋地黄甙，

   Markowski等用两步增量梯度展开分离上述化合物。

Matysik在高效硅胶薄层板上，在水平展开室中用多次梯度展开分离了13种氨基酸的DABS（4,4N-二甲基氨基苯-4'-磺酰氯）衍生物，并与常规梯度展开进行比较，结果见图7-3-25、7-3-26，表7-3-4、7-3-5。

表7-3-4常规4步梯度展开，每步板不干燥（

表7-3-5多次梯度4步展开（MGD），每步后板干燥（

4.程序多次展开（PMD）

   Perry等在总结多种展开方式的基础上，设计了程序多次展开的方法。

此法由n次单向展开所组成，每次展开包括两个步骤。

第一步是按常法展开，当达到规定的展开时间后，停止展开，随即开始第二步干燥过程。

与普通多次展开不同，每次展开之间不用取出薄层板，仍与溶剂贮存器接触，而是通过在薄层板背部辐射加热蒸发溶剂或在板的正面通过惰性气流使之干燥，见图7-3-27及图7-3-28。

用氮气流除去溶剂是为避免一些不稳定化合物受热氧化或分解。

   PMD技术是利用在固定相上溶剂前沿界面变化提高分离度的技术。

在薄层板上斑点的宽度远比固定相的颗粒直径大，以致斑点的后缘由溶剂带动向前移动时，斑点的前沿还处于干燥状态（斑点的前沿与后缘之间的距离为斑点宽度）。

由于样品分子的平均移动速率等于Rf值乘以溶剂的展速，在斑点的前沿开始移动时，其后缘已移动了Rf值乘上斑点的起始宽度距离，因此斑点的最后宽度相当于（1-Rf）×起始宽度。

见图7-3-29。

   在常规薄层色谱中，仅在展开时出现一次斑点浓集。

如重复展开"次，则最后的斑点宽度降低到（1-Rf）n×起始宽度，但实际上没有（1-Rf）n那么明显，主要是展开时又扩散增宽，所以多次展开的优点不是在斑点的宽度上，而是增加相邻斑点的距离，并经过一个最大值后再随着继续展开而降低。

在PMD法中则在溶剂自薄层板上除去时尚能出现额外的斑点浓集，斑点浓集的程度随溶剂前沿退缩的速率及Rf值而不同，溶剂前沿退缩使斑点大致如同溶剂前进时一样再一次浓集。

对Rf值低的斑点这种浓集更有效，这意味着分离效率及灵敏度的提高。

   PMD仪器带有程序器，可将一个给定的分离程序参数送入程序器使之自动完成。

5.CAMAG自动展开室（ADC）

   这种展开室是CAMAG公司生产的程序多次展开设备，内存10个预编程序，可按需要设置，展开结束时自动停止，自动干燥薄层板，保证每次色谱展开保持相同条件，提高了色谱分离的重现性，减少人为误差及展开剂的损失。

6.CAMAG全自动多次展开系统（AMD）

   Burger在Perry等的程序多次展开的基础上设计AMD全自动多次展开系统，其特点是以微机预编程序，设计了一个展开剂极性很宽的梯度程序，展开剂极性由高到低，每一次展距都比前一次增加，每次展开前溶剂按要求混合后由泵送至展开室，展开后自动吹干，并开始下一个程序，这样不仅每次展开后斑点得到浓集，从而增加了分离容量及改善了分离效果，而且可以用给定程序在同一薄层上分离极性相差极大的组分。

AMD展开室，流程见图7-3-30。

   与柱色谱中的梯度一样，AMD梯度的溶剂也是先用强极性溶剂，然后逐步减小溶剂的极性，强极性溶剂的移动距离短，非极性溶剂移动距离加长，在10-25步展开时每步增长的距离约为3mm，总展距约为3-10cm，见图7-3-31。

