质粒构建流程.docx

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质粒构建流程

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质粒构建流程

一、引物设计

1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI

2）软件分析目的基因可用酶切位点。

使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用没切位点。

3）选择载体。

根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。

如pcDNA3.1（+），

4）选择酶切位点。

对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。

载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。

5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子全部碱基。

6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。

一般选择三个保护碱基。

7）引物设计完成，送公司合成。

二、目的片段获取

1.RNA提取

试剂盒：

Bioteke高纯总RNA快速提取试剂盒离心柱型（裂解液RL4℃、漂洗液RW-20℃保存）

准备：

冰盒、4℃预冷离心机、EP管2套、吸附柱RA一套

操作步骤：

1）将1000μl裂解液RL加入细胞中，混合5min。

2）加200μl氯仿混合，震荡15s，室温孵育3min。

3）4℃，12000rpm离心10min。

4）最上层水相转移至新EP管中（体积约550μl）

5）加入1倍体积（550μl）70%乙醇，混匀

6）全部转移到套收集管的吸附柱RA中，4℃，10000rpm离心45s

7）弃废液，重套收集管，加500μl去蛋白液RE，12000rpm离心45s

8）弃废液，重套收集管，加700μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s

9）弃废液，重套收集管，加500μl去漂洗液RW，12000rpm离心60s

10）弃废液，重套收集管，12000rpm空离2min

11）吸附柱放入新EP管，加50μlRNasefreewater于膜上，室温放置2min

12）4℃，12000rpm离心60s

13）点样：

5μlRNA+1μl10×buffer，1.5%琼脂糖凝胶电泳，100V，3min，可见3条亮带。

14）-20℃保存

2.RNA反转录

试剂盒：

TaKaRaprimescriptRTreagentkitwithgDNAeraser（-20℃保存）

准备：

冰盒，

取出解冻，

为酶不可取出，预冷离心管

操作步骤：

1）基因组DNA去除（10μl体系）

5×gDNAeraserbuffer2μl

gDNAeraser1μl

TotalRNA4μl（可根据RNA浓度调整）

RNasefreewater3μl

PCR仪中进行，程序：

42℃，2min→4℃

注：

RNA的量可根据浓度调整，混合液冰上配制，酶最后加入

2）反转录反应（20μl体系）

5×primerScriptbuffer24μl

primerScriptRTenzymemix

1μl

试剂盒：

Microelutecycle-purespinprotocol（OMEGAbio-tek）D6293-01

将PCR产物加入1.5mlEP管，加入5倍体积bufferCP，混匀。

转移至HiBindMicroElutionDNA柱（套收集管），室温离心10000g，1min。

弃废液，加700μlDNAwashbuffer（含乙醇）到柱子，室温离心10000g，1min。

弃废液，重复

弃废液，空管离心13000g，1min

柱子放入新EP管，加10-20μlElutionbuffer到膜上，室温孵育3-5min，离心10000g，1min

电泳检测

1）割胶回收（产物电泳结果含杂带）

将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5mlEP管。

加等体积（1g=1ml）bindingbuffer（XP2）,60℃金属浴7min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min

