免疫组织化学免疫组化技术综述.docx

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免疫组织化学免疫组化技术综述

免疫组织化学（免疫组化）技术

利用抗原抗体的特异性结合反应来检测和定位组织或细胞中的某种化学物质的一门技术，它是免疫学和传统的组织化学相结合而形成的，这种技术称免疫组织化学（immunohistochemistryIHC）或免疫细胞化学（immunocytochemistry）。

其特点是将形态学改变与功能，代谢变化结合起来，直接在组织切片，细胞涂片或培养细胞爬片上定位一些蛋白质或多肽物质的存在，并可精确到亚细胞结构水平，结合电子计算机图像分析系统或激光扫描共聚焦显微术等技术，可对被检物质进行定量分析。

第一节免疫组化的发展史及应用

自1941年Coons及其同事首创免疫组织化学技术以来，拌随免疫学和组织化学理论与技术的发展，免疫组织化学已发生了日新月异的变化。

如下表

免疫组化的发展过程

年代

研究者

事件

1941

Coons

实用免疫萤光技术

1948

Fagraeus

进一步发展免疫萤光技术

1970

Sternberger

抗体酶标技术

1974

Taylor

证实组织中浆细胞免疫组化

1975

KohlerMilstein

单克隆抗体技术（被成为免疫学上的一场革命，也使人类第一次获得了能按照人的意志在体外产生抗体的杂交瘤细胞）。

1981

Hsu

ABC法

1990至今

SP法、原位杂交免疫组化技术

由于免疫组化具有特异性强、灵敏度高等显著特点，且能将形态与功能研究有机的结合在一起，所以，这门技术从一诞生起就显示出了强大的生命力和广阔的应用前景，现今它已被广泛地应用于生物学和医学研究的许多领域，推动了学科的发展，取得了令人瞩目的成就。

免疫组织化学染色技术的应用随着大量商品化的单克隆和多可隆抗体出现，配套试剂盒的使用及方法的不断完善，使免疫组化染色已经成为医学基础研究和病理外检中应用最为广泛的技术手段之一。

免疫组化可用于各种蛋白质或肽类物质表达水平的检测，细胞属性的判定，淋巴细胞的免疫表型分析，细胞增殖和凋亡的研究，激素受体和耐药基因蛋白表达检测，以及细胞周期和信号转导的研究等。

在病理学研究中，免疫组化技术的作用和意义更重要。

以肿瘤研究为例，在免疫组化技术出现以前，对肿瘤的诊断和分类还局限于细胞水平，而引入免疫组化技术后，则使研究的深度提高到了生物化学水平、分子水平。

近年来，拌随基因探针研究而兴起的核酸分子原位杂交技术也正在蓬勃发展，更使免疫组化如虎添翼，两者相得益彰，将研究推进到了基因水平。

越来越多的癌基因与抗癌基因的发现不仅有助于对肿瘤发生机制的探讨，而且使肿瘤的预防，早期诊断，甚至治疗都向前迈进了一大步，为人类征服癌症代来了希望的曙光。

在国外，病理诊断免疫组化开始于70年代，80年代发展至高峰，90年代已列入病理技术室常规工作。

在国内，免疫组化到90年代才开始在病理诊断中逐渐普及。

第二节免疫组化的基本原理

基本原理：

众所周知，抗体与抗原之间的结合具有高度的特异性。

免疫组织化学正是利用这一特性，即先将组织或细胞中的某种化学物质提取出来，以此作为抗原或半抗原，通过免疫后获得特异性的抗体，再以此抗体去探测组织或细胞中的抗原物质。

反之亦然。

由于抗体与抗原结合后形成的免疫复合物是无色的，因此，还必须借助于组织化学方法将抗原抗体反应部位显示出来，以期达到对组织或细胞中的未知抗原进行定性、定位甚至定量的研究。

如前所述，免疫组化主要涉及免疫学和组织化学的有关理论和技术，其中关键在于制备高效的抗体，后者又主要取决于抗原的质量。

组织或细胞中凡是能作抗原或半抗原的物质，如蛋白质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进行检测。

