超声波提取石榴皮类黄酮的工艺优化1.docx
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超声波提取石榴皮类黄酮的工艺优化1
超声波提取石榴皮和石榴花类黄酮的工艺优化
作者：
2011级生物科学专业吕国鹏
指导教师：
张元湖教授
摘要：
在单因素试验基础上，采用正交试验分别探究了超声波提取石榴皮和石榴花中类黄酮的最佳工艺。
在液料比1:
20（g/ml）时超声辅助提取石榴皮中类黄酮的最佳条件为：
乙醇浓度为50%，超声波功率为135W，提取时间为50min，提取温度为30℃，最优条件下的提取量为76.64mg.g-1。
以乙醇为溶剂，考察乙醇体积分数、温度、料液比、时间和超声波功率五个因素的单因素试验，从中选出其中四个主要因素运用正交试验法优化出超声波功率为80W时，提取石榴花类黄酮的最佳工艺条件为：
乙醇体积分数50%，提取温度40℃，料液比1:
60（g/ml），提取时间60min。
此条件下石榴花类黄酮的提取量为58.15mg.g-1。
与传统浸泡方法相比，超声辅助提取法具有时间短、效率高等优点，同时石榴皮与石榴花相比较，石榴皮类黄酮的含量较高，极性相当。
关键词：
黄酮；石榴花；石榴皮；超声波
OptimumConditionsofUltrasonic-assistedExtractionofFlavonoidsfromPomegranateRindandFlower
Abstract：
Basedonthesingle-factortests,theoptimumconditionsofextractionofflavonoidsfrompomegranaterindandflowerrespectivelybyultrasonic-assistedmethodwereexplored.Forthepomegranaterind,theorthogonalexperimentwasperformedwith1:
20（g/ml）ratioofpomegranaterindandthesolvent.Theresultwasasfollow:
50%ethanolsolutionassolvent,ultrasoundpower135W,temperature30℃andextractingfor50minutes.Undertheconditions,theextractionquantitywas76.64mg.g-1.Forthepomegranateflower,theconcentrationofethanol,temperature,time,andsubstance-liquidratio-thefourmainfactorswasusedtodotheorthogonaltest.Finallytheoptimizedconditionswere:
50%ethanolsolutionassolvent,extractiontemperature40℃,solid-liquidratio1:
60,extractiontime60min.Undertheconditions,theextractionquantityofflavonoidsis58.15mg.g-1.Comparedwiththeconventionalsoakingmethod,ultrasonic-assistedextractionmethodhasshorttermandhigherefficiency.Meanwhile,flavonoidsfrompomegranaterindhavehigheryieldandsimilarpolaritythanthatfrompomegranateflower.
Keywords：
flavonoids；pomegranaterind；pomegranateflower；ultrasonic
1前言
植物次生代谢产物在许多生命活动过程中起着重要作用,如细胞解毒、物质交流、信号转导、防御机制等。
对人类而言,很多植物次生代谢物具有治疗疾病的重要功能,也是医药品和化学品的重要来源[1]。
2008年6月，第一届植物次生代谢国际学术研讨会在中国昆明召开，研讨会上探讨了八个主要议题：
（1）萜类化合物生物合成；
（2）生物碱的生物合成；（3）类黄酮的生物合成；（4）细胞壁的生物合成；（5）其它天然产物；（6）代谢网络；（7）代谢工程；（8）次生代谢产物的应用。
