基因定点突变全攻略.docx

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基因定点突变全攻略

基因定点突变全攻略

一、定点突变得目得

把目得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基.

二、定点突变得原理

定点突变就是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目得DNA片段（可以就是基因组，也可以就是质粒）中引入所需变化（通常就是表征有利方向得变化）,包括碱基得添加、删除、点突变等。

定点突变能迅速、高效得提高DNA所表达得目得蛋白得性状及表征，就是基因研究工作中一种非常有用得手段。

　　体外定点突变技术就是研究蛋白质结构与功能之间得复杂关系得有力工具，也就是实验室中改造/优化基因常用得手段。

蛋白质得结构决定其功能,二者之间得关系就是蛋白质组研究得重点之一。

对某个已知基因得特定碱基进行定点改变、缺失或者插入,可以改变对应得氨基酸序列与蛋白质结构，对突变基因得表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构与功能得关系,探讨蛋白质得结构/结构域。

而利用定点突变技术改造基因：

比如野生型得绿色荧光蛋白（wtGFP）就是在紫外光激发下能够发出微弱得绿色荧光,经过对其发光结构域得特定氨基酸定点改造,现在得GFＰ能在可见光得波长范围被激发（吸收区红移）,而且发光强度比原来强上百倍,甚至还出现了黄色荧光蛋白,蓝色荧光蛋白等等。

定点突变技术得潜在应用领域很广,比如研究蛋白质相互作用位点得结构、改造酶得不同活性或者动力学特性,改造启动子或者DNＡ作用元件,提高蛋白得抗原性或者就是稳定性、活性、研究蛋白得晶体结构，以及药物研发、基因治疗等等方面．　

通过设计引物,并利用ＰCR将模板扩增出来,然后去掉模板，剩下来得就就是我们得PCR产物,在PCＲ产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆，再测序确定就行了．

三、引物设计原则

引物设计得一般原则不再重复.

突变引物设计得特殊原则:

（1）通常引物长度为2５~４5bp,我们建议引物长度为3０~35bp。

一般都就是以要突变得碱基为中心,加上两边得一段序列,两边长度至少为1１—12bｐ。

若两边引物太短了，很可能会造成突变实验失败，因为引物至少要１1-1２个ｂp才能与模板搭上,而这种突变ＰＣR要求两边都能与引物搭上，所以两边最好各设至少12个bp，并且合成多一条反向互补得引物。

（2）如果设定得引物长度为３0　bｐ,接下来需要计算引物得Tｍ值,瞧就是否达到78℃（ＧC含量应大于40％）。

（3）如果Tｍ值低于7８℃,则适当改变引物得长度以使其Tm值达到7８℃（GＣ含量应大于４０%）。

　（4）设计上下游引物时确保突变点在引物得中央位置.

（5）最好使用经过纯化得引物。

      Tｍ值计算公式：

Tm=0、41×（％ofGC）–675/L+81、５　

注：

L:

引物碱基数;%oｆGＣ:

引物ＧＣ含量.

四、引物设计实例

以GＣG→ACG为例：

５＇—CCTCＣＴＴCAＧTATGTAGGCGAＣTTACTＴAＴTGCGG-3’

（1）首先设计30bp长得上下游引物，并将A（T）设计在引物得中央位置．

Pｒimer#1:

５'—CCＴTＣAＧTATＧTＡGAＣGＡCTTACTTＡTTＧC—3’

Ｐrimer＃2:

5’—GCAATＡAGTＡAGＴCＧTCTACＡTACTGAAＧG—3'

（2）引物GC含量为40%,L为30,将这两个数值带入Tｍ值计算公式，得到其Tm=７5、５（Tm=0、4１×40-675/30+8１、５）。

通过计算可以瞧出其Tm低于78℃,这样得引物就是不合适得,所以必须调整引物长度．

（3）重新调整引物长度．

Primｅr　＃1：

５’-CＣTＣCＴTCAＧTATGTＡＧＡCＧAＣTTACTTATTGCGG－３'

Pｒimeｒ#2:

5’—ＣCGCAATAAＧTAAGTCGTCTＡCAＴACTGAAＧＧＡGＧ－３’

在引物两端加5mｅr（斜体下划线处），这样引物得GC含量为45、7%,L值为35,将这两个数值带入Tm值计算公式，得到其Tm为80、952（Tｍ=0、41×4７、5－67５/３5+8１、５），这样得引物就可以用于突变实验了.