   甲醇、乙腈为AMD中常用的极性溶剂，中等极性为二氯甲烷、二异丙醚或;t-丁基甲基醚。

正己烷是最常用的非极性成分。

用于AMD的溶剂必须能被真空干燥以及与系统中的溶剂成分有相似的移动特性（Kappa值）。

   当AMD展开使峰宽度浓集到只有1mm时，移动距离80mm意味着分离数可达80个。

这就使AMD可与超压流动薄层（OPLC）相当。

（五）连续展开

   这种方法是在不增加薄层板长度而使展距加长，使Rf值较小的组分移动较大的距离。

连续展开有两种。

1.Regis短床展开室（SB/CD）

   短床展开室的底部有四条凸起的埂，将薄层板以5种不同的倾斜角度放置在展开室内，这样就可以进行5种不同展距的连续展开，同时薄层板从展室的开口处伸出，当展开剂展至开口处就会自然蒸发，使达到连续展开的目的，结果获得低的Rf值及好的分离，设备见图7-3-32。

   如果没有SB/CD展开室，也可以用普通平底展开室进行连续展开，只要在展开室顶部的盖板上留一狭缝，使薄层板上部伸出狭缝，当展开剂行至薄层前沿时就会不断蒸发，见图7-3-33。

2.蒸发展开

   这是另一种类型的连续展开，在这种展开中展开剂的蒸发是在薄板的整个表面及整个展开过程中发生的，见图7-3-34。

当展开剂前缘推进到某一位置时，流入薄层的展开剂量恰好全部蒸发掉，此时处于稳定态，结果溶剂必然成负速度梯度，因此蒸发展开的分离效能比一般展开方式为高，选择性也好。

这种展开有利于Rf’值小于0.3的成分的分离。

但这种方法由于没有前沿，需要选择一种适当的参考物质同时展开并采用相对Rf值即Ri,s值来表示组分移动的情况。

（六）程序蒸气展开（VP-TLC）

   在薄层分离时为要得到重现的Rf值以及避免“边缘效应”的产生，通常要在用展开剂蒸气饱和的展开槽中进行，为此Stahl设计了S-展开室。

但Dezeeuw在对薄层分离的展开机理的研究中，总结了水蒸气和溶剂蒸气对展开的影响，认为在不饱和的展开室中用多元展开剂可以改良分离，这是由于在吸附剂上出现了吸附蒸气的浓度梯度之故。

改善的程度由溶剂组分的极性和蒸发速度及所用吸附剂的特性而定。

在探讨了各种类型的展开室（饱和、不饱和和夹心展开室）中溶剂蒸气作用的基础上，设计了一种程序蒸气箱（VP-箱），见图7-3-35。

采用VP箱时，薄层板是水平放置的，展开室横割成许多小槽，槽中分别注入各种溶剂，展开时将薄层面对这些小槽，薄层既不能接触槽壁以免斑点扩散，又不能距离槽壁过大而减弱溶剂蒸气的作用。

每一小槽中的蒸气仅对其所面对的薄层产生影响，这样就能按设计的要求，在薄层上造成蒸气程序，此蒸气程序可使欲分离的物质斑点在某薄层区域内加速前进，而在另一区域内减速展开。

VP-箱的出现使一些不能互溶的溶剂也能组成一个溶剂系统而在展开过程中对分离发挥作用。

例如在分离靛酚、苏丹红、甲基黄及4-硝基苯胺混合物时用苯为展开剂，4种染料的Rf值较低并且不能完全分离，见图7-3-36A。

   改用苯-氯仿（8:

2）为展开剂，Rf值增高，但分离不能改善，见图7-3-36B。

然而当用以苯为展开剂的VP-箱和有一简单的苯-氯仿蒸气梯度时，可以大大改善分离，见图7-3-36C，D，而且能够在VP-箱中按照需要使板面上的任一部位以任何速度对斑点的移动作加速或减速，从而控制色谱分离过程。

