1生物样本中蛋白质的提取及测定分子医学实验.docx
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1生物样本中蛋白质的提取及测定分子医学实验
《分子生物学实验》
实验报告
实验名称：
生物样本中蛋白质的提取及测定
姓名：
杰
学号：
3140104666
组别：
同组同学：
唐曦
带教教师：
伟俞萍
实验日期：
2015年9月15日
1.原理：
1.1生物样本中蛋白质的提取
离体不久的组织，在适宜的温度及pH等条件下，可以进行一定程度的物质代。
因此，在生物化学实验中，常利用离体组织来研究各种物质代的途径与酶系作用，也可以从组织中提取各种代物质或酶进行研究。
但生物组织离体过久，其所含物质的含量和生物活性都将发生变化。
例如，组织中的某些酶在久置后会发生变性而失活；有些组织成分如糖原、ATP等，甚至在动物死亡数分钟至十几分钟，其含量即有明显的降低。
因此，利用离体组织作代研究或作为提取材料时，都必须迅速将它取出，并尽快地进行提取或测定。
一般采用断头法处死动物，放出血液，立即取出实验所需的脏器或组织，除去外层的脂肪及结缔组织后，用冰冷的生理盐水洗去血液（必要时可用冰冷的生理盐水灌注脏器以洗去血液），再用滤纸吸干，即可用于实验。
取出的脏器或组织，可根据不同的方法制成不同的组织样品。
包括组织糜、组织匀浆、组织浸出液。
由于动物肝脏细胞比较脆弱，易于破碎，故本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料，采用匀浆法法将其破碎，然后加入样品提取液使蛋白质溶解，用高速离心法弃去细胞碎片。
收集上清液后可进行蛋白质定量分析。
1.2生物样本中蛋白质的测定
1.2.1Lowry法
1921年，Folin发明了Folin-酚试剂法测定蛋白质的浓度，反应原理是利用蛋白质分子中的酪氨酸和色氨酸残基还原酚试剂（磷钨酸-磷泪酸）生成蓝色化合物；1951年Lowry对上述方法进行了改进，让蛋白质先与碱性铜试剂进行反应，然后再与酚试剂反应，改进后的方法可以使反应的灵敏度提高。
蛋白质中的肽键在碱性溶液中能与铜离子结合形成复杂的紫色或紫红色络合物（类似双缩脲反应）。
由于蛋白质中芳香族氨基酸残基（酪氨酸）的存在，该络合物在碱性条件下进而与Folin-酚试剂形成蓝色复合物。
上述呈色反应的颜色深浅在一定围与蛋白质含量成正比。
通过与已知含量的标准蛋白质的生色结果进行比较分析，即可检测待测样品的蛋白质含量。
目前实验室常规的快速定量测定蛋白质含量方法中，以Lowry等人发展的Folin-酣法应用最为普遍。
该方法的优点是:
灵敏度高（比紫外吸收法灵敏度高10〜20倍），操作简单快速，不需
复杂的仪器设备。
1.2.2考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由掠黑色变为蓝色。
经研究认为，染料主要是与蛋白质中的械性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在一定围，考马斯亮蓝G250-蛋白质复合物呈青色，在595nm下，吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质含量的测定。
1.2.3紫外吸收法
蛋白质中普遍含有酪氨酸与色氨酸，由于这两种芳香族氨基酸分子中含有大pi键，它们在280nm紫外光附近有光吸收，因而使蛋白质在上述紫外光波长附近产生较强的光吸收，利用蛋白质的这一特性可对其进行含量测定。
2.操作步骤
2.1生物样本中蛋白质的提取
1.用颈椎脱白法处死小鼠，切开腹腔，取下完整肝脏，小心去掉胆囊（不要弄破），放入盛冷生理盐水的烧杯中漂洗干净。
2.取小鼠肝整个肝组织，在称量纸上剪碎，放入玻璃勾装管中。
3.按1:
15的比例往玻璃勾紫管中加入勾装缓冲液（即每份样品需加预冷的提取缓冲液6mL，蛋白酶抑制剂0.16mL），手动匀浆。
注意用力均勾，以免损坏匀浆管。
4.匀浆完成后，取一支2mLeppendorf管，各加入1.8mL勾衆液后，置入冷冻离心中。
5.5.于4℃,13000r/min离心20min后，小心取出上清液0.5ml至2mLeppendorf管中，加入0.5ml缓冲液，用于蛋白质含量的测定，再取出上清液0.5ml至另一2mLeppendorf管中-20℃保存。
2.2生物样本中蛋白质的测定
2.2.1Lowry法