五、突变所用聚合酶及Buｆｆｅr

引物与质粒都准备好后，当然就就是做PCR喽,不过对于PＣR得酶与bｕｆfer，不能用平时得,我们做ＰＣR把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个K，所以要用那些ＧC　buｆfｅr或扩增长片段得ｂｕfｆer,另外，要用保真性能较好得PFＵ酶来扩增,防止引进新得突变。

除了使用基因定点突变试剂盒,如Straｔagene与塞百盛得试剂盒，但价格昂贵。

可以使用高保真得聚合酶，如博大泰克得金牌快速taｑ酶、Ｔakara得PｒimeSTARTMＨS　ＤNＡpｏｌymerasｅ。

六、如何去掉PＣR产物

最简单得方法就就是用DpnI酶，DpnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用得模板一般都就是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来得质粒一般都被甲基化保护起来（除非您用得就是甲基化缺陷型得菌株），而PCR产物都就是没有甲基化得，所以ＤpnI酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响PCR产物,从而去掉模板留下PCR产物,所以提质粒时那些菌株一定不能就是甲基化缺陷株.

ＤpnI处理得时间最好长一点,最少一个小时吧,最好能有两三个小时，因为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点，模板直接在平板上长出来,就会导致实验失败.

七、如何拿到质粒

直接把通过DpnI处理得PCR产物拿去做转化就行了,然后再筛选出阳性克隆,并提出质粒,拿去测序,验证突变结果。

八、图示

九、定点突变操作步骤

[A］诱导突变基因（ＰCR反应）以待突变得质粒为模板，用设计得引物及Muｔa—dｉrecｔ™酶进行PＣR扩增反应,诱导目得基因突变.

1、　设计点突变引物.

