丙谷二肽小试及中试研究总结0709.docx
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丙谷二肽小试及中试研究总结0709
丙谷二肽项目小试及中试研究总结
20160709
我们以N-苄氧羰基-L-丙氨酸钠作为起始物料，在DCC和HOSU的作用下与谷氨酰胺缩合制得N-苄氧羰基-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（IV），中间体（IV）经乙醇重结晶后在Pd/C的催化作用下，与氢气作用制得丙谷二肽（I）粗品，最后经甲醇水精制得丙谷二肽原料。
反应路线如下：
我们于2016年01月到2016年5月相继完成了完成了路线打通以及工艺优化方面的研究，之后进行了三批（G0720160326,G0720160419,G0720160422））小试工艺确认，实验结果表明，氢解粗品各项检测指标合格、工艺稳定。
以G0720160422批为代表，工艺描述如下：
步骤1）：
N-苄氧羰基-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（IV）的合成
物料名称
分子量
摩尔比
用量
苄氧羰基-L-丙氨酸
223.23
1.0
50g
N-羟基丁二酰亚胺（HOSU）
115.09
1.1
28.36g
二环己基碳二亚胺（DCC）
206.33
1.1
50.84g
L-谷氨酰胺（Gln）
146.14
1.1
36.0g
1,4-二氧六环
__
__
300+50ml
1.4N氢氧化钠
40
2.2
176+176ml
3mol/L盐酸
36.5
__
约200ml
纯化水
__
__
约600ml
95%乙醇
__
__
约120ml
向1L三口瓶中加入300ml1,4-二氧六环（水分0.1%）、50.0g（0.22mol）苄氧羰基-L-丙氨酸、28.36g（0.25mol）N-羟基丁二酰亚胺，室温下搅拌溶解，在15~25°C下向酯化罐中滴加二环己基碳二亚胺的1,4-二氧六环的溶液（50ml1,4-二氧六环加入至溶解罐中溶解二环己基碳二亚胺50.84g），滴加过程放热，控制温度不超过25°C滴加完毕，在20±3°C下继续反应4小时。
过滤固体，少量二氧六环淋洗滤饼。
配制1.4mol/L氢氧化钠溶液352ml（即向19.7g氢氧化钠中加入纯化水180ml，搅拌均匀并冷却至15°C以下），将36.0gL-谷氨酰胺加入至上述配制的176ml氢氧化钠溶液中，搅拌溶解澄清，然后将二氧六环反应液滴加至上述L-谷氨酰胺溶液中，滴加过程放热但升温不剧烈，控制温度不超过20±3°C，缩合过程中逐滴补加1.4mol/L氢氧化钠溶液，保持反应液体系PH在8~9，滴加活化酯完毕继续在20±3°C反应1小时，析出少量固体，经过滤除去固体，滤液减压蒸馏（压强-0.1MPa，温度45°C）浓缩至体积约至780ml。
向浓缩液加入纯化水160ml温室搅拌，用3mol/L的盐酸调节PH=3，析出大量白色固体，室温下搅拌0.5h，盐酸（总用量约200ml），过滤固体，用少量纯化水洗涤滤饼，得中间体湿粉181.6g，含量约35%，产率约82.3%。
向1L三口瓶中加入无水乙醇105ml，加入中间体湿粉170g（含量：
35%），加热至回流，体系澄清，然后缓慢降至室温，析出大量固体，进一步降温至0~10°C下保温搅拌1h，过滤固体，无水乙醇20ml（温度0~5°C）淋洗滤饼，得白色固体湿品，经60°C干燥过夜得白色固体56.1g，含量76.5%，纯品收率约55.6%。
（HPLC纯度>95%）
步骤2）：
N-
（2）-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（I）的合成
物料名称
分子量
摩尔比
用量
苄氧羰基-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
351.35
1
50.0g
3%钯/碳催化剂
—
—
8.0g
H2
2.02
—
—
活性炭
—
—
3.4g
纯化水
—
—
200ml
甲醇
32.04
__
600+250ml