此后，植物次生代谢物的研究更加深入，更加广泛，植物次生代谢体系也更加完善。
获取植物次生代谢物质，然后对其开展生化方面的研究是科学研究的一条基本途径。
现在许多科研工作者都在从事这一方面的研究，而我国丰富的植物资源就成了研究的对象。
本试验选择石榴做为研究对象，这是因为它独特的特性。
石榴（PunicagranatumL.）,石榴科石榴属，是一种珍奇的浆果。
石榴原产伊朗、阿富汗等中亚地带，即古代的安息国。
汉代张骞出使西域，得种而归，栽植中原，又名安石榴。
石榴皮性温，味苦涩，有毒，具有涩肠、止血、解毒、杀虫的功效，因此常用于治疗久痢、久泻、便血、脱肛、崩漏、虫积腹痛等[2]。
现代药理学研究证实,石榴皮提取物不但具有清除自由基、抗氧化功能[3-4],还具有抗病毒、抗菌的功能[5-6]。
石榴皮和石榴花中主要成分有鞣质、黄酮类、有机酸、生物碱等[7-8]。
而其中的类黄酮化合物是一类较为重要的功效成分[9-10]。
类黄酮化合物广泛存在于植物界，是植物次生代谢产物中的一大类物质。
生物类黄酮泛指2个苯环（A-与B-环）通过中央三碳链相互结合的一系列C6-C3-C6化合物,主要是指以2-苯基色原酮为母核的化合物[11]。
它包括异黄酮、黄酮、黄酮醇、异黄酮醇、黄烷酮、异黄烷酮、喳尔酮、口山酮等。
至今科学家已发现4000多种生物类黄酮物质，它们在许多方面表现出重要的作用，如抗氧化及抗自由基作用，对心血管系统的维护作用，雌性激素样作用，护肝作用，抗炎抗过敏作用，抑菌抗病毒作用。
具有良好的抗氧化性能和清除自由基的能力以及抗肿瘤、保护心血管和抗突变的作用[12]。
石榴皮占石榴的20%～30%，目前除少数药用外，大多被废弃，因此，研究石榴皮活性成分及其生物活性作用，对于开发利用这一生物资源具有重要的理论意义及实际应用价值[13]。
石榴5-7月开花，花期长，开花量大，一般分为3批花。
刚现蕾时要疏掉不能结实的钟状花，大部分二花及三花不能正常结果而自然脱落，因此石榴花的资源丰富，极具开发价值。
开发利用石榴中的黄酮类化合物前景看好，因此摸索出较好的石榴花黄酮提取工艺对于后续的研究非常有意义。
黄酮类化合物提取的基本原理是相似相溶原理，过程实质是类黄酮从植物内部向溶剂中转移的传质过程：
溶剂从溶剂主体传递到固体颗粒的表面；溶剂扩散渗入固体内部和内部的微孔隙内；类黄酮溶解进入溶剂；通过固体微孔隙通道中的溶液扩散至表面；类黄酮从固体表面传递到溶剂主体[14]。
在此原理上发展出多种不同提取方法，大体包括水提取法、碱液提取法、有机溶剂提取法、微波萃取法、超声波法、酶解法、大孔树脂吸附法、超滤法等方法[15]。
在开展本试验之前，就已经有许多关于石榴花活性成分的提取与分离研究报道，其中张立华博士这方面的研究最全面也最深入。
2009至2010年之间，他曾发表过多篇有关石榴的论文，比如《石榴皮提取物的纯化及抗氧化性能》、《石榴不同部位提取物的抗油脂氧化及抑菌活性的比较研究》、《超声波辅助提取石榴叶单宁的研究》、。
这些研究主要涉及石榴活性物质如单宁和石榴籽油的提取工艺，石榴不同部位活性物质抗氧化和抑菌活性的比较，从时间变化率和抗氧化能力等多个方面进行了考察，并得到许多有价值的结果。
本试验所选材料与张博士来自同一地点，主要对其中的一种物质类黄酮进行了简单研究，一方面是因为它在石榴中的含量较高，开发应用价值较大，另一方面就是石榴黄酮目前的研究还不是很全面，存在一些空缺。
从石榴皮和石榴花中提取黄酮类物质的工艺大多是有机溶剂浸泡方法，对石榴皮和石榴花类黄酮超声波提取工艺的研究还鲜有报道，本文采用了超声波辅助提取，初次对酸、甜石榴皮中类黄酮含量作了比较，探索了不同提取方法及乙醇浓度、处理温度、处理时间、料液比和超声功率五个因素对类黄酮化合物提取的影响，通过正交试验确定石榴皮和石榴花类黄酮化合物提取最佳工艺，并对此做了相应的比较。
2材料与方法
2.1材料
石榴于2010年5月采自山东枣庄市石榴园。
石榴皮在80℃干燥箱内干燥24h，并粉碎过40目筛，冷藏备用。
石榴花采后先在105℃条件下杀青处理15min，然后在鼓风干燥箱内65℃温度下烘干至恒重，在4℃冰箱中冷藏备用。
2.2试剂
无水乙醇（分析纯）、5%亚硝酸钠、10%硝酸铝、1M氢氧化钠
2.3仪器
BS-224S型电子分析天平（精度0.1mg），北京赛多利斯仪器系统有限公司；KQ-100DE型数控超声波清洗器，昆山市超声仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂（上海棱广科学器材有限公司）；UV-2550型紫外分光光度计（日本岛津）；KDF-2311型多功能食品粉碎机，天津市康达电器公司