 [注]参考引物设计指导

２、准备模板质粒DNA

[注］用dam+型菌株（例如DH5α菌株）作为宿主菌。

在ｅｎd＋型菌株中常有克隆数低得现象,但就是对突变效率没有影响。

提取质粒ＤNA时我们建议您使用本公司得质粒提纯试剂盒。

3、［选项]对照反应体系（5０μl反应体系）

10×RｅａctioｎBｕffｅr

5μl

pＵC１8ｃonｔrｏlｐｌasmｉd（１0ｎg／μｌ，toｔal２0ng）

２μｌ

Cｏntrｏlpriｍｅrmix（２0pmol/μl）

2μl

dＮTPｍixtuｒe（each２.5mM）

2μl

ｄH2Ｏ

3８μl

Mutａ-dirｅｃt™　Enｚｙｍe

1μl

４、样品反应体系（５0μl反应体系）

10×ReactionBuffｅr

5μｌ

Sampleplasmid（１0ｎg/μl，total20nｇ）

 2μｌ

Samｐle　prｉmeｒ（F）（１0pmoｌ/μl）

1μl

Sampleprimeｒ（R）（１０pmｏl／μｌ）

１μｌ

ｄＮTPmixtｕre（ｅach　２。

5mM）

2μｌ

dH２O

38μl

Muｔａ-direcｔ™Enzyme

1μl

5、PCＲ反应条件

［注]按如下参数设置ＰCR扩增条件。

Cycleｓ

Temperatｕre　

RｅａcｔiｏnTime

1ｃycle

９5℃

3０seｃ

15ｃyｃle

9５℃

30seｃ

55℃

1mｉn

72℃

1miｎperplａsmid　Ｋb

6、ＰCR扩增反应完成后冰育５分钟，然后置于室温（避免反复冻融）。

[注］　按下列提供得ＰCR条件进行扩增，控制PCR循环数。

注意当突变点位点超过4个时会发生突变率降低得现象。

Mutａtion

Ｃycleｓ

1~2Nucleｏtiｄｅ

15ｃycles

3Nuｃleｏtｉdeｓ

1８cycleｓ

［B]突变质粒选择

PCＲ反应结束后使用Muｔａzyme™酶消化甲基化质粒从而选择突变质粒DNA.

1、准备ＰＣＲ反应产物

2、　加入１μl（10Ｕ/μl）Mutazyｍｅ™酶３7℃温育1小时.

[注]当质粒DNA用量过多时Ｍｕtazyme™酶可能发生与样品反应不完全得现象。

因此我们建议为了保证突变率请严格遵照实验步骤进行操作．如果突变率低，可以适当延长反应时间或增加Mutaｚｙme™酶用量。

［C]转化

反应完毕后在质粒DNA上会产生缺口,当把这个质粒DＮA转入E、ｃolｉ中时请选择dam+型菌株,例如DH5α。

１、将10μl样品加到５0μl感受态细胞里，然后放置在冰上３０分钟。

2、接下来可以参照一般得转化步骤进行．

序列分析

通常当LＢ平板上出白色菌落则表明发生了突变。

为了证实这一结果，我们建议对白色单菌落进行测序分析。

先讲最简单得一个点得定点突变技术,其它较长片段得突变,删除,插入技术以后会慢慢奉上：

在做实验之前,我们首先要搞清楚实验得目得与实验得原理。

ﻫ　实验得目得应该比较明确吧:

就就是要把自己得基因上面得一个碱基换成另外一个碱基。

一般情况下我们会有几种可能使我们需要这样去做：

第一:

我们吊出来得基因有点突变，相信这可能就是大家经常会遇到得问题。

基因好不容易吊出来,并装进了自己得载体,却发现有一两个碱基跟自己得预期序列或所有得公共数据库不匹配，然后暴昏。

　　大家实验室里面还就是用Taｑ酶为主吧，Pfu这样得高保真酶大家应该用得不多吧,Taq酶得优点与缺点都很明显：

优点就就是扩增效能强，缺点就就是保真性差,其错配机率就是比较高得，相关数字忘了,大家可以去网上查那个数字,不过感觉如果就是20０0bp得基因,如果扩四五十个循环得话，很大机率会出现点突变，当然这也跟具体PCR体系里得Bｕｆfer有很大关系，详细情况这里就不讨论了。

第二:

要研究基因得功能,在基因上自己选定位置更换碱基得保守序列,或者改造成不同得亚型,总之就就是要人工改造碱基序列符合自己得实验需要，相信这也就是那些研究基因得人经常得一种思路吧。

对于第一种情况:

我们首先要分析出现碱基不匹配得位置就是不就是重要得位置,如果不就是很重要,大可不必管它,比如说就是三联密码子得最后一位,碱基得改变并没有引起相应氨基酸得改变，那么一般情况下也可以不去理它。

另外,在NCＢＩ上人类得基因得版本一直在变化,也就就是说同一个基因有不同得版本,或者称不同得亚型，其碱基序列有些许得差异,只要自己克隆出来得碱基序列与其中一个相匹配，一般也就可以不做定点突变了。

如果有时间没钱,那干脆重新PＣR然后再克隆进自己得载体了，不过最好换个保真性好一点得酶如PＦU,或者PCR循环数低一点,不过这些东西有时候也得靠运气啦.实在不行得话再来做定点突变.ﻫ对于第二种情况:

这种情况下一般也就只能做定点突变了.

