窖泥检测原理和方法.docx
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窖泥检测原理和方法
窖泥检测原理和方法
窖泥取样
窖泥是浓香型大曲酒生产过程中的重要条件之一,它对酒中微量香味成分的形成及其量
比关系起着重要的作用。
窖泥质量的好坏直接影响浓香型大曲酒产品的质量。
取回的泥样(包括人工培窖的黄泥、发酵泥、复壮泥)因水分大,不宜长期贮存,应立即平摊在瓷盘、木板,或光洁地面上,层厚约2cm,风干3~5昼夜,间隔翻拌,使之均匀风
干。
在半干时,将大块土捣碎,以免完全干后成硬块,不易粉碎。
泥样风干后,用四分法分取约250g,研磨成粉,并通过60目筛,保存在磨口瓶中。
氨态氮在风干过程中易变化,需用新鲜的泥样测定,同时测定水分,以换算为绝干样的
含量。
一、水分含量的测定(常压干燥法)
1•原理
窖泥中水分一般可分为三类,即化合结合水,吸湿水,和自由水。
本法在105-110C烘
干法,在此温度下自由水和吸湿水都能烘干,实际上在此温度下所失去的是挥发性物质的总
量。
2•仪器
电热鼓风干燥箱(烘箱);称量皿(可用滤纸包代替);电子天平。
3•方法
(1)风干土样水分测定:
取风干土样4—5g,平铺于已烘干至恒重的称量皿中。
在105—110C烘箱内烘6h后,取出、加盖,在干燥器中冷却30min后称重,再于100—105C烘1h,冷却、称重,直至恒重(两次质量差小于0.002g)。
(2)新鲜土样水分测定称取土样10—15g。
测定方法同
(1)。
4•计算
水分(%)mm1100%
mm0
w一水分和挥发物含量,%;
m——烘干前空皿与试样质量之和,g.
mi烘干后空皿与试样质量之和,g.
、pH的测定
1.原理
因酿酒微生物生长繁殖过程中的生化变化和代谢产物受害泥pH的影响较大,故在人工
培容过程中,必须测定土壤的pH。
窖泥经水提取后,用pH计测定。
2.仪器和试剂
(1)酸度计:
测定范围pH0—14,最小分度为0.02pH
(2)pH标准缓冲溶液。
3.测定步骤
按仪器说明书校正PH计,并注意校正和测量时温度一致。
将电极和小烧杯用蒸馏水冲洗干净,再塌样品冲洗6—8次,将电极插入盛有样品的小
烧杯中,测量样品的PH。
称取风干、粉碎后的土样5.0g,于100mL烧杯中加水50mL,间歇搅拌30min,放置
30min,用pH计测定试样pH。
三、氨态氮的测定
1.原理
奈氏试剂与氨反映生成浅黄色至红棕色的络合物。
氨态氮浓度低时,溶液成黄色,可在
400-425nm测定吸光度。
氨态氮浓度高时,溶液成红色,可在450-500nm测定吸光度。
测得
的吸光度与标准比较即可求得氨态氮的浓度。
当氨态氮高于1mg/L时,产生红褐色沉淀,
则不能比色。
本法测得的氨态氮是游离氨和铵离子含氮的总量,因为铵盐在碱性溶液中将转
变为能与奈氏试剂反应的氨。
溶液中氨越多,则生成黄色越深。
溶液中某些杂质(Ca、Mg
等离子)的存在,能与奈氏试剂形成沉淀,使溶液浑浊干扰氨的测定。
为避免此有害作用,故在待测液中加入酒石酸钾钠,可与Ca、Mg作用生成不解离的化合物,就可避免与奈氏试
剂的相互作用。
2.试剂
(1)奈氏试剂:
称取10g碘化汞、7g碘化钾,溶解后加到50mL360g/LNaoH溶液中,摇匀,稀释至100mL,摇匀,静置,取上层清液使用。
贮存于棕色具胶塞瓶中,可保存1年。
(2)酒石酸钠钾溶液:
50g酒石酸钠钾溶于100mL水中,为驱除酒石酸钠钾中可能存在的铵盐,煮沸蒸发约1/3体积,冷却后再稀释至100mL。
(3)氯化铵标准液:
准确称取0.3819gNH4CI,溶于水并定容至100mL。
其浓度以N计为1mg/mL
(4)氯化铵标准使用液:
吸取氯化铵标准液10mL用水稀释定容至1L。
浓度以N计为10ug/mL,以NH3计为12.2ug/mL。
其余:
100g/L的氯化钠溶液;比色管;纳氏试剂;分光光度计。
3.测定步骤
(1)试样制备称取新鲜泥样1—5g(准确至O.OIg),加入100g/L的氯化钠溶液,
使体积为25mL,搅匀,浸出10min(必要时把硬块捣碎),用于滤纸过滤后备用。
吸取1mL
滤液(必要时用水稀释后再吸取)于50mL比色管中,用水稀释至刻度。
加人1—2滴酒石酸
钠钾溶液和1mL纳氏试剂,充分混匀。
放置10min后以标准系列中"0”管为空白,于波长
425nm处测吸光度。
(2)标准系列配制吸取标准使用液(10ug/mL的氮)0mL、0.5mL、1.0mL、2.0mL、
4.0mL、6.0mL、8.0mL、10.0mL分别置入50mL比色管中,用水稀释至刻度后,按试样相同显色、测吸光度。
以吸光度对氨态氮(N)微克数绘制标准曲线。
或用目测法进行比较。
4.计算
氨态氮(绝干计,mg/100g)=c*25*n*(1/m)*(1/1000)*100*[1/(1-w)]
式中
c试样溶液中氨态氮质量,ug;
25――泥样稀释体积,mL;
n――试样再稀释倍数,若不再稀释,则n=1;
m――新鲜泥样质量,g
1000把ug换算成mg的系数,
w——新鲜泥样水分,%。
四、有效磷测定
1.原理
测定窖泥中有效磷时,采用酸性氟化铵浸提,提出的磷酸或磷酸盐,在酸性溶液中加入
酸性钼酸铵,生成黄色磷钼酸盐,再和还原剂氯化亚锡作用生成蓝色的络合物,比色测定。
2.试剂
(1)氟化铵一盐酸溶液:
称取0.56g氟化铵溶于400mL水中,加人12.5mL1mol/LHCl溶液,用水稀释至500mL,贮于塑料瓶中。
(2)酸性钼酸铵溶液:
称取5g钼酸铵溶于42mL水中;在另一烧杯中注人8mL水和
82mL浓盐酸。
然后在搅拌下把钥酸铵溶液倒入烧杯中,贮于棕色瓶中。
(3)氯化亚锡溶液:
称取1g氯化亚锡(SnCl2•2H20)溶于40mL1mol/LHCl溶液中,
贮于棕色瓶中。
(4)无磷滤纸:
将直径为9cm的定性滤纸浸于0.2mol/LHcl溶液中4—5h,使磷、砷等化合物溶出,取出后用水冲洗数次,再用0.2mol/LHCl淋洗数次。
最后用水洗至无酸件,
在60C烘箱中干燥。
(5)磷标谁液:
准确称取于110C干燥2h后冷却的磷酸二氢钾(KH2PO4)0.2195g,溶于水,并定容至1L。
此溶液含磷为50ug/mL。
(6)磷标准使用液:
准确吸取磷标准溶液25mL于250mL容量瓶中,用水稀释至刻度,其浓度为5ug/mL。
3.测定步骤
(1)试样处理称取2.00g风干土样于50mL烧杯中,加入氯化铵-盐酸溶液至20mL浸泡30min,每隔5min搅拌1次。
然后用烘干的无磷滤纸过滤,加入约0.1g硼酸,摇匀,使之溶解后备用。
(2)磷的测定吸取1mL试样浸出液,注入25mL容量瓶中,用水稀释至刻度。
吸取此稀释液1—2.5mL(视磷含量多少而异,一般黄泥含磷少,可直接取浸出滤液测定。
窖皮
泥磷含量较高,吸取稀释液2.5mL测定。
老窖泥含磷量多,吸取1mL稀释液即可),于25mL比色管中,加入2mL酸性铜酸铰溶液和3滴氯化亚锡溶液,用水稀释至刻度。
