自噬性程序性细胞死亡研究进展27.docx

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自噬性程序性细胞死亡研究进展27

博士生资格考试综述（2005年10月24日）

自噬性程序性细胞死亡研究进展

陈丽娜

北京大学基础医学院免疫学系分子免疫实验室

北京大学人类疾病基因研究中心

前言

程序性细胞死亡（ProgrammedCellDeath,PCD）是有机体在漫长的进化过程中发展起来的细胞自杀机制，在清除无用的、多余的或癌变的细胞，维持机体内环境稳态方面发挥重要作用。

程序性细胞死亡调控机制的失调与多种疾病的发生发展相关，如神经变性性疾病、自身免疫病、恶性肿瘤、衰老、病原微生物感染、肌细胞功能失调等。

多数学者将细胞的死亡形式分为凋亡性程序性细胞死亡（Apoptosis）、自噬性程序性细胞死亡（Autophagy）和细胞坏死（Necrosis）三种类型1。

凋亡性程序性细胞死亡也称为Ⅰ型程序性细胞死亡。

对细胞凋亡的形态学、参与分子及调控机制的研究由来已久。

凋亡细胞的典型形态学特点表现为：

细胞皱缩、体积缩小；部分细胞器、核糖体和核碎片被细胞膜包裹形成凋亡小体，从细胞表面出芽脱落，最后被具有吞噬功能的细胞如巨噬细胞、上皮细胞等吞噬；磷脂酰丝氨酸外翻；细胞核染色质浓缩、边缘化、染色质DNA断裂。

凋亡过程重要的参与分子有：

凋亡促进分子半胱-天冬氨酸蛋白酶（Caspases）家族、Bax/Bak、细胞色素C等；凋亡抑制分子IAP2、Bcl-2家族分子等。

凋亡信号通过细胞膜受体途径（Fas/FasL、TNF/TNFR等）或线粒体途径传导，依次激活起始Caspases（Caspase-8或Caspase-9）和下游信号转导通路的关键分子执行Caspase（Caspase-3）,启动凋亡3,4。

另外，凋亡形式的程序性细胞死亡也可以Caspases非依赖的方式进行。

细胞坏死是细胞对外界损伤刺激的一种非程序性死亡方式，其形态学特点明显异于凋亡，常伴随炎症的发生。

近年来，一种新的程序性细胞死亡方式-自噬性程序性细胞死亡吸引了越来越多细胞生物学家的注意。

人们将Autophagy称为Ⅱ型程序性细胞死亡，这种形式的细胞死亡表现为细胞浆中出现大量包裹着细胞浆和细胞器的空泡结构和溶酶体对空泡内成分的降解。

自噬在细胞的生长、发育和疾病发生中起着重要的作用。

随着参与自噬性程序性细胞死亡途径的关键分子的鉴定成功，我们对其分子机制、生理功能和在病理过程中的作用有了进一步的了解。

2004年12月出版的《科学》杂志预测对自噬性程序性细胞死亡的研究会成为2005年科技领域的六大热点之一，且排在第一位。

一份全新的国际性杂志《Autophagy》已在2005年4月份出版，有关自噬研究的第一次国际性会议也已于2005年4月在意大利召开。

估计正如当年对细胞凋亡的研究一样，对自噬的关注很快会在生命科学领域形成一个新的研究热点。

本综述将就哺乳动物细胞自噬（Autophagy）与自噬性程序性细胞死亡的形态学特点、关键分子加工机制、信号转导、与细胞凋亡的关系、在病理生理过程中的作用及其研究方法展开讨论。