不论所研究物质的极性如何，也不论溶剂及所用蒸气组成的极性如何，都能设法获得高度改善的分离，因此有利于同系物、异构体和基本结构相同的各种衍生物的分离。

这种技术对药物化学和毒理学中的许多衍生物的分离极为有用。

例如激素类、磺胺类、安眠药类、生物碱类、农药、止痛药、镇痛药、麻醉药及精神病药以及对毒理学和生物化学的极为重要的代谢产物的分析。

其次，程序蒸气薄层在制备色谱中也十分有用，在常规制备薄层中经常因物质点样过多而发生相互重叠，用本技术能使区带完全分开。

（七）分离-反应-分离展开（SRS法）

   Stahl介绍的分离-反应-分离展开，也是一种双向展开技术，与一般双向展开法不同的是在两个方向展开时使用同一种展开剂，将样品点在正方形薄层板一角，展开一次后将薄层板用加热、光照或用酸、碱蒸气等方法处理后，将薄层板转90°，于垂直于第一次展开的方向用相同展开剂再展开第二次，显色后凡在对角线上的成分都是性质稳定的成分，而不在对角线上的成分是经处理后新产生的成分，因此SRS法也可称为反应薄层法，Stahl首先用此技术成功地研究了除虫菊酯的失活性。

用己烷-乙酸乙酯（75:

25）进行双向展开，第一向展开后样品经日光或紫外光照射后再加热，薄层上出现了除虫菊酯的氧化产物，见图7-3-37。

（八）超压薄层色谱法（OPLC）

   上述的各种薄层展开技术多是由毛细管作用使展开剂通过薄层上的吸附剂进行组分的分离。

1979年由Tyihak提出的超压薄层色谱法是应用加压室（PUM室）的平面液相色谱技术。

1980-1983年Tyihak等对有关理论及分析条件等的一系列研究，使这一分析技术有了进一步发展，1988年陈执中对此法进行了全面的介绍。

1.用于超压薄层的仪器

（1）超微型加压室（PUM室）

   圆形的PUM室（纵截面），见图7-3-38。

吸附层6涂布于玻璃板或塑料板7上，吸附板上面完全盖覆一塑料膜9，由于交界空间内部的气体压力使膜与上支架金属板8紧贴，固定于其表面上，并用O形密闭环5封闭，因此，空间作为气体压力缓冲室。

气体入口3，压力表1及开剂进口10。

安装在上支架金属板上的入口2用于在加压下样品的导入，上下支架金属板的直径分别为230nm及235nm。

吸附层面积为10cm×10cm或20cm×20cm不等，上下支架金属板用几个夹子4固定。

（2）超压薄层色谱仪

   Chrompres25超压薄层色谱仪，包括主机和两个泵，溶剂传送泵2，连接展开剂进口阀，可连续供展开剂至加压的薄层表面。

水泵1只用两次：

在开始前以提高室内压力，完全展开后以撤空加压室，图7-3-39为加压室打开时的情况，图中上铸件1和下铸件3用不锈钢榫入锁孔6中使其钩扣在一起。

如放开锁扣，可同时对上铸件顶部边上的锁杆施加压力。

拉动两个柄5，可将上盖升起或放下。

   高效薄层板置于2的位置，由在上铸件的薄膜覆盖的缓冲室4加压。

在主机锁定并已加压的情况下，溶剂从展开剂孔7进入展开剂槽8中。

2.分析技术

（1）薄层板的浸渍

   要求薄层板的边必须用聚合物液体（惰性塑料分散体、石蜡）封闭以免展开剂从薄层板的边缘溢出。

（2）展开方式

   可进行单向、双向及连续展开。

（3）分离技术

   用Chrompres25超压薄层色谱仪将已点样的高效薄层板置于控制温度的高压膜平面加压下由阀系统引入展开剂至薄层板，展开剂的移动可由仪器上的有机玻璃上盖观察，展毕，停止展开剂泵，减去压力，取出薄板。

（4）定量测定

   用薄层扫描仪进行测定。

    OPLC法分离时间短，展速较一般薄层色谱快5-10倍，分离效率高，斑点集中，灵敏度高，重现性好，可进行一种展开剂展开或多步梯度展开，可进行分析或半制备分离，节约展开剂，各步可离线、离线/在线或完全离线操作。