取苄氧羰基-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺精制品50.0g，加入1L反应瓶中，加入200ml水，600ml甲醇，抽真空，置换氢气3次，常压反应约2~3小时，反应过程有白色固体析出，HPLC监控反应原料剩余小于0.1%时停止通氢气，加140ml纯化水搅拌使析出固体完全溶解，抽滤回收催化剂，滤液减压浓缩（压强-0.08MPa，温度45°C），浓缩反应液至二肽含量为250~300mg/ml时，向滤液中加入活性炭3.4g，室温下搅拌0.5h，过滤除去活性炭，将滤液加热至40℃，向滤液中滴加水当开始有固体析出时，养晶30min，然后加入剩余甲醇（总体积为250ml），滴加完毕，40°C继续搅拌1h，然后冷却至室温，过滤固体，75°C真空干燥5小时，得丙谷二肽粗粉约18.6g，HPLC纯度99.72%，收率约85.7%。
为了进一步证明工艺的稳定性和各项工艺参数的合理性，按相应放大规模调整参数后进行中试放大，于2016年05月到2016年6月完成了连续生产3批（Y321605004，Y321605005，Y321605006）中试研究，并对中试三批反应进行全程跟踪监测。
以Y321605004批为例代表，工艺描述如下：
步骤1）：
N-苄氧羰基-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（IV）的合成
物料名称
分子量
摩尔比
用量
苄氧羰基-L-丙氨酸
223.23
1.0
100±0.5kg
N-羟基丁二酰亚胺（HOSU）
115.09
1.1
57±0.5kg
二环己基碳二亚胺（DCC）
206.33
1.1
102±0.5kg
L-谷氨酰胺（Gln）
146.14
1.1
72±0.5kg
1,4-二氧六环
__
__
（600+100+100）L
氢氧化钠
40
2.2
40±1kg
3mol/L盐酸
36.5
__
约300L
纯化水
__
__
约1000L
95%乙醇
__
__
约2500L
向2000L的酯化罐中加入600±10L1,4-二氧六环（水分0.1%）、100±0.5kg（44.8mol）苄氧羰基-L-丙氨酸、57±0.5kg（49.5mol）N-羟基丁二酰亚胺，搅拌溶解将料液降至15°C以下，在15~25°C下向酯化罐中滴加二环己基碳二亚胺的1,4-二氧六环的溶液（100±10L1,4-二氧六环加入至溶解罐中溶解二环己基碳二亚胺102±0.5kg），滴加过程放热，控制温度不超过25°C滴加完毕，在20±2°C下继续反应4小时。
将料液经过离心过滤后压转移至周转罐，50L*2二氧六环淋洗滤饼，将二氧六环溶液转移至高位槽中待用。
配制1.4mol/L氢氧化钠溶液700L（即向40±1kg氢氧化钠中加入纯化水700±10L，中搅拌均匀并冷却至15°C以下），取上述配制的氢氧化钠溶液350L和72±0.5kgL-谷氨酰胺加入至1000L缩合罐，搅拌溶解澄清，然后将二氧六环反应液滴加至上述L-谷氨酰胺溶液中，滴加过程放热但升温不剧烈，控制温度不超过20±2°C，缩合过程中逐滴补加1.4mol/L氢氧化钠溶液，保持反应液体系PH在8~9，滴加活化酯完毕继续在20±2°C反应1小时，析出少量固体，经过滤除去固体，滤液减压蒸馏（压强-0.1MPa，温度45°C）浓缩至体积约至600~650L。
将浓缩液加入至结晶罐中，加入纯化水260±20L温室搅拌，用3mol/L的盐酸调节PH，当出晶时停止加酸（此时PH约=6）养晶半小时，再调PH至3，析出大量白色固体，保持15°C下搅拌1h，盐酸（总用量约300L），甩滤固体，用100L*2次纯化水洗涤滤饼，得中间体湿粉约261.2kg，含量：
48~50%，收率约80%。
向结晶罐中加入95%乙醇780L，加入中间体湿粉261.2kg（含量：
48.99%），加热至回流，体系澄清，保温搅拌10min，然后缓慢降至室温，析出大量固体，进一步降温至5~10°C下保温搅拌1h，过滤固体，95%乙醇（温度5~10°C）淋洗滤饼100L*2次，得白色固体湿品134.18kg，纯品收率约42.5%。
（HPLC纯度>98%，含量50~53%。
）
步骤2）：
N-
（2）-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（I）的合成
物料名称
分子量
摩尔比
用量
苄氧羰基-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺
351.35
1
80kg
3%钯/碳催化剂
—
—
12.8kg
H2
2.02
—
—
活性炭
—
—
4.5kg
纯化水
—
—
320+240L+80L
甲醇
32.04
__
960L+360L