一、Autophagy的形态学特点及分类

Autophagy是凋亡之外的第二种程序性细胞死亡方式，在进化过程中高度保守，从酵母、果蝇到脊椎动物和人都可以找到参与autophagy的同源基因。

相对于主要降解短半衰期蛋白质的泛素-蛋白酶体系统，细胞的自噬被认为是参与绝大多数长半衰期蛋白质的降解5,6。

在形态学上，即将发生autophagy的细胞胞浆中出现大量游离的膜性结构，称为前自噬泡（Preautophagosome）。

前自噬泡逐渐发展，成为由双层膜结构形成的空泡，其中包裹着变性坏死的细胞器和部分细胞浆，这种双层膜被称为自噬泡（Autophagosome）。

自噬体双层膜的起源尚不清楚，有人认为其来源于粗面内质网，也有观点认为来源于晚期高尔基体及其膜囊泡体，也有可能是重新合成的。

自噬泡的外膜与溶酶体膜融合，内膜及其包裹的物质进入溶酶体腔，被溶酶体中的酶水解。

此过程使进入溶酶体中的物质分解为其组成成分（如蛋白质分解为氨基酸，核酸分解为核苷酸），并被细胞再利用，这种吞噬了细胞内成分的溶酶体被称为自噬溶酶体（AutophagolysosomeorAutolysosome）。

尽管在进化过程中，底物运送到溶酶体的机制发生了变化，autophagy本身却是一个进化保守的过程。

与其他蛋白水解系统相似，溶酶体参与了细胞内组成成分的持续性转运和翻新（尤其是长半衰期蛋白质的分解和再利用）。

在autophagy过程中，除可溶性胞浆蛋白之外，像线粒体、过氧化物酶体等细胞器或细胞器的一部分，如高尔基体和内质网的某些部分都可被溶酶体所降解；最近，有研究发现，酵母细胞核的某些区域也可通过autophagy途径被清除7-10。

根据细胞内底物运送到溶酶体腔方式的不同，哺乳动物细胞autophagy可分为三种主要方式11：

大自噬（Macroautophagy）、小自噬（Microautophagy）和分子伴侣介导的自噬（Chaperone-mediatedautophagy）。

在大自噬形式的autophagy中，细胞浆中可溶性蛋白和变性坏死的细胞器被非溶酶体来源的双层膜结构所包裹，即前面提到的自噬泡（Autophagosome），并由自噬泡将其携带到溶酶体中降解加工；小自噬形式的autophagy与之不同，溶酶体膜自身变形，包裹吞噬细胞浆中的底物。

在大自噬和小自噬两种形式的autophagy中，底物被其所包裹的膜性结构带至溶酶体后，均发生膜的迅速降解，进而释放出其中的底物，使溶酶体中水解酶对底物进行有效水解，保证了细胞对底物的再利用。

分子伴侣介导的自噬首先由胞浆中的分子伴侣Hsc73识别底物蛋白分子的特定氨基酸序列（如KFERQ-样模体）并与之结合，分子伴侣-底物复合物与溶酶体膜上的受体Lamp2a（Lysosome-associatedmembraneprotein2a）结合后，底物去折叠；溶酶体腔中的另外一种分子伴侣介导底物在溶酶体膜的转位，进入溶酶体腔中的底物在水解酶作用下分解为其组成成分，被细胞再利用12。

因此，自噬可被认为是真核细胞中广泛存在的降解/再循环系统。

哺乳动物细胞三种形式autophagy的比较参见图一和表一。

二、Autophagy发生过程的分子机制

目前至少已经鉴定出27种参与酵母autophagy的特异性基因，另外还有50多种相关基因。

其命名从最初称为APG，AUT和CVT，现已被统一命名为酵母自噬相关基因ATG（AuTophaGy-related）。

哺乳动物自噬相关基因也已由最初的Atg/Apg/Aut/Cvt，统一命名为Atg。

哺乳动物自噬基因的命名与酵母相似，但也有个别差异，如酵母的ATG8在哺乳动物称为LC3，酵母的ATG6在哺乳动物则称为Beclin1（表二）。

随着研究的深入，许多酵母中autophagy相关基因的同源物均已在哺乳动物中找到，并分离鉴定成功，这说明autophagy是一个进化保守的过程，其分子机制从酵母到哺乳动物十分相似。

1.参与自噬体形成的两个泛素样蛋白系统及其作用

1.1.参与自噬体形成的两个泛素样蛋白系统

在哺乳动物autophagy的自噬泡形成过程中，由Atg3,Atg5,Atg7,Atg10,Atg12和LC3（Microtubule-associatedprotein1lightchain3,MAP1-LC3）参与组成的两条泛素样蛋白加工修饰过程：