2.4方法
2.4.1芦丁标准曲线的制备
芦丁（Rutin）是黄酮类物质的典型代表，常以芦丁为标准品来测定类黄酮的含量。
用万分之一天平精确称取5mg芦丁纯品,用65%乙醇溶解,定容25ml容量瓶中,摇匀,得到0.2（mg/ml）的标准母液。
精确吸取该标准溶液0、1、2、3、4、5、6ml,分别置于25ml试管中,加5%亚硝酸钠0.3ml,混匀,加10%硝酸铝0.3ml,混匀,放置5min,加1mol/l氢氧化钠4ml,用65%乙醇定容至刻度,摇匀,放置5min后比色,在510nm波长下用uv-1601型分光光度计测定其吸光值。
得到质量浓度x与吸光度y的标准曲线:
Y=13.16X-0.0074，其中R2=0.9985。
来计算类黄酮总量，式中：
Y----A510nm的吸光值；X----已知芦丁溶液的浓度（mg/ml）。
2.4.2石榴皮类黄酮的提取
2.4.2.1浸泡处理
取2.0g已经干燥好的材料于三角瓶中并加入20ml70%的乙醇溶液中，浸泡处理8~24h。
提取物经低压真空抽滤后定容至50ml备用。
2.4.2.2超声波处理
称取2.0g石榴粉于20ml70%的乙醇溶液中，在不同温度和时间下进行超声提取，提取物经过低压真空抽滤，定容至50ml备用。
2.4.2.3类黄酮总量的测定
黄酮类化合物含量的测定方法有分光光度法、高效液相色谱法、毛细管电泳法、超临界流体色谱法、薄层扫描法等[15]。
分光光度法设备价廉，操作简单，故本试验仍选用此法。
类黄酮化合物的紫外光谱图上主要有两个吸收带：
环肉桂酰系统引起的吸收带I（300-550nm）和环苯酰系统引起的吸收带Ⅱ（240-280nm）。
若加入铝盐，则铝离子与黄酮类化合物形成稳定的配合物，带Ⅱ会明显向长波方向移动（红移）；在NaNO2的强碱性溶液中，其在510nm处吸光度值最大，从而为分光光度法测定提供了可靠的依据[16]。
具体方法为：
取0.5ml总黄酮提取液加入试管中，再加入5%的亚硝酸钠溶液0.3ml，摇匀，加入10%的硝酸铝溶液0.3ml摇匀后放置5min，加入4ml1mol/LNaOH溶液，再加入65%乙醇溶液补充至6ml，摇匀后放置5min。
以65%乙醇为对照，在510nm波长下用UV-1601型分光光度计测定其吸光值。
每一试样重复测定3次，取OD510的平均值，从上述标准曲线计算相应的总黄酮的含量。
石榴皮类黄酮的得率（mg.g-1）=（类黄酮浓度x样品总体积）/样品干重
2.4.3石榴花类黄酮的提取
2.4.3.1黄酮的提取工艺流程
石榴花原料→烘干至恒重→粉碎→过60目筛→超声波辅助提取→低压抽滤→滤液定容→显色反应→测定含量，计算类黄酮的得率。
2.4.3.2石榴花类黄酮样品的制备
精确称取0.5g石榴花干粉，置于150ml三角瓶中，加入一定量50%的乙醇。
超声波提取，设定一定的温度和时间。
提取液趁热过滤，滤液用65%的乙醇定容至50ml的容量瓶中，避过保存。
2.4.3.3类黄酮含量的测定（方法同上）
2.5实验思路
2.5.1石榴皮类黄酮的最佳提取工艺（见图1）
2.5.2石榴花类黄酮的最佳提取工艺（见图2）
图1石榴皮类黄酮提取工艺流程图
Fig.1Processofextractionofflavonoidsfrompomegranaterind
图2石榴花类黄酮提取工艺流程图
Fig.2Processofextractionofflavonoidsfrompomegranateflower
3结果与分析
3.1石榴皮类黄酮的提取
3.1.1酸、甜石榴皮中类黄酮含量的比较
分别取酸甜石榴皮干粉2g于三角瓶中，加入20ml75%乙醇，在20℃，100W功率条件下超声处理30min。
结果如图3所示，甜石榴皮中所含的类黄酮物质比酸石榴每克多12.6mg。
图3酸甜石榴皮中类黄酮含量比较
Fig.3Totalflavonoidsintherindofsourandsweetpomegranate
3.1.2不同提取方法对提取结果的影响
取2g材料于三角瓶中，在室温20℃下进行三种不同的提取方法：
乙醇常规浸泡处理8h，水常规处理8h，乙醇常温超声处理30min（功率100W）。
结果如图4所示，乙醇常温超声提取效果最好，水常规提取最差，二者提取类黄酮总量相差18.35mg.g-1。
图4不同提取方法比较
Fig.4Flavonoidscontentsofdifferentextractiontreatments