1.取16mmxl50mm试管16支，标号，放置在试管架上，在1〜6号试管分别加入标准牛血清白蛋白（使用时取贮液用双蒸水稀释至0.5mg/ML）0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5mL，用双蒸水补足至每管总体积0.5mL，在7、8号试管分别加入待测样品25、50uL，并用双蒸水补足至0.5mL（即将待测样品稀释20或10倍）。
9〜16管作为平行实验管重复1〜8管的操作并同时进行实验，取算术平均值作为检测结果。
2.各管加入2.5mL新配制的碱性铜溶液，立即摇匀，在室温下放置10min。
3.各管加入0.5mLFolin–酚试剂应用液，边加入边立即充分混合（用振荡混合器），然后在室温下放置30〜60min（不要超过60min）。
4.分别用1号和9号管作为空白对照调零，检测其余标准样品管及待测样品管在550nm波长处的吸光度值。
5.根据已知含量的标准样品测得的吸光度作标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。
根据稀释倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含量。
2.2.2考马斯亮蓝法
1.取16mmx150mm试管16支，标号，放置在试管架上，在1〜6号试管分别加入标准牛血清白蛋白（使用时取e液用双蒸水稀释至0.5mg/mL）0、0.02、0.04、0.06、0.08、0.1mL，用双蒸水补足至每管总体积0.1mL，在7.8号试管分别加入稀释20、10倍的待测样品0.1mL。
9〜16管作为平行实验管重复1〜8管的操作并同时进行实验，取算术平均值作为检测结果。
2.每管加入考马斯亮蓝G—250染料试剂3mL，摇勾，室温静置3min
3.分别用1号和9号管作为空白对照调零，检测其余标准样品管及待测样品管在595nm处的吸光度值。
4.根据已知含量的标准样品测得的吸光度作标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。
根据稀释倍数计算出小鼠肝脏提取液的蛋白质含量。
2.2.3紫外吸收法
1.取16mmx150mm试管16支，标号，放置在试管架上，在1〜6号试管分别加入标准牛血清白蛋白（2mg/mL）0、0.3、0.45、0.6、0.75、0.9mL，用双蒸水补足至每管总体积3mL，在7,8号试管分别加入稀释100,50倍的待测样品3mL。
9〜16管作为平行实验管重复1〜8管的操作并同时进行实验，取算术平均值作为检测结果。
2.分别以1号管和9号管作为空白对照调零，用紫外分光光度计（注意用石英比色杯）于波长280nm处比色，记录各管的吸光度值。
3.根据已知含量的标准样品测得的吸光度作标准曲线，然后根据待测样品的吸光度在标准曲线上查出其蛋白质含量。
根据稀释倍数计算小鼠肝提取液的蛋白质含量。
3、实验结果
3.1原始数据
3.1.1Lowry法
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
牛血清蛋白浓度（mg/mL）
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
一号组吸光度值
0
0.182
0.304
0.400
0.454
0.484
0.323
0.519
二号组吸光度值
0
0.169
0.303
0.392
0.443
0.495
0.342
0.517
算术平均值
0
0.1755
0.3035
0.396
0.4485
0.4895
0.3325
0.518
3.1.2考马斯亮蓝法
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
牛血清蛋白浓度（mg/mL）
0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
一号组吸光度值
0
0.143
0.262
0.353
0.419
0.570
0.409
0.739
二号组吸光度值
0
0.155
0.284
0.367
0.522
0.579
0.412
0.780
算术平均值
0
0.149
0.273
0.360
0.4705
0.5745
0.4105
0.7595
3.1.3紫外吸收法
序号
1
2
3
4
5
6
7
8
牛血清蛋白浓度（mg/mL）
0
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
一号组吸光度值
0
0.133
0.197
0.256