Atg12-结合过程和LC3修饰过程起着至关重要的作用13（图二）。

Atg12-结合过程与前自噬泡（Preautophagosome）的形成相关，而LC3修饰过程对自噬泡（Autophagosome）的形成必不可少。

Atg12首先由E1样酶Atg7活化，之后转运至E2样酶Atg10，最后与Atg5结合，形成自噬体前体（Autophagosomalprecursor）。

LC3前体（ProLC3）形成后，首先加工成胞浆可溶性形式LC3-I，并暴露出其羧基末端的甘氨酸残基。

同样，LC3-I也被Atg7活化，转运至第二种E2样酶Atg3，并被修饰成膜结合形式LC3-II。

LC3-II定位于前自噬体和自噬体，使之成为自噬体的标志分子。

一旦自噬体与溶酶体融合，自噬体内的LC3-II即被溶酶体中的水解酶降解。

LC3是酵母autophagy相关基因ATG8的类似物。

哺乳动物细胞内源性Atg5和Atg12主要以结合形式存在；而胞浆可溶性LC3-I和膜结合型LC3-II的比例在不同组织和细胞类型变化很大。

哺乳动物细胞autophagy过程中两条泛素样加工修饰过程可以互相调节，互相影响。

Atg5基因缺陷的鼠胚胎干细胞缺乏Atg12-Atg5复合物，其LC3-I到LC3-II的修饰同时受到影响14。

在哺乳动物细胞HEK293中，Atg3除作用于其底物LC3,GATE-16（Golgi-associatedATPaseenhancerof16kDa,分子量为16kDa的高尔基体相关ATP酶增强子）和GABARAP（γ-amminobutyricacidreceptorassociatedprotein,γ-氨基丁酸受体相关蛋白）外，还与Atg12和Atg12-Atg5复合物相互作用15,16。

虽然HEK293细胞中单独超表达游离的Atg12促进了LC3-I到LC3-II的修饰，过多Atg12-Atg5复合物的存在却可抑制上述修饰过程15。

在Atg7存在的情况下，HEK293细胞超表达哺乳动物Atg3可促进Atg12-Atg5复合物的形成16。

这些研究结果提示Atg3与Atg12和Atg12-Atg5复合物的相互作用在Atg12结合和LC3修饰两条泛素化修饰过程中起重要作用。

哺乳动物Atg10除结合Atg12外，还与LC3相互作用17。

Atg10与Atg12形成E2样底物中间物，但不与LC3结合。

在Atg7存在下，超表达Atg10还可促进LC3-I到LC3-II的修饰17。

酵母和哺乳动物的Atg7以同源二聚体形式存在18,19。

这些结果说明Atg12-结合和LC3-修饰两条泛素样修饰过程相互偶联，Atg10和Atg3两种E2样酶在调控autophagy上述两条泛素样修饰过程中发挥重要作用。

1.2.泛素化修饰在自噬泡形成过程中的作用

哺乳动物细胞autophagy自噬泡的形成过程与Atg12-结合和LC3修饰两条泛素样修饰过程息息相关。

如图三所示20：

在自噬泡形成的早期阶段（Preautophagosome），由Atg12-Atg5-Atg16L形成的复合物即与其外膜结合，这种结合一方面促进了自噬泡的伸展扩张，使之由开始的小囊泡样、杯样结构逐渐发展为半环状、环状结构；另一方面，Atg5复合物与自噬泡膜的结合还促进了LC3向自噬泡的募集。

Atg5复合物在膜上的定位决定膜的弯曲方向，膜向着背对Atg5复合物的方向延伸。

当双层膜结构的自噬泡即将形成环状闭合结构或刚刚闭合时，Atg5复合物便从膜上脱离下来，只留下膜结合形式的LC3-II定位于自噬泡膜上。

因此，LC3-II含量的多少与自噬泡数量的多少成正比。

当哺乳动物细胞发生autophagy时，细胞内LC3的含量及LC3-I向LC3-II的转化均明显增加。

因此，通过检测细胞内LC3-II的含量变化，可以方便地判断细胞状态，判断其autophagy是被诱导还是被抑制。

Atg5复合物对自噬泡的形成至关重要，有报道称破坏小鼠胚胎干细胞Atg5基因导致自噬泡形成缺陷14；基因突变的Atg5丧失了与Atg12结合的能力，同时也导致自噬泡延伸障碍。