3.1.3乙醇浓度对提取的影响
分别取2g材料于三角瓶中，分别加入50%、60%、65%、70%、80%的乙醇溶液各20ml，超声处理30min，温度为20℃，功率为100W，结果如图5所示，60%乙醇溶液的提取得率最高，80%的乙醇溶液的提取率反而降低。
根据“相似相溶”原理，不同浓度的乙醇溶液对类黄酮物质有着不同的溶解力，本试验结果表明60%的乙醇溶液对石榴皮类黄酮的溶解能力最强。
图5不同乙醇浓度对类黄酮提取的影响
Fig.5Effectsofconcentrationofethanolonextractionefficacyofflavonoids
3.1.4超声时间对提取的影响
分别取2g材料于三角瓶中，60%乙醇20ml，设定的超声时间分别为20、30、40、50、60min，处理温度20℃，超声波功率100W，比较不同处理时间对提取效果的影响，结果如图6所示，在处理时间达50min时类黄酮的提取量已达到最大值，随后呈现下降趋势，说明超声波处理能在短的时间内就能达到较高的提取得率。
50-60min的提取量反而有所下降，推测原因是由于类黄酮大部分物质结构不稳定，随时间延长被氧化分解的量增加。
图6超声处理时间对类黄酮提取的影响
Fig.6Effectsoftimeonextractionefficacyofflavonoids
3.1.5超声处理温度对提取的影响
选定提取时间30min，料液比1∶20（g/ml），乙醇溶液的浓度为60%，超声波功率100W，选择4个温度梯度进行试验，结果如图7所示，20℃-30℃时有较高提取率，随温度升高提取率呈显著下降趋势，这说明通过超声波提取时温度不是影响提取效果的主要因素，这也正是超声波提取的一个优点，不需高温条件。
较高的温度可能会使植物组织中的多糖、果胶等成分析出量增多，增加了溶液的粘稠度，从而影响有效成分的溶出；另外，也可能由于类黄酮大部分物质的结构稳定性较差，高温加热发生氧化或水解反应使提取率降低[17]。
20℃和30℃的提取率相差不大，为减少能耗，实践中可选择20℃。
图7不同温度对类黄酮提取的影响
Fig.7Effectsoftemperatureonextractionefficacyofflavonoids
3.1.6超声功率对提取的影响
设置超声波功率为80、100、135、150W，比较不同超声波功率对提取效果的影响，其它条件设定为料液比1∶20（g/ml），乙醇溶液的浓度为60%，处理温度20℃，处理时间30min。
结果如图8所示，在80~150W范围内类黄酮的提取量随超声波功率的增大而没有太大的变化。
为了节省能耗，实践中可选择100W。
这可能是由于随着超声波功率增大，空化作用增强，类黄酮物质溶出的量增加[17]。
图8超声功率对类黄酮提取的影响
Fig.8Effectsofultrasonicpoweronextractionefficacyofflavonoids
3.1.7正交试验
在单因素试验的基础上，以甜石榴皮为提取材料，选择超声功率、乙醇浓度、超声处理时间和超声处理温度4个考察因素，每个因素3个水平，进行L9（34）正交试验，分析石榴皮类黄酮物质在不同提取条件下的提取率，以确定最佳提取条件。
正交试验因素水平和结果分别列入表1，2。
表1正交试验因素水平表
Table1Factorsandlevelsoftheorthogonaltest
水平
Level
因素Factor
A超声波功率
Ultrasonicpower/W
B乙醇体积分数
Volumefractionofethanol/%
C提取时间
Extractiontime/min
D提取温度
Extractiontemperature/℃
1
100
50
30
20
2
135
60
40
30
3
150
70
50
40
由表2中的级差R值的结果：
R3>R1>R2>R4，可知各因素对石榴皮类黄酮提取量的影响主次顺序为：
提取时间>超声功率>乙醇浓度>提取温度。
第一列：
k3第二列：
k3第三列：
kl第四列：
k3通过比较k值，得出石榴花类黄酮提取得率的最佳因素组合为A2B1C3D2，即用50%的乙醇为提取剂，在超声波功率为135W时,于30℃下提取50min。
而正交试验中黄酮提取率最高的是4组,为76.54mg.g-1,因此进行了验证试验。
结果表明试验选取的最优组合的提取得率较高，为76.64mg.g-1。
表2正交试验结果
Table2Resultsoftheorthogonaltest
试验组号
TestNO.