取苄氧羰基-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺精制品80kg（折干失后），加入到配料罐中，加入320L水，960L甲醇，室温下搅拌均匀，将料液压入氢解罐内，然后向氢解罐加入3%的钯/碳催化剂12.8kg，用氮气置换空气三次，氢气置换氮气三次，加压至0.1MPa反应约2~3小时，反应过程有白色固体析出，HPLC监控反应原料剩余小于0.1%时停止通氢气，加约240L纯化水搅拌使析出固体完全溶解，抽滤回收催化剂，80L纯化水冲洗钯碳，滤液减压浓缩（压强-0.08MPa，温度45°C），浓缩反应液至二肽含量为250~300mg/ml时，向滤液中加入活性炭4.5kg，室温下搅拌0.5h，过滤除去活性炭，30L纯化水洗涤活性炭。
将滤液升温至40°C，向澄清液中逐渐滴加甲醇，当溶液开始变浑浊时停止滴加甲醇，养晶20~30min，然后继续滴加甲醇（甲醇用量总体积约为二肽质量9倍），滴加完毕，40°C继续搅拌1h，然后冷却至室温，过滤固体，75°C真空干燥5小时，得丙谷二肽粗粉约40kg，HPLC纯度>99%，收率约80~90%。
我们对中试三批反应进行全程跟踪监测：
中间体活化结果详见中间体活化反应检测数据汇总，如表1所示中试三批，活化反应率为93~96%左右，与小试水平相近，稳定性良好；Y391605007批中间体活化率略低，原因可能为体系中水分偏高所致；
中间体缩合反应过程监测详见中间体缩合反应检测数据汇总，如表2所示缩合工艺稳定性良好，中试三批缩合转化率约80%，与小试缩合转化率相当；中试Y391605007批结果表明，CBZ-丙（10.18g/l）的残留较高，可能原因为1）反应体系水分偏高，活化率降低；2）碱的加入速度较快使部分活化酯水解。
中间体的精制结果详见中间体精制数据汇总，如表3所示，中试放大后用95%工业乙醇替代了无水乙醇，对产品质量无不良影响；由于设备受限，将溶剂的使用量由中间体湿重的0.5倍提高至3倍，所得中间体精制品质量合格，能够满足氢解反应的要求，但是与小试相比收率降低较明显。
氢解反应结果详见氢解反应数据汇总，如表4所示氢解反应转化率偏低，原因可能为中间体为湿品，含量测定偏差较大所致；此外氢解反应收率在80±5%与小试收率相当。
综上，我们于2016年05月到2016年6月完成了丙谷二肽工艺由小试向生产的转化，并将小试三批和中试三批的实验结果进行汇总，如表5所示，在小试向中试放大的转化过程中，受重结晶条件的限制收率有所降低，但产品质量优良（详见附件1~3），工艺稳定、重现性高，能够满足生产放大的需求。
表1.中间体活化反应数据汇总
中间体批号
CBZ-L-丙氨酸
HOSU
DCC
投料至溶解澄清后体系水分
反应3h体系水分
反应3小时CBZ-L-丙氨酸残留
反应3.5h、CBZ-L-丙氨酸残留
反应4h
CBZ-L-丙氨酸残留
活化酯体积
活化率
Y391605005
100kg
57kg
102kg
0.11%
0.12%
7.04g/l
9.3g/l
6.93g/l
750L
94.81%
Y391605006
100kg
57kg
102kg
0.13%
0.12%
8.11g/l
7.47g/l
5.77g/l
750L
95.68%
Y391605007
100kg
57kg
102kg
0.51%
0.62%
9.32g/l
8.16g/l
7.83g/l
840L
93.42%
表2.中间体缩合反应数据汇总
批号
L-谷氨酰胺
补1.4M氢氧化钠
活化酯体积
浓缩前中间体含量
浓缩前体积
浓缩前转化率
浓缩后中间体含量
浓缩后体积
调酸补加HCl
浓缩后转化率
粗品湿粉
含量
收
率
杂质情况
中间体母液
Y391605005
72kg
310L
750L
90.69g/L
约1400L
80.89%
150.63g/L
850L
230L
81.55%
261.1kg
48.99%
81.5%
L-Gln：
0%；HOSU：
0.3%,
三肽：
0.27%；水解：
0%
CBZ-丙-丙：
0.10%；
CBZ-丙：
0.98%；
HOSU：
37.16g/l
中间体：
7.81g/l
CBZ-丙：
7.40g/l
Y391605006
72kg
300L
750L
88.24g/L
约1430L
80.38%
153.1g/L
850L
310L
82.89%
209.3kg
49.3%
65.7%
L-Glu：
0.015%；
HOSU：
1.22%;三肽：
0%；水解：
0.14%，
CBZ-丙-丙0.88%；
CBZ-丙：
1.44%；DCU：
0.19%
HOSU：
26.56g/l
中间体：
3.31g/l
CBZ-丙：
6.80g/l
Y391605007
72kg
260L
840L
86.59g/L
约1450L
80%
186.92g/L
820L
330L
73.82%
280.1kg
48.5%
86.53%