Atg5-Atg12-Atg16L复合物为同源四聚体组成的大蛋白复合物，分子量约为800kDa。

正常哺乳动物细胞中绝大多数Atg5、Atg12和Atg16L以复合物形式存在，说明Atg5-Atg12-Atg16L复合物的存在并不会导致自噬泡的形成和活化。

哺乳动物绝大多数Atg5-Atg12-Atg16L复合物存在于胞浆中，在autophagy自噬泡膜的延伸过程中，一部分Atg5-Atg12-Atg16L复合物定位于膜表面，自噬体的双层膜结构形成后，此复合物便从膜上解离下来。

因此，Atg5-Atg12-Atg16L复合物的存在是autophagy过程中膜的延伸所必需的。

同样，哺乳动物中酵母Atg8的同源物LC3也要首先经历泛素样翻译后修饰过程，然后定位于autophagy自噬泡膜表面。

哺乳动物LC3合成之后，在Atg4同源物的催化下，其C末端5个氨基酸残基被切割下来，暴露出C端的甘氨酸残基。

这种经过加工的LC3称为LC3-I，定位于胞浆中。

之后，LC3-I在哺乳动物E1泛素样酶Atg7和E2泛素样酶Atg3的催化下，与自噬泡膜表面的磷脂酰乙醇胺（PE）结合，称为LC3-II。

电泳过程中，LC3-II的迁移速率要快于LC3-I。

因此，在LC3的免疫印记中，通常出现两条带：

LC3-I的表观分子量为18kD，LC3-II的表观分子量为16kD。

LC3-II的含量或LC3-II/LC3-I的比例与自噬泡的数量呈正相关21。

LC3-II的形成依赖于Atg12-Atg5复合物：

在Atg5-/-的胚胎干细胞或表达结合缺陷型Atg5基因（Atg5K130R）突变株的胚胎干细胞中，LC3-II是检测不到的14。

2.Ⅲ型磷脂酰肌醇3磷酸激酶（ClassⅢPI3K）

自噬体的形成也依赖于Ⅲ型磷脂酰肌醇三磷酸激酶（ClassⅢPI3K）的作用。

ClassⅢPI3K可磷酸化磷脂酰肌醇（PtdIns），生成3-磷酸磷脂酰肌醇（PtdIns3P）。

PtdIns3P募集胞浆中含－FYVE－或－PX－基序的蛋白质，用于自噬体膜的形成。

ClassⅢPI3K还可与Beclin1形成复合物参与自噬体的形成22（图四）。

PI3K抑制剂（3－MA,Wortmannin）可干扰或阻断自噬体形成。

3.其它

Sec基因（Sec12、Sec16、Sec23/24）在Saccharomycescerevisiae中参与了自噬体膜的形成。

另外，中间丝、微管等细胞骨架成分也参与了自噬体形成晚期步骤的完成。

表一：

哺乳动物细胞三种主要形式autophagy的比较

特点大自噬小自噬分子伴侣介导的自噬

活化方式压力与应激组成性压力与应激

物种

哺乳动物是是是

非哺乳动物是是？

机制

内吞是是否

膜来源非溶酶体溶酶体/

受体介导否否是

参与成分

ATP是是是

GTP和GTPases是是否

细胞骨架是否？

分子伴侣？

？

是

囊泡酸性pH是是否

膜电位？

是是

PI3激酶是？

否

底物

细胞器各种类型各种类型无

可溶性胞浆蛋白各种类型各种类型KFERQ-标签

靶信号泛素样？

葡萄糖去除？

？

KFERQ样模体

蛋白去折叠否否是

选择性某些形式某些形式总是

表二：

哺乳动物自噬相关基因

GeneDesignation

YeastHumanMouseComment

ATG1ULK1Unc-51-likekinaseinteractswithGATE-16andGABARAP

ATG3hATG3/hAPG3mATG3/mAPG3anE2-likeenzymeforLC3,GABARAP,andGATE-16

ATG4hATG4A/HsATG4A/CysteineproteaseforGATE-16

HsAPG4A/autophagin-2

hATG4B/HsATG4B/CysteineproteaseforLC3,GABARAP,

hAPG4B/autophagin-1andGATE-16;DelipidatingenzymeforLC3-ⅡandGABARAP