放置15min
后,用2cm比色皿在680nm波长处,以标准系列中"0”管为空白测定吸光度。
(3)标准系列制备吸取磷标准使用液0mL0.5mL、1.0mL2.0mL、3.0mL、5.0mL,
分别注入25mL比色管中。
加入2mL酸性相酸铰溶液和3滴氯化亚锡溶液显色,用水稀释至刻度。
同上条件测定吸光度,以吸光度为纵坐标,标准液的磷微克数为横坐标,绘制标难
曲线。
4.计算
有效磷含量(mg/100mg)=m1*(1/v)*25*20*(1/m)*(1/1000)*100*[1/(1-w)]
式中
m1
一试样溶液中有效磷质量,
v
—吸取稀释试样的体积,
mL
25-
-―稀释试样总体积,
mL
20-
试样浸取液体积,
mL
m—
-风干泥试样质量,g
w一风干试样水分,%。
五、有效钾
1.原理
然后用灼烧法除去铵盐。
再在微酸性溶液
测定有效钾时用碳酸铵将试样中的钙镁沉淀,
中用亚硝酸钴钠沉淀钾。
生成的亚硝酸钴钾钠的黄色沉淀在酸性溶液中,用过量的高锰酸钾
分解,剩余的高锰酸钾加过量草酸钠除去。
多余的草酸钠在用高锰酸钾回滴。
由高锰酸钾与亚硝酸钴钾钠反应的实际消耗量计算试样中的钾含量。
2•试剂
1碳酸铵溶液:
称取28.5g碳酸铵溶于水,稀释至1L。
2O.OImol/L硝酸溶液:
取6.7mL浓硝酸用水稀释至1L。
再稀释10倍为0.01mol/L。
3200g/L亚硝酸钴钠溶液:
称取10g亚硝酸钴钠,溶于50mL水中,临用时配制。
4O.OImol/L硼酸溶液:
称取0.6g硼酸溶于水,稀释至1L。
3.测定步骤
1试样处理:
准确称取2.500g风干土样于250mL具塞三角瓶中,加入100mL碳酸铵溶液,浸出1h,其间每15min摇动1次。
然后用1号烧结玻璃滤器上铺滤纸片抽气过滤,
用100mL钼酸铵溶液分3—4次洗涤。
过滤速度不宜太快,以使土壤胶体吸附的钾全部置换出来,将浸出液定量移人蒸发皿内,在水浴上蒸于。
残渣加3—5mL硝酸再蒸干,并反复操
作3次,至有机物去净。
蒸干后,在低于500C的条件下灼烧去除氨,冷却至室温。
2钾的沉淀:
在灼烧去除氨的试样蒸发皿中,准确加入25mL0.1mol/L硝酸溶液,用带
橡皮头的玻璃棒洗皿壁,使残留物溶解并混合均匀。
迅速用干滤纸过滤于50mL三角瓶中,
吸取10mL滤液于200mL烧杯中,边搅拌边徐徐加入10mL亚硝酸钻钠溶液,盖好表面皿,
在20C放置过夜,使沉淀完全。
用2号烧结玻璃滤器上铺定量滤纸片(事先烘干至恒重),抽气过滤,将0.01mol/L硼酸将杯中沉淀全部移人滤器。
再用0.01mol/L硝酸洗沉淀10次•每次1mL。
接着用95%的乙醇洗5次,每次2mL。
擦干滤器外避,在110C烘1h,置干燥器中冷却后称重。
4.计算
沉淀组成为K2NaCo(Na3)6•H2O,其中K2O=17.216%
X=m1*0.17216*(1/10)*25*(1/m)*1000*100*[1/(1-w)]
式中
x—绝干试样中有效钾含量(以K20计),mg/100g;
ml—亚硝酸钴钠钾沉淀质量,g;
m一风干试样质量,g;
10一一测定时吸取浸出液体积
25一一浸出液总体积,mL;
1000—一换算成mg的系数;
w试样水分,%。
六、钙的测定
1.原理
样品经灰化后,在酸性溶液中,钙与草酸生成草酸钙,经硫酸溶解后,用高锰酸钾标准
溶液滴定,从而计算出钙的含量。
反应如下:
CaCI2(NH4LC2O4CaC2O42NH4CI
CaC?