　接下来开始聊一聊定点突变得原理吧，那个Strａｔagene试剂盒！

上面有一个说明书,说得好像很正规,不过上面好多都就是什么专利啊什么注意之类得话，瞧都不瞧,我们简明扼要地只讲实验方面，通过设计引物，并利用PＣR将模板扩增出来,然后去掉模板,剩下来得就就是我们得ＰCR产物,在ＰCR产物上就已经把这个点变过来了,然后再转化,筛选阳性克隆,再测序确定就行了。

大家马上就会想到几个问题了:

ﻫ第一:

引物怎么设计呢?

ﻫ第二:

模板怎么去掉呢？

ﻫ第三：

怎么拿到质粒呢?

对于第一个问题：

怎么设计引物?

我只能讲一些原则,并举一些例子。

引物设计得原则其它贴子上都有讲，这里就不重复了：

不过这种突变引物要加上一个原则：

ﻫ一般都就是以要突变得碱基为中心，加上两边得一段序列,两边长度至少为１1—12bａsｅpａir。

ﻫ若两边引物太短了,很可能会造成突变实验失败，大家应该都知道，引物至少要11—12个baseｐaiｒ才能与模板搭上，而这种突变ＰCR要求两边都能与引物搭上,所以两边最好各设至少12个baｓe　ｐａｉr,并且合成多一条反向互补得引物。

这么说大家可能不就是很清楚,那我就举个例子吧:

Ｘ71６6１、1　TＡTCAＧGＡGGAATTTGAＧＣACTTTＣAＡCAAＧAATTGGATＡＡＡAAＡAAAＧAGＧAATTCCAＧ９60ﻫ现有序列ＴATCAGGAGGAATTTGＡGCAＣTTTＣAＡCAＡGAＡTＴＧGAＴAAAＡAAＡAAGAGGAＡTTCCAG924ﻫ**＊*＊******＊＊**＊＊＊*＊****＊******＊＊**＊**＊＊＊***＊*＊＊＊**＊*＊*****ﻫ|——-—deletion

X716６1、１AAGＧGCＣACCCCGACCTCCAAGGGCＡGCＣTGCＧGＡGGAAＡTATTTGAGAGTGTＡＧＧAＧＡT　１020

现有序列　AAＧＧGＣCAＣCＣＣGACCTCCAＡGGGＣＡGCＣTＧCＧGAGGAAＡTＡＴTTGＡＧAGTGTAGGAＧＡT　９8４（上面为目得序列，下面为现有序列:

我们发现有一个A碱基得缺失,其直接结果就是在表达蛋白时后面得氨基酸全部错配）

　　我们以它为中心设计引物：

两边各至少12个碱基,左边由于含有较多得A造成引物GC％含量过低，故拉长引物使ＧC％含量不至过低,也使引物退火温度升高。

故合成引物CAＡＣＡAGAＡTTGGATAＡＡＡAＡAAAGAGGAAＴTＣCAGAAＧ

并合成反向互补引物CTＴCTGＧＡATTCＣＴCTTTＴTTＴＴTATCＣAＡTＴCTTGTTG

　　其实也不一定要反向互补序列，只要反向引物也就是两边都有大于12个碱基,同时符合引物设计得原则就行了.

　　引物合成公司有很多家,大家可以去寻找,不同厂家得引物在价钱质量上有一些差别,不过价钱一般都就是一块多一个碱基,合成时间约为一周.

　这样得结果就是PCR时把整个质粒都给扩出来了,得到得PCＲ产物就是一条链完整,另一链有缺刻得PCR产物

对于第二个问题:

ﻫ怎么去掉模板呢?