hAtg4C/HsAUTL1/Cysteineprotease

autophagin-3

hATG4D/autophagin-4

ATG5hATG5/hAPG5targetproteinofAtg12

ATG6beclin1beclin1relatedtotumorigenesis

ATG7hATG7/HsGSA7/mATG7/mAPG7anE1-likeenzymeforAtg12andAtg8

hAPG7homologues

ATG8LC3modifierforautophagosomes

GABARAPmodifier

GATE-16modifier

ATG8L/APG8Lunknown

ATG10mATG10/mAPG10anE2-likeenzymeforAtg12

ATG12hATG12/hAPG12mATG12/mAPG12modifierforautophagosome

ATG16ATG16L/APG16LinteractswithAtg5

三、自噬过程的信号调控

参与自噬过程的信号转导分子非常复杂，目前尚未完全被我们所了解。

1.mTOR（MammalianTargetofRapamycin）信号途径

TOR激酶是氨基酸、ATP和激素的感受器，对细胞生长具有重要调节作用，抑制自噬的发生，是自噬的负调控分子，并发挥“门卫（gatekeeper）”作用。

哺乳动物细胞中的核糖体蛋白质S6（p70S6）抑制自噬的发生，它位于TOR信号途径下游，其活性受mTOR调节23。

纳巴霉素（Rapamycin）通过抑制mTOR的活性，发挥抑制p70S6活性、诱导自噬发生的作用。

TOR激酶抑制自噬的信号通路目前尚未完全明了。

在酵母细胞，TOR激酶可能通过抑制ATG1激酶的活性来抑制自噬的发生24。

2.ClassⅠPI3K/PKB途径

ClassⅠPI3K是自噬的负调节分子，它可磷酸化PtdIns4P和PtdIns（4，5）P2，生成PtdIns（3，4）P2和PtdIns（3，4，5）P3，然后结合Akt/PKB和它的活化分子PDK1,抑制自噬的发生。

结节性硬化复合物1（TSC1）和TSC2蛋白位于ClassⅠPI3K/PKB途径的下游，可通过抑制小G蛋白Rheb，抑制TOR激酶的活性，对自噬发挥正向调节作用。

PTEN磷酸酶也是自噬的正向调节分子，它使PtdIns（3，4，5）P3去磷酸化，从而解除ClassⅠPI3K/PKB途径对自噬的抑制。

上述两条自噬过程的信号调控途径示意图见图五25,26。

3.Gi3蛋白和氨基酸

GTP结合的G蛋白亚基Gi3是自噬的抑制因子，而GDP结合的Gi3蛋白则是自噬的活化因子。

GAIP（GAlphaInteractingProtein）作为RGS（RegulatorsofG-proteinSignaling）家族成员之一，通过Gi3蛋白加速GTP的水解，促进自噬的发生。

AGS3（ActivatorofG-proteinSignaling3）也能正向调控自噬效应。

氨基酸作为自噬过程蛋白降解物的终产物，可负性反馈调节自噬。

外源性氨基酸的去除，可以阻断TOR信号途径，而自噬产生的内源性氨基酸可补足氨基酸缺陷，恢复TOR信号转导。

4.其他

激素在自噬的调控中也起重要作用。

胰岛素可抑制自噬，而胰高血糖素则促进自噬。

酪氨酸激酶受体、PKA、casein激酶Ⅱ、MAP激酶、calcium也存在于自噬过程错综复杂的调控网络中，但其机制还不甚清楚。

四、Autophagy与细胞凋亡的关系

尽管最初认为Autophagy与凋亡两种程序性细胞死亡方式在形态、生化指标、参与分子和机理方面均存在不同，近年来越来越多的研究提示二者在某些情况下可以相互拮抗或促进，可先后发生或同时共存于同一细胞，相同诱导因素在不同细胞中可分别诱发Autophagy或凋亡；参与Autophagy和凋亡的分子也可能存在交叉，这些分子在Autophagy与凋亡两种程序性细胞死亡中可发挥正向或负向作用。