   本法最大的优点是展距与时间呈线性关系，见图7-3-40，分离效率（N值）随展距的加长而提高，见图7-3-41，这两个特点是一般薄层色谱甚至高效薄层色谱所不具备的。

例如采用高效薄层板以正丁醇-乙酸-水（4:

1:

1）为展开剂，展距9.3cm经250min仍不能将21种氨基酸完全分开，并且斑点扩散，但用OPLC技术，膜外压为12atm,，展开剂流速10ml/h，展距16cm，只需47min，上述氨基酸可以得到分离。

    Gulyas等应用超压薄层与扫描技术对拟交感神经胺剂如麻黄素以及士的宁、咖啡因、苯丙胺等兴奋剂进行了成功的分离检测，检出量为0.5-1.0μg，变异系数（RSD）为5%，方法快速，分离效率高，具有薄层及高效液相色谱的共同优点。

   Fater等在硅胶60F254铝片上，在Chrompres25OPLC仪上，进行双向展开，分离16种巴比妥衍生物。

Dugo等用两种展开剂：

丁酸乙酯-己烷（80:

20）及氯仿-丁酸乙酯-己烷（9:

1:

15）在硅胶60F254HPTLC薄层上分离柑橘类水果中含氧杂环化合物的OPLC分析。

Kovacs等在硅胶HPTLC薄层上用正己烷-正丁醇-三乙胺（83:

9.5:

7.5）500μl及正己烷-正丁醇（8:

2）800μl进行多步梯度展开分离了9种生物胺。

Ferenciz-Fodor等用此法进行多次展开分离甾体中的杂质。

Katay等用TLC、普通OPLC及新型的个人超压薄层色谱仪对生物活性物质抗坏血精及1'-甲基抗坏血精的分离效果进行了比较，其扫描图谱见图7-3-42。

可见其分离效果大大优于普通的薄层色谱法。

此法应用于各类药物、培养液中抗菌素、体液中的药物分析报道极多，在食品分析、工业分析和环保等领域中也得到应用。

（九）旋转薄层

   早在30年代就有人把离心力用于分离以减少破坏，这对沸点高、分子量大的化合物有利。

60年代Dalcortivo等人用加速离心纸色谱分离碱性毒物，得到满意的结果。

旋转薄层又称离心薄层，是在薄层、离心纸色谱及柱色谱等基础上发展起来的一种离心型连续洗脱的环形薄层色谱分离技术，由于仪器结构简单、操作方便、分离效果好等优点，已广泛应用于合成和天然产物的制备分离。

   旋转薄层的分离原理除根据样品在固定相和流动相之间的吸附、分配作用的不同外，再加上离心加速度的作用，使试样中各组分之间原有的Rf值差异加大，从而提高了分离效果，加快了分离速度。

   旋转薄层色谱仪有两种类型，一种是美国Harrison的7924型Chromatotron仪及北京青云仪器厂生产的LBC-1型离心薄层色谱仪；另一种是日本日立公司生产的CLC型离心液相色谱制备仪。

前一类型的仪器见图7-3-43。

   旋转薄层常用硅胶为吸附剂，加入一定量的煅石膏或羧甲基纤维素钠为粘合剂制成厚度为1-4mm的层，也可以在硅胶内加入硝酸银或酸、碱等制成络合薄层或pH薄层，经活化后使用。

这种薄层上样量可从数毫克至数克，点样及洗脱均靠泵输送，点样量根据薄层厚度而定，一般为每1mm厚度上样0.5-2ml。

薄层上适用的展开剂，在离心薄层中也基本适用。

分离有色物质时检出比较方便，在分离有紫外吸收的化合物时，要用紫外灯检测，因此在薄层上要用石英玻璃罩，所用溶剂如丙酮、甲醇、乙酸乙酯等均需无紫外吸收，要防止酸、碱对泵的腐蚀，故一般采用中性的单一或多元展开剂。

   本法已应用于合成产物、天然产物、同系物及异构体的分离制备，如间、对甲氧基苯甲醛的分离，炔诺酮肟顺反异构体的分离及芫花酯甲、乙、丙及其他未知物的分离制备等。