L-Glu：
0.001%；HOSU：
0.59%;三肽：
0%；水解：
0%
CBZ-丙-丙：
0.17%；
CBZ-丙：
1.37%；DCU：
0；
CBZ-丙-丙-CBZ：
0.40%
HOSU：
41.97g/l
中间体：
7.35g/l
CBZ-丙：
10.18g/l
表3.中间体精制数据汇总
批号
工艺过程
有关物质
纯度%
含量%
收率%
Y391605005
中间体湿品加入3倍量95%乙醇加热下溶清，冷却下析晶，甩滤得中间体纯品。
L-Gln：
0%；HOSU：
0.4%,三肽：
0%；水解：
0.14%
CBZ-丙-丙：
0.11%；CBZ-丙：
0.86%；DCU：
0.04%
97.82
48.99
52.1%
Y391605006
中间体湿品加入3倍量95%乙醇加热下溶清，冷却下析晶，甩滤得中间体纯品。
L-Gln：
0%；HOSU：
0.89%;三肽：
0%；水解：
0.19%
CBZ-丙-丙0.14%；CBZ-丙：
1.36%；DCU：
0.12%；
CBZ-丙-丙-CBZ：
0.05%
96.46
49.3
52.1%
Y391605007
中间体湿品加入3倍量95%乙醇加热下溶清，冷却下析晶，甩滤得中间体纯品。
L-谷：
0%；HOSU：
0.37%;三肽：
0%；水解：
0.15%
CBZ-丙-丙0.13%；CBZ-丙：
1.21%；DCU：
0.12；
CBZ-丙-丙-CBZ：
0.17%
96.82
48.5
52.1%
表4.氢解反应数据汇总
丙谷二肽批号
中间体来源
投料量
干失
折干湿
折干湿后总重量
含量
折含量
折含量后总重量
料液转化率
浓缩后转化率
湿品重量
干失
%
收率
HPLC/含量
母液
Y321605004
Y391605005
Y391605006
中试一批
133.74kg
45.75%
72.55kg
80kg
51.99%
69.53kg
76.72kg
75.56%
87.9%
53.44kg
24.8%
84.8%
HPLC：
99.46%
含量：
100.83%
未单杂：
0.08%
未总杂：
0.29%
4.4g/L，580L
二肽：
2.55kg
13.8kg
46.1%
7.45kg
52.1%
7.19kg
Y321605005
Y391605006
Y391605007
中试二批
131.4kg
46.1%
70.9kg
80kg
52.1%
68.46kg
76.91kg
69.3%
84.8%
52kg
20.93%
86.5%
HPLC：
99.66%
含量：
100.70%
未单杂：
0.034%
未总杂：
0.17%
7.63g/L，810L
二肽：
6.18kg
16.8kg
45.85%
9.1kg
50.3%
8.45kg
Y321605006
Y391605007
Y391605003
中试三批
79.2kg
45.85%
42.8kg
80kg
50.3%
39.8kg
75.2kg
90%
79.5%
54.12kg
35.14%
75.5%
HPLC：
99.66%
含量：
100.70%
未单杂：
0.034%
未总杂：
0.17%
5.75g/L，726L
二肽：
4.17kg
表5小试至中试转化工艺研究数据汇总表
终产品批号
试制日期
试制地点
目的/用途
批量（g/kg）
总收率（%）
工艺
样品质量
纯度（%）
含量（%）
性状
G0*******26
2016.03.25
2016.03.26
实验室
小试，确认工艺
17.5g
50.7%
与小试工艺描述一致
99.83%
98.6%
白色结晶粉末
G0*******19
2016.04.16-
2016.04.19
实验室
小试，确认工艺
5.7g
49.8%
与小试工艺描述一致
99.55%
98.5%
白色结晶粉末
G0*******22
2016.04.20-
2016.04.22
实验室
小试，确认工艺
18.6g
46.9%
与小试工艺描述一致
99.67%
100.3%
白色结晶粉末
Y321605005
2016.05.17-
2016.05.29
生产车间
中试放大
40.2kg
36.0%
与中试工艺描述一致
99.74%
99.8%
白色结晶粉末
Y321605006
2016.05.19-
2016.05.30
生产车间
中试放大
41.1kg
29.8%
与中试工艺描述一致
99.75%
100.3%
白色结晶粉末
Y321605007
2016.05.21-
2016.06.01
生产车间
中试放大
35.0kg
33.7%
与中试工艺描述一致
99.71%
100.9%
白色结晶粉末
.