0.324
0.380
0.229
0.405
二号组吸光度值
0
0.116
0.197
0.255
0.316
0.384
0.200
0.408
算术平均值
0
0.1245
0.197
0.2555
0.320
0.382
0.2145
0.4065
3.2数据处理
3.2.1Lowry法
将y=0.3325代入拟合出的直线：
y=0.95971x+0.06224中可得浓度为0.28mg/mL，原样品中蛋白质浓度为5.6mg/mL，则原来的浓度为11.2mg/mL。
将y=0.518代入拟合出的直线：
y=0.95971x+0.06224中可得浓度为0.48mg/mL，则原样品中蛋白质浓度为4.8mg/mL，则原来的浓度为9.6mg/mL。
取平均值为10.4mg/mL。
3.2.2考马斯亮蓝法
将y=0.4105代入拟合出的直线：
y=1.12114x+0.02421中可得浓度为0.34mg/mL，则样品中蛋白质浓度为6.8mg/mL，则原来的浓度为13.6mg/mL。
将y=0.7595代入拟合出的直线：
y=1.12114x+0.02421中可得浓度为0.66mg/mL，则样品中蛋白质浓度为6.6mg/mL，则原来的浓度为13.2mg/mL。
取平均值为13.4mg/mL。
3.2.3紫外吸收法
将y=0.2145代入拟合出的直线：
y=0.63886x+0.00021中可得浓度为0.34mg/mL，则样品中蛋白质浓度为6.8mg/mL，则原来的浓度为13.6mg/mL。
将y=0.4065代入拟合出的直线：
y=0.63886x+0.00021中可得浓度为0.64mg/mL，则样品中蛋白质浓度为6.4mg/mL，则原来的浓度为12.8mg/mL。
取平均值为13.2mg/mL。
4.讨论：
根据三种方法得出蛋白质的浓度约为13.3mg/mL（没有算第一种方法得出的结果，因为方法一中的R-square值只有0.9169），从后两种方法的回归线中可以看出还是很符合实验规律的。
根据实验经历和实验结果，我更喜欢第二种方法。
我们在选择方法的时候主要考虑：
①实验对测定所要求的灵敏度和精确度；②蛋白质的性质；③溶液中存在的干扰物质；④测定所要花费的时间。
其中Lowry灵敏度高，不需要复杂仪器，但反应需要的时间较长，操作的用时也有比较高的要求，同时容易受到非蛋白质的影响，例如含有EDTA，甘氨酸等物质的蛋白就不适合这种方法。
之所以第一组数据尤其不准，我想与我们组的操作水平不无关系，因为Folin-酚试剂只有在酸性条件下稳定，但还原反应只在碱性条件下发生，所以加入的时候要立即混匀，可能这个没有做好，另外就是实验室里分光光度计调整用了好久。
再就是考马斯亮蓝法，灵敏度高，测定简便，只要加一种试剂，而且染料的颜色可以在较长时间保持稳定。
我们组做实验的时候是先一起做完Lowry法和考马斯亮蓝法之后去测定的，而调整分光光度计用时了很久，所以这种方法即时过了一段时间，测出来的数据也还很准，不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
并且该法干扰物质很少，像K+,Na+，Mg+离子，EDTA等等的都不干扰。
使用过考马斯亮蓝染液的比色杯比较难清洗，可以用乙醇脱色后再用清水清洗，注意少量多次。
最后是紫外吸收法，相对于前两种方法最大的优势就是速度很快，操作很简单，也不需要消耗样品，测定后能回收使用。
如果要测定来源比较珍贵的，不容易获取的蛋白质浓度可以考虑这种方法。
不过也有很多缺点，例如准确度较差、如果样品中有嘌呤、嘧啶及核酸等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰，同时敏感度也比较低，对蛋白的浓度要求较高。
注意测试时必须使用石英比色杯。
同时有几点要注意的就是抓小鼠时千万小心别被咬伤和抓伤，抓取小鼠时注意不要被抓伤或咬伤。
手握尾巴1/3处，脊椎脱臼时快速准确以减轻小鼠的痛苦。
剪开腹腔取出肝脏后，我们组漂洗得不够充分，血液有些残留，导致用玻璃匀浆器研磨后的匀浆的颜色偏红。
虽然经过离心后，颜色变为微黄透明，对后续吸光度的测定影响不大。
但是由于血细胞的残留，可能导致血细胞也被研磨破碎，其中的蛋白质进入溶液，使整体蛋白质浓度升高。
总结实验，还有我们做的比较好的就是，在及时用冰保持在4℃条件下匀浆，我们组还注意到手持匀浆管的时候避免了体温的影响，抓住匀浆管上部进行操作的。
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