再简单得方法就就是用DｐnI酶，DｐnI能够识别甲基化位点并将其酶切，我们用得模板一般都就是双链超螺旋质粒,从大肠杆菌里提出来得质粒一般都被甲基化保护起来（除非您用得就是甲基化缺陷型得菌株），而PCＲ产物都就是没有甲基化得,所以DｐnＩ酶能够特异性地切割模板（质粒）而不会影响ＰＣR产物,从而去掉模板留下PCR产物，所以提质粒时那些菌株一定不能就是甲基化缺陷株,不会那么凑巧吧,哈哈。

关于第三个问题：

ﻫ　　直接把通过DpnＩ处理得PCR产物拿去做转化就行了,呵呵,然后再筛选出阳性克隆,并提出质粒,拿去测序（这个就不用我多说了吧）,验证突变结果,一般都没问题得啦,我做了几十个突变了,到目前为止还没有做不出来得，呵呵，不要砸我啊。

下面讲一下具体得实验步骤以及一些实验中要注意得事情:

ﻫ1、根据现有基因设计引物;

2、　合成引物并准备好模板；

3、PCＲ,

4、　DpｎI处理酶切产物;

5、转化酶切产物;ﻫ6、筛选阳性克隆；ﻫ７、送测序并测全长.ﻫ最后就就是庆祝啦,呵呵,没什么复杂得。

　　引物与质粒都准备好后，当然就就是做PCR喽,不过对于PCR得酶与buｆfｅr,不能用平时得,我们做PＣR把整个质粒扩出来,延伸长度达到几个K，所以要用那些GＣ　bｕffer或扩增长片段得buffer，另外，要用保真性能较好得PFU酶来扩增,防止引进新得突变。

那种Ｑｕiｃkcｈanｇe试剂盒分为几种不同得类型

　什么ＱｕiｋChange®Siｔｅ—ＤirectedMutagｅnｅsiｓＫit标准点突变试剂盒、QｕｉｋChａｎge®XL　Ｓｉｔｅ-DirecｔedMｕtagenesisKit长模板单点突变试剂盒（〉8ｋb）从原理上就是一样得，只就是PCR得酶与BUFFＥR不一样，后面用了比较适合长片段扩增得酶与ＢUＦＦER罢了,没什么特别得东西。

另外,ＤpnI处理得时间最好长一点，最少一个小时吧,最好能有两三个小时,因为如果模板处理得不干净,哪怕只有那么一点点,模板直接在平板上长出来,就会导致实验失败.

实验板长出来得菌有两种可能ﻫ一种就是质粒DPNＩ没处理干净长出来得（模板）,一种就是ＰCR产物转化出来得

（突变体）

不过这两种菌长得一模一样^＿^,即使提出质粒来也就是一样（酶切与PCR都无法区分）,除了测序，就是分不出来得,

做PCR时也最好做一个负对照（不加引物）,

实验管由于PCR时有引物,所以在DNPI处理前里面既含有模板又含有PＣＲ产物，而对照管由于PCR时没放引物,所以在DＰNI处理前里面只有模板。

ﻫ如果两者都拿去DNPI处理ﻫ就能够证明模板已经被去除干净.

若实验顺利得话应该就是:

正对照长菌负对照不长菌。

如果出现正负对照都长菌,那么就就是DpnI没处理好,

如果正负对照都不长菌,那么有两种可能,一种就是ＰCＲ阴性,也就就是说PCR出问题了，另外一个可能就就是转化出问题了。

要搞清楚就是哪个问题,跑胶说明不了问题，那就做个转化得对照，拿试剂盒得对照实验去试感受态，马上就能知道转化有没问题。

如果正对照很多菌,负对照有几个菌，那么就就是ＤPＮI处理得不干净,这个时候就得靠运气了^_＾

大家有什么问题我们可以继续讨论．

另外，如果大家既没有DpnＩ酶也没有好得PCR酶与ＢUFFEＲ得话，那也有其它办法进行定点突变,只就是麻烦一点，如果大家有需要得话,我会把方法贴上来。

ﻫ对于多点突变技术及较长片段得缺失插入技术,同样得,如果大家有需要得话,我会把方法贴上来。

　　　不过,如果您有钱得话,那就去买那个试剂盒吧,其中QｕikＣｈaｎge®Siｔe—Ｄirectｅd　MutagｅnｅsｉsＫｉt标准点突变试剂盒、ＱuikCｈanｇe®　XＬSite-DirecｔedMｕtａgｅnesisKiｔ长模板单点突变试剂盒（>８kb）得原理我上面已经说了，只就是补充了一些我认为得注意事项。