04H2SO4CaS04H2C2O4
KMnO45H2O3H2SO4K2SO42MnSO4IOCO28H2O
2.试剂
(1)1:
1盐酸溶液;
(2)0.1%甲基红指示剂;
(3)1:
4乙酸溶液;
(4)1:
4氢氧化铵溶液;
(5)2N硫酸溶液;
(6)4%草酸铵溶液;
(7)1N高锰酸钾标准溶液。
3.测定方法
(1)样品处理:
准确称取均匀样品2.00~4.00g,置于坩埚中,在电炉上小火炭化无烟,移入550~600。
C高温炉中灰化,直至灰分呈白色为止(必要时,可在加入浓硝酸润湿后再
灰化,有促进样品灰化至白色的作用)。
取出出,待冷却后加入6N盐酸溶液20ml,加热溶
解灰分,然后用水称入100ml容量瓶中,辊入至刻度,摇匀。
(2)样品分析:
准确吸取样品溶液5ml,移入15ml离心管中,加入甲基红指示剂1滴、
4%草酸铵溶液2ml、1:
4乙酸溶液0.5ml,振荡均匀。
用1:
4氢氧化铵溶液将溶液调至微黄色,再用1:
4乙酸溶液调至微红色,放置1小时,使沉淀完全析出。
离心15分钟,小心
倾去上层清液,在沉淀中加入2ml2N硫酸摇匀,置于70~80。
C热水浴中,用1N高锰酸钾标准溶液进行滴定至淡红色不褪色为止。
4.计算
NV20100
钙(mg%)=
W互
100
式中N——高锰酸钾标准溶液的当量浓度;
V――滴定所消耗高锰酸钾标准溶液的量;
20――1N高锰酸钾标准溶液1ml相当于钙的量;
说明
用高锰酸钾滴定时要不断振荡使溶液均匀。
这方法比较精确,但需要离心沉淀。
七、腐殖质的测定
1.原理
在硫酸存在下,用已知过量的重铬酸钾溶液与窖泥共热,使其中的活性有机质的碳被氧
化。
而剩余的重铬酸钾,以邻菲罗林亚铁为指示剂,用硫酸亚铁铵溶液滴定,从所消耗的重
铬酸钾量来计算有机碳的含量。
2.仪器与试剂
(1)油浴:
加热用油为固体石蜡或植物油。
(2)插试管用的铁丝笼。
(3)0.2mol/L硫酸亚铁铵标准溶液(即莫氏盐溶液):
称取80g(NH4)2So4?
FeSO4?
6H20,溶于水中,加入30mL6mol/L的硫酸,用水稀释至1000mL。
标定:
吸取硫酸亚铁铵溶液10mL,于250mL三角瓶中,加50mL水和10mL6mol/L
硫酸。
用O.lmol/L高锰酸钾(1/5KMnO4)标准溶液滴定至粉红色。
cM
c
10
c――硫酸亚铁铵标堆溶液浓度,mol/L;
C1高锰酸钾(1/5KMno4)标准溶液浓度,mol/L;
v1消耗高锰酸钾标准溶液体积,mL。
(4)重铬酸钾-硫酸溶液:
取200g研细的重铬酸钾,溶于250mL水中,必要时加热使完全溶解。
冷后稀释至500mL,全部移人1L烧杯中。
缓缓加入浓硫酸500ML,冷后加水稀释至1000mL。
(5)5g/L邻菲咯啉指示剂:
称取0.5g硫酸亚铁(FeSO4?