A超声功率
Ultrasonicpower/W
B乙醇体积分数
Volumefractionofethanol/%
C提取时间
Extractiontime/min
D提取温度
Extractiontemperature/℃
得率
Yield/mg.g-1
1
1
1
1
1
73.82
2
1
2
2
2
75.28
3
1
3
3
3
72.80
4
2
2
3
1
76.54
5
2
3
1
2
73.48
6
2
1
2
3
73.56
7
3
3
2
1
71.50
8
3
1
3
2
75.38
9
3
2
1
3
70.78
K1
221.92
222.78
218.10
221.86
K2
223.60
222.60
222.60
224.16
K3
217.66
217.80
224.74
220.90
k1
73.98
74.26
72.70
73.96
k2
74.54
74.20
74.20
74.72
k3
72.56
72.60
74.92
73.64
R
1.98
1.66
2.22
1.08
3.2石榴花类黄酮的提取
3.2.1单因素试验结果
3.2.2.1提取时间对石榴花类黄酮提取得率的影响
在温度为20℃，料液比为1:
20，乙醇体积分数为50％的条件下，时间对石榴花中黄酮类物质的提取效果的影响如图9所示。
由图9可知，随时间延长，得率呈上升趋势，在40min以后基本趋于平缓。
可溶性物质在较短时间内能迅速溶出，但随时间延长，部分物质会因其对热、光不稳定而分解等，从而导致得率略有下降。
因此，最适宜的提取温度应该在30min-60min之间。
图9提取时间对黄酮得率的影响
Fig.9Effectofextractingtimeonyieldofflavonoids
3.2.2.2提取温度对石榴花类黄酮提取得率的影响
在乙醇体积分数为50％，料液比为1:
20，时间为20min的条件下，温度对石榴花中黄酮类物质的提取效果的影响如图10所示。
由图10可知，随温度增高，得率呈上升趋势，在40℃时出现峰值，然后趋于下降。
温度升高使得黄酮类物质的溶解性提高，同时，温度升高，热运动加速，黄酮的溶出率提高。
但温度过高，黄酮类化合物的稳定性下降，结构被破坏，黄酮的得率就会下降。
因此，比较适宜的提取温度应该在40℃左右。
图10提取温度对和黄酮得率的影响
Fig10Effectofextractingtemperatureonyieldofflavonoids
3.2.3.3乙醇体积分数对石榴花类黄酮提取得率的影响
在温度30℃，料液比1:
40，时间20min的条件下，考察不同体积分数乙醇对石榴花中黄酮类物质的提取效果的影响，结果如图11所示。
由图11可知：
乙醇体积分数在40％和80％时，黄酮得率均较低。
黄酮得率随着乙醇体积分数的提高而增加，在乙醇体积分数为50％时出现峰值。
当乙醇体积分数大于50％时，得率有所下降，体积分数为80％时出现最低值。
这表明石榴皮中所含的黄酮类物质为中等极性物质，在大约50％乙醇中能够较好地溶出。
图11乙醇体积分数对黄酮得率的影响
Fig.11Effectofethanolvolumefractiononyieldofflavonoids
3.2.2.4料液比对石榴花类黄酮提取得率的影响
在温度为30℃，乙醇体积分数为50％，时间20min的条件下，料液比对石榴花中黄酮类物质的提取效果的影响如图12所示。
由图12可知，黄酮得率随料液比的增大基本呈上升趋势，在料液比为1:
60时达到最大值，其后随料液比继续增大，但变化不大。
说明，在料液比为1:
60时，黄酮的提取液基本上就饱和了。
图12料液比对黄酮得率的影响
Fig.12Effectofsolid-liquidratioonyieldofflavonoids
3.2.2
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