随着研究的深入，Autophagy与凋亡之间的相互关系似乎变得越来越复杂了。

最近有报道称Beclin1可通过增强Caspase-9的活性加强化疗药物CDDP诱导的人胃癌细胞MKN28的凋亡，说明作为Autophagy重要调控基因的Beclin1也可参与细胞凋亡的调控27。

营养剥夺诱导的细胞Autophagy在Atg基因（Atg5,Atg6/Beclin1,Atg10,Atg12）干扰RNA或Autophagy特异抑制剂剂（如3-MA）存在的情况下，细胞发生凋亡形式的程序性细胞死亡28。

广谱Caspase抑制剂zVAD通过抑制Caspase-8活性，发挥诱导自噬性程序性细胞死亡的作用，并且这种程序性细胞死亡需要ATG7和Beclin1基因的参与29。

应用RNA干扰或同源重组技术将LAMP-2基因敲除，细胞在营养剥夺情况下，首先发生Autophagy，继而发生凋亡，同时伴随细胞凋亡的典型特点，如线粒体跨膜电位的丧失、Caspase的活化和染色质的凝集30。

另外的研究也证明LAMP-2基因缺陷的小鼠死亡率增加，幸存的小鼠出现多组织广泛的胞浆空泡31。

凋亡刺激信号神经生长因子（NGF）去除或将胞嘧啶阿拉伯糖苷加入含NGF的交感神经的神经元，细胞在出现以DNA片断化为主的凋亡特点前，首先出现大量的自噬泡32。

最近，PyoJO等人的研究发现由IFN-γ或Atg5超表达诱导的Hela细胞死亡之前，首先发生以大量胞浆空泡出现为主的Autophagy的形态学特点。

由IFN-γ诱导的胞浆空泡的出现和细胞死亡可被3-MA或Atg5K130R超表达所抑制，而广谱胱天蛋白酶抑制剂zVAD-fmk只能抑制细胞死亡，却不能抑制胞浆空泡的出现。

这说明以胞浆空泡出现为主的Autophagy可继发Caspase依赖的细胞死亡。

进一步的研究证明Atg5通过和FADD（Fas-associatedproteinwithdeathdomain）的相互作用发挥促进Autophagy性程序性细胞死亡的作用,而FADD是细胞膜受体Fas/FasL途径凋亡的重要参与分子33。

另外，Bcl-2家族蛋白不仅参与凋亡形式的程序性细胞死亡，还参与了对Autophagy形式细胞死亡的调控34,35。

肿瘤坏死因子相关的凋亡诱导配基（TRAIL,TNF-relatedapoptosisinducingligand）在人乳腺上皮细胞MCF-10A组织形成过程中，诱导Autophagy形式的细胞死亡以形成中空的腔状结构，此过程同时伴随发生Caspase依赖的细胞凋亡事件36。

五、Autophagy在病理生理过程中的作用

自噬作用在生物体生长发育、细胞分化及对环境应激的应答方面极为关键，对防止某些疾病如肿瘤、肌病、神经退行性疾病以及对抵御病原微生物的感染和延缓衰老、延长寿命等方面发挥重要作用。

最近的研究提示自噬也参与了天然免疫应答和适应性免疫应答。

在讨论自噬与疾病的关系之前，我们首先需要明确的一个基本观点是：

自噬对疾病的发生起促进作用还是抑制作用？

当环境中的营养物质缺乏时，细胞通过自噬作用对胞内大分子物质进行降解，提供维持细胞存活所需的最低能量37；某些毒素和病原体通过自噬途径被包裹、降解清除38,39。

变性的胞浆成分，如因错误折叠而形成的凝聚蛋白或受损的细胞器也可通过自噬得到清除，从而使细胞免于受到进一步损伤7,40。

因此，在某些疾病的早期阶段，激活自噬起到了阻止疾病进展的作用。

然而，另有报