溶液加入离心柱，离心10000g，1min，废液倒回再离一次

弃废液，加300μlbindingbuffer（XP2），离心10000g，1min

弃废液，加700μlSPWwashingbuffer，离心10000g，1min

重复

空管离心13000g，2min，弃废液，柱子转移到新EP管

加入30-50μlelutionbuffer于膜上，室温孵育1min，离心13000g，1min

电泳检测

三、双酶切

Vector12μl

10×M/L/Kbuffer3μl

3dH2O13μl

酶A1μl

酶B1μl

30μl反应体系如下：

PCR纯化产物15μl

10×M/L/Kbuffer3μl

3dH2O10μl

酶A1μl

酶B1μl

反应条件：

takara酶30℃水浴1h→65℃金属浴10min终止反应

注：

buffer类别依使用的酶具体选择，见附表

四、连接

1）双酶切后，可将质粒酶切产物琼脂糖电泳1-2μl

2）酶切产物液相纯化

3）

PCR产物6.3μl

pcDNA3.10.7μl

10×T4buffer2μl

T4ligase1μl

3dH2O10μl

20μl连接体系（皆可）

PCR产物5μl

pcDNA3.12μl

10×T4buffer2μl

T4ligase1μl

3dH2O10μl

PCR仪中进行：

22℃，30min→4℃冰箱过夜

注：

连接产物-20℃可长期保存

五、转化

准备：

碎冰，灭菌EP管、LB空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴锅加热42℃

1）将感受态细胞置于冰上，待其融化

2）超净工作台中，将连接产物10μl加入100μl感受态细胞，或质粒1-3μl加入100μl感受态细胞

3）轻混匀，冰浴30min

4）热击水浴42℃，45s，冰浴1min

5）加900μlLB空培养基，摇菌150rpm，37℃，1h

6）浓缩离心13000rpm，1min，上清液留约200μl重悬菌体，部分涂板（50-100μl）

7）完全吸收后，37℃倒置培养12-16h

六、菌落PCR

1）以rTaq酶50μl体系配制PCR反应液，每个PCR管分装15μl，体系如下：

3dH2O35.7μl

10×buffer5μl

MgCl23μl

dNTP4μl

rTaq0.3μl

R-primer1μl

F-primer1μl

2）灭菌牙签挑单菌落放入PCR体系中搅一下，再在新板划板（注意编号），每板挑10个菌。

新划的板37℃倒置培养12-16h。

3）琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，记录含目的条带的菌落号备用。

七、测序

1.摇菌

1）PCR检测有目的条带的菌落，挑选2-3个较好的以供摇菌

2）三角瓶中分装10mlLB抗性液体培养基

3）用10μl枪头挑起选择的菌落打到培养基中

4）37℃。

250rpm摇菌12-16h

2.送样

每瓶取1ml箘液，送华大基因测序

3.比对

将测序结果与基因序列进行比对，比对正确则构建成功，比对错误则重新构建。

（注：

数据库中基因序列可能有误，若出现少数突变，可换其他数据库比对试试）

八、菌种保存

菌种比对成功，则可保存菌种备用。

1）超净工作台中取1.5mlEP管，加200μl80%灭菌甘油。

2）再加入800μl箘液，轻混匀。

3）液氮冻存。

（一个基因冻2管即可）

九、质粒提取

菌种比对成功，冻存菌种后，箘液用于提取质粒。

试剂盒：

AXYGENaxyprepplasmidminiprepkit250-prep

操作步骤：

1）取3-5ml箘液，室温下离心10000g，1min

2）弃上清，加250μlsolution

/RNaseA重悬菌落，混匀

3）加250μlsolution

，倒置轻混匀，孵育2min。

（整个裂解反应不超过5min）

4）加入250μlsolution

，立即倒置混匀，直到生成白色絮状沉淀。

5）室温离心13000g，10min

6）上清液小心转入HiBindminiprepcolumn（有套管），室温离心10000g，1min

7）弃废液，加500μlbufferHB，室温离心10000g，1min

8）选择性步骤：

重复第7步

9）弃废液，空管室温离心13000g，2min

10）柱子转入新EP管，加30-50μlelutionbuffer或3dH2O到膜上，室温孵育1-2min

11）室温离心13000g，1min

12）提取的质粒-20℃保存备用

附：

感受态制备方法（皆采用LB空白培养基）：

1.菌种活化

1）用接种环直接取冻存的E.coli/DH5α菌种，在LB平板上划线，37℃倒置培养16h

2）挑单菌落转到2-10mlLB液体培养基中，摇菌37℃，250rpm，12-16h

3）取1ml箘液加入到100mlLB液体培养基，摇菌37℃，250rpm，3h

4）检测箘液OD600≤0.5（0.3-0.4）

2.感受态制备

准备：

0.1MCaCl2灭菌，50ml离心管灭菌，冰水，1.5ml离心管冰上预冷，离心机4℃预冷。

步骤：

1）将箘液用50ml离心管分装，调平，4℃离心3000rpm，8min

2）弃上清，0.1MCaCl210ml重悬（冰水中进行，动作轻），两管合成一管

3）冰上放置一段时间，4℃离心2500rpm，8min

4）弃上清，0.1MCaCl210ml重悬，4℃冰箱过夜沉淀

5）上清液取出8ml，剩2ml，加670μl80%甘油（箘液：

80%甘油=3:

1），轻混匀

6）1.5mlEP管分装，每管分装100μl，液氮冻存。

试剂配制：

1.琼脂糖凝胶（1.2%）

琼脂糖粉0.6g

1×TAE50ml

微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1μlgoldview核酸染料，混匀，倒板

2.电泳缓冲液TAE（50×）

2mol/Ltris-碱242g

1mol/L冰醋酸57.1ml

EDTA（pH8.0）18.622g

二蒸水至1L

用NaOH调节pH至8.6，常温储存。

用时稀释成1×溶液使用。

3.LB培养基

Yeastextract（酵母提取物）1g

Tryptone2g

NaCl2g

Agarpowder（琼脂粉）3g（配1.5%固体培养基时加入）

二蒸水200ml

灭菌20min，冷却后加入抗生素。

4.CaCl2（0.1M）

CaCl21.47g

H2O100ml