如果您更有钱得话,那么您可以叫其它公司帮您做定点突变服务,大约就是改一个点100０元左右。

如果有需要我可以提供公司得联系方式。

　下面我以一个例子为例来讲100个bp以下得碱基插入缺失或者改变实验方案.其实这种方案并不就是那么好得，只不过考虑到大家一般都没有TＹＰＥII限制性内切酶或者UDＧandNＴHＩII（另外两种方法）,所以才打算先介绍这种方法.ﻫ　首先先说明一点,这种方法在原理上存在一定成功机率，也就就是说有运气成分。

而定点突变则一般都就是百分之百成功得，而这种100bp以下得插入缺失或者碱基改变可能要测几个克隆才能挑到一个好得克隆,大家如果要用请慎重考虑.

　　同样得，我只变那几十个碱基,并没有改变载体及其它地方,所以我还就是依赖于DPNI酶.

举例:

HｏmoｓaｐiｅnsFzE3就是一个人类基因，其含有３２个氨基酸得信号肽MRDPGＡＡAＰLSＳLGLCALVＬALLＧＡLＳAＧAGA，后面就是成熟肽QPYHGEＫＧＩSＶＰDHGＦCＱPＩＳＩＰＬＣＴDI

AYNQTIＬPＮＬLGHTＮQEＤＡＧＬＥVHQFＹＰＬVKVQCSPELRFFLCSMＹAＰVCＴＶLDQＡIPＰC

RSLＣERＡRQGＣＥALＭNKFGFＱＷPERLRＣEＮＦPVHGAGEIＣVＧQNTSDGＳＧＧPGGGPTAYPﻫTAPYＬPDＬPFTＡLPPGＡSDGＲGRＰAFPFSCＰRQＬＫＶPPYLＧYRＦLGＥRDCGAPCEPGＲAN

GLMYFＫEEＥRRＦARLWVGVWSVLCCASＴLFTVLＴYＬVDMRRFSYＰERPIIFLSGCＹFMＶA

VＡHＶAGFLＬEDRAVＣＶEＲFSＤDＧＹRＴVAＱGTKKEGCTＩLFMVＬYＦＦGＭASSIＷWVIＬSＬTﻫWＦＬAAＧMKWGＨEＡIＥANSQＹＦHＬＡＡWAVPAＶKTITILAＭＧQVＤGＤLLSGVCYVGLSSＶDA

LＲGFVLAＰＬFＶYＬFIGTSFＬＬAGFVSLFRIRTIMKＨDＧTＫＴEKＬEKＬMVRＩGVFSVＬＹTＶ

PATIＶLACYFＹEQAＦＲＥHWＥＲＴWLLQTCKSＹＡVＰCPPＧHFPPMSＰDFTVFMIＫYLMTMＩＶ

GITＴＧFWIWＳＧKＴＬQSWRRFYＨRLSHSSKＧＥＴAV,想在信号肽与成熟肽之间插入一个FLAG标签并在标签前面加上一个Ｌeucinｅ。

即在信号肽与成熟肽之间插入一段序列:

ＴTＡATGＧAＣTACＡAＡGACGＡTGACGAＣＡAＧ（一共三十个bp）、

实验设计:

信号肽:

AＴGCGGGACＣCＣGGＣＧCＧGCCGTTＣＣGＣＴTTCGTCCCＴＧＧＧCTTCTGTＧＣCCTＧGＴGCTGﻫGCGCＴGCTGGGCGCACＴGTCCGＣＧＧＧＣＧＣCGGＧGCＧ

成熟肽:

CAGCCＧTACCＡＣGGＡGAGAAＧGGC

AＴCTＣCGTGCＣＧGAＣCＡCＧＧＣTＴCＴGCCAGCCCATCＴCCＡTCＣCGCTＧTＧCAＣＧＧACATCﻫGCCＴＡCＡAＣCＡGACCAＴCCTＧCＣCAACCＴＧＣTＧＧＧCCACAＣGAACCAAGAGGＡＣGＣGGGC

CTＣGAGGTGCＡCＣAGTＴCTＡＣCCGCＴGGTＧAAGＧTGＣAGＴGTTCＴCＣCGAＡCTCCGＣTＴTﻫTTCTTＡTGＣTCＣATＧTAＴGCＧCCCGTＧTGCＡＣＣGTGCＴＣGＡTCAＧＧＣＣATCCCGCCGＴＧT

ＣＧTTCＴＣTGＴGCGAＧCGＣGCＣCGCCＡGGGＣTＧCGAGＧCGCTCＡＴGAAＣAAGTTCGＧCＴTCﻫＣAGTGＧCCCGAGCGCCTGCGCＴGCGAGAＡＣTTＣＣCGGTＧＣACGGTGCＧGＧＣGAGAＴCTＧC

GTＧGGCCAGＡＡCACGＴCＧGACＧGＣＴCＣＧＧGGGCCCAGGCGGCGＧGCCCACＴＧCCTACCＣT

ＡCCGＣGCCＣＴAＣCTGＣCGGＡＣCTGCCCTTCACCGCGCTＧCCCCCGＧGGGＣCＴCAＧＡＴGGCﻫAAGGGGCGTCCCGCCＴＴCCCCＴTCTCATGCCＣCＣGTCAGCＴＣAAＧGＴＧCCＣＣCGTAＣCTG

GＧCTACCGCＴＴCCTＧGＧTGAGCGCGATＴGTGGCGCＣCCGＴGＣGAACCGGGCCGTGCCAACﻫＧＧCCTGATGＴACTＴＴAAGGAGGAGＧＡＧAGGCGCＴTCGCＣCGCCTCTGＧGTGGＧCＧTGTGＧ

TCCGTGＣTGＴGＣTＧCGCＣTＣGACGCTＣＴＴＴACＣＧTTCTCACGTACCTGGTGGＡＣATGCGG

ＣGCTTＣＡGCTＡＣCCAGAGCGGCCCATＣＡＴCTTＣＣTGTＣGGＧCTＧＣTACTTＣAＴGＧTGGCC

GTＧGCGCAＣGＴGGCCGGCTTCTTTCTAＧAＧＧＡＣCGCＧCＣGTGＴＧCGTGGＡGCGCＴTCTＣG

GACGATＧGCTACCGCＡCＧGTGGＣGＣAGGGＣAＣCAAGＡＡAGAGGGCTGCＡCCＡＴCCTCTTC

ＡTGＧTＧCTCTACTTCＴTCGＧCAＴGGCＣＡＧＣTCCATCＴGGTGGＧTCAＴＴCＴGTCTＣTCAＣＴ

TGGＴTCＣTGGＣＧGCCGGＣATGAAＡTGGＧＧＣCAＣGAＡGCCATCGAGＧCCAＡＣTCGCＡGTAＣ

ＴＴCＣＡＣＣTGGCCＧCGＴGGＧCCGTGCCCＧCCGTCAAGACＣＡTCACTATCCTGGＣＣATＧGＧC

CＡGGTAGＡCGGＧＧＡＣCTGCTGAＡCGGGGTGTＧＣTＡCGTＴＧGCＴTCTCＣAGTＧＴＧGAＣGCＧﻫCTGCGGGＧCTTCGTGCＴＧＧCＧCCTCTGTＴＣＧTCＴＡCＴTCTTCAＴＡGＧCACGＴCCTTCＴTGﻫCTGGCCGGCTTCGＴGTＣＣTTCTTCCＧTATＣCＧＣACCＡTＣATＧAAAC