附件1.中试一批（Y321605004）产品检测报告
名称
丙氨酰谷氨酰胺
批号
Y321605004
检查项目
接受标准
检验结果
性状
外观
白色或类白色结晶或结晶性粉末；无味，无臭
白色结晶性粉末
鉴别
HPLC
供试品溶液主峰保留时间与对照品溶液主峰保留时间应一致
供试品溶液主峰保留时间与对照品溶液主峰保留时间一致
检查
酸度
5.0~6.0
5.56
氯化物
不得过0.02%
符合规定
有关物质（%）
环-（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）
不得过0.2%
0.002
环-（L-丙氨酰-L-谷氨酸）
不得过0.04%
未检出
L-焦谷氨酰-L-丙氨酸
不得过0.15%
未检出
L-焦谷氨酸
不得过0.05%
未检出
D-丙氨酰-L-谷氨酰胺
不得过0.05%
0.013
L-丙氨酰-L-谷氨酸
不得过0.5%
0.076
其他未知单杂
不得过0.1%
0.086
其他未知总杂
不得过0.5%
0.169
干燥失重
减失重量不得过0.5%
0.22
炽灼残渣
不得过0.1%
0.03
重金属
不得过百万分之十
符合规定
含量测定
按干燥品计算，含C8H15N3O4不得少于98.5%
99.8
附件2.中试二批（Y321605005）产品检测报告
名称
丙氨酰谷氨酰胺
批号
Y321605005
检查项目
接受标准
检验结果
性状
外观
白色或类白色结晶或结晶性粉末；无味，无臭
白色结晶性粉末
鉴别
HPLC
供试品溶液主峰保留时间与对照品溶液主峰保留时间应一致
供试品溶液主峰保留时间与对照品溶液主峰保留时间一致
检查
酸度
5.0~6.0
5.59
氯化物
不得过0.02%
符合规定
有关物质（%）
环-（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）
不得过0.2%
0.002
环-（L-丙氨酰-L-谷氨酸）
不得过0.04%
未检出
L-焦谷氨酰-L-丙氨酸
不得过0.15%
未检出
L-焦谷氨酸
不得过0.05%
未检出
D-丙氨酰-L-谷氨酰胺
不得过0.05%
0.005
L-丙氨酰-L-谷氨酸
不得过0.5%
0.087
其他未知单杂
不得过0.1%
0.066
其他未知总杂
不得过0.5%
0.152
干燥失重
减失重量不得过0.5%
0.13
炽灼残渣
不得过0.1%
0.03
重金属
不得过百万分之十
符合规定
含量测定
按干燥品计算，含C8H15N3O4不得少于98.5%
100.3
附件3中试三批（Y321605006）产品检测报告
名称
丙氨酰谷氨酰胺
批号
Y321605006
检查项目
接受标准
检验结果
性状
外观
白色或类白色结晶或结晶性粉末；无味，无臭
白色结晶性粉末
鉴别
HPLC
供试品溶液主峰保留时间与对照品溶液主峰保留时间应一致
供试品溶液主峰保留时间与对照品溶液主峰保留时间一致
检查
酸度
5.0~6.0
5.59
氯化物
不得过0.02%
符合规定
有关物质（%）
环-（L-丙氨酰-L-谷氨酰胺）
不得过0.2%
0.003
环-（L-丙氨酰-L-谷氨酸）
不得过0.04%
未检出
L-焦谷氨酰-L-丙氨酸
不得过0.15%
未检出
L-焦谷氨酸
不得过0.05%
未检出
D-丙氨酰-L-谷氨酰胺
不得过0.05%
0.006
L-丙氨酰-L-谷氨酸
不得过0.5%
0.120
其他未知单杂
不得过0.1%
0.089
其他未知总杂
不得过0.5%
0.161
干燥失重
减失重量不得过0.5%
0.15
炽灼残渣
不得过0.1%
0.03
重金属
不得过百万分之十
符合规定
含量测定
按干燥品计算，含C8H15N3O4不得少于98.5%
100.9
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