7H2O)溶于100mL水中,加2滴浓硫酸和0.5g邻菲咯啉,摇匀,该溶液现配现用。
3.测定步骤
称取风干土样0.1—0.3g(准确至0.001g),放入18mmx160mm硬质试管中,准确加入重铬酸钾一硫酸溶液10mL,将试管插人预先加热至185—190C的油浴中(用铁丝笼固定试
管)。
此时温度下降到170—180C,调节热源,保持此温度。
当试管内容物被面开始滚动或有较大气泡发生时,开始计时,沸腾5min。
取出冷却后把试管内容物全部转移人250mL三
角瓶,用水洗净试管,洗液并入三角瓶内,总体积为50—一60mL。
摘入2—3滴邻菲咯啉指
示剂,用0.2mol/L硫酸亚铁铵标准溶液滴定,颜色由橙红变绿,最后呈从紫色为终点。
同时做空白试验。
4.计算
11
x(V0V)c0.0031.7241.1100%
m1w
x——干土中腐殖质含量,%;
V0――空白试验消耗硫酸亚铁铵标准溶液体积,mL;
v―-测定试样消耗硫酸亚铁铵标准溶液体积,mL;
c—―硫酸亚铁铵标准溶液浓度,mol/L;
0.003—一消耗1mL1mol/L硫酸亚铁铁标;准溶液相当于碳的克数;
1.1――氧化校正系数;
1.724――土壤中有机质含;碳58%,将有机碳换算成有机质的系数(100/58=1.724);
m一—风干土试样质量;
w一—风干土水分,%。
八、细菌总数测定
仪器显微镜血球计数板。
震荡器。
其它稀释取量仪器和盛装仪器
[方法和步骤]
1.总菌计数法
(1)计数样品:
称窖泥1g于盛有99mL无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的三角瓶中。
(2)摇匀;振荡10〜20min,使土样中的菌体、芽孢或孢子均匀分散。
(3)稀释:
将待测茵液作一定比例的稀释。
(通常为1:
100或1:
1000严格按无菌操作)
(4)检查计数板:
在正式计数前先用显微镜检查计数板的计数室,看其是否沾有杂质或干涸着的曲体,若有污物则需作以下几步清洗:
1)擦洗:
用药棉蘸取95%酒精轻轻擦洗计数扳的计数室。
2)冲洗:
用蒸馏水冲洗计数板,并用毛边纸吸干其上的水分(注意:
切勿用火焰来烤干);最后用擦镜纸揩干净。
3)镜检:
镜检清洗后的计数板,直至计数室无污物时才可用于样品的计数。
(5)加样:
先将盖玻片安放在计数室上面,然后用接种环取一环均匀的菌体悬液,使它沿着盖玻片和计数板间的缝隙渗入计数室。
连续二至三次,直至充满计数室平台为止:
(6)计数:
持加好样品的计数板只于显微镜,然后按下列步骤寻找计数室并计数之
1)找计数室:
先在低倍镜下寻找计数极上的大方格然后顺大方格移动计数板,使计数室
位于视野中间。
2)转换高倍镜:
转高倍镜后,适当调令光壳度,使菌休和计数室线条均清晰为止,然后将计数室一角的中格移至视野中。
3)计数通常以计五个中格(做5个板求平均减少误差)的数值来代表计数室中的含菌量。
将凡要计数的中格中的菌休逐一计数。
计数时为了避重复或遗漏常将分布在方格线上的菌体
一律以接触方格底线和右侧线上的茵作为计入本格内的茵数。
同时对于出芽的菌体常以芽体
和母体同等大小时才按两个茵体计数,以减少人为计数误差。
将计得的菌体数一一记录。
(7)清洗:
计数完毕后,计数板先用95%酒精轻轻擦洗,再用蒸馏水淋洗,然后吸干。
[计算]
按所用计数板规格16*25型或25*16型有所不同。
菌数/mL=X*16(或25)*10000*稀释倍数(X为5个中室的平均数)
再按制得的样品总量而求得总菌数
总数=菌数/mL*样品量(mL)
九、芽孢杆菌数测定
1.原理
根据芽孢可在广泛的温度(即热抗性)、pH、渗透压下生长特点,对窖泥中芽孢进行分
离和检测的。
首先通过升温(80—100C)热处理(10〜30min)来除去非检测菌。
这种处
理几乎破坏了所有的细菌和营养体而芽孢得以存活,而芽孢可以在适宜的培养基中萌芽并生长。
2.仪器与试剂
(1)
传统的微生物检测方法需在培养基中把单个菌培养成可见菌落,然后经长时间培养和鉴
目前乳品厂对芽孢杆菌的检测是根据芽孢可在广泛的温度(即热抗性)、pH、渗透压下生
长特点,对乳和乳制品中芽孢进行分离和检测的。
首先通过升温(80-100~C)热处理(10〜
30lnin)来除去非检测菌。
这种处理几乎破坏了所有的细菌和营养体而芽孢得以存活。
通过这
种方式激活的芽孢再在适宜的培养基中萌芽并生长。
传统上这种培养基加淀粉以吸收抑制物
(乳中大多芽孢杆菌(86%)能水解淀粉,从而促进激活的芽孢萌芽。
培养基再在30C培养3d
或37C2d计嗜温菌数,55C2-3d计嗜热菌数。
这种传统方法操做繁琐,时间长72h,并需对操作人员进行严格的训练。
检测结果存
在滞后性,已难适应工化生产。