在抗体制备上，经历了从抗血清，纯化IgG到单克隆抗体，甚至发展到应用基因重组技术获得分子量较小的特异性片段。

就单克隆抗体而言，它是在1975年由Kohler和Milstein建立了杂交瘤技术后才开始问世的，现已被广泛应用于研究中，它具有更好的特异性，大大地提高了免疫组化的技术水平。

显示技术的发展也相当迅猛，早期只是简单的将标记物结合在抗体上，以后则发展到将标记物结合在抗抗体上或与抗体具有特异亲和性的分子上，用于标记的物质有很多种，如荧光染料、放射性同位素、酶、胶体金等。

借助于荧光显微镜、光学显微镜或电子显微镜，就可观察到这些标记物发出荧光、酶促反应产生的有色沉淀或高电子密度颗粒，从而观察到抗原抗体复合物所再的部位。

由此可见，免疫组化技术以其特异性和灵敏度高等特点，又因其操作比较简便而得以广泛应用。

第三节有关的免疫学理论

抗原（antigen）：

抗原应具备的条件：

①异物性

②理化性质

③特异性

抗原的种类：

①免疫原性与免疫反应性

完全抗原

不完全抗原

②抗原与机体的亲缘关系

异种抗原

同种异型抗原

自身抗原

③抗原的化学结构

蛋白质抗原

多糖抗原

核酸抗原

低分子量物质抗原

合成多肽抗原

④抗原的理化性状

颗粒性抗原

可溶性抗原

抗原的制备：

材料的准备和预处理

组织的粉碎

抗原的提取

抗原纯化

抗原纯度的检测

半抗原的免疫原制备法

抗体（antibody）

——是机体受抗原刺激后，由B淋巴细胞，特别是浆细胞分泌产生的一种能与相应抗原发生反应的球蛋白，称免疫球蛋白（immunolobulin,Ig）,共有五类：

IgG、IgA、IgM、IgD、IgE,主要分布在血清或外分泌物中。

抗体的分子结构

抗体的理化性质

抗体与抗原的特异性结合

抗体的种类

抗体的抗原性：

同种型抗体

同种异型抗体

独特型抗体

抗体的制备方法：

多克隆抗体（血清抗体）——指机体接受抗原的主动免疫或被动免疫后，从血清中分离提纯的抗体。

单克隆抗体——是1975年由Kohler和Milstein发明的一种

新技术。

原理是将体外培养的骨髓瘤细胞与免疫细胞融合，产生杂交细胞。

这种融合的杂交细胞系既有骨髓瘤细胞无限生长的能力，又有浆细胞分泌单一抗体的能力。

这种免疫细胞通过纯化，成为单克隆系，就能产生大量专一的高纯度的抗体，既单克隆抗体。

这一技术被称为免疫学上的一场革命，也使人类第一次获得了能按照人的意志在体外产生抗体的杂交瘤细胞。

（祥见图解）

单克隆抗体与多克隆的特性比较见下表:

单克隆抗体与多克隆的特性比较

特性

单克隆抗体

多克隆抗体

组成

特异性

亲合力

交叉反应

单一类的抗体

高，针对单一抗原决定簇

不定，较低

低

多种类抗体的混合物

低，针对多个抗原决定簇

平均亲和力较高

高

第四节免疫组化的基本技术

根据标记物（或示踪物）不同可分为以下技术：

免疫荧光组化技术

免疫酶组化技术

亲合免疫组化技术

免疫胶体金组化技术

免疫铁蛋白技术

还有双重和多重标记技术等。

不同的免疫组化技术，各具有独特的试剂和方法，但其基本技术方法是相似的，都包括抗体的制备，组织材料的处理，免疫染色，对照试验，显微镜观察等步骤。

（一）免疫荧光组化技术

1.基本原理

根据抗原抗体反应原理，先将已知的抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体作为探针与细胞或组织内相应抗原结合，在细胞或组织中形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本（荧光素受荧光显微镜激发光的照射而发出一定波长的荧光），从而可确定组织中某种抗原的定位，进而还可进行定量分析。

2.分类

直接法

间接法

补体法

双重免疫荧光标记法

1）直接法

——用荧光标记的特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（第一抗体）直接与标本反应（染色），以检测标本中相应的抗原。

如图

特点：

操作简单，特异性高，但敏感性低，且由于一种荧光标记抗体只能检测一种特异性抗原，所以应用范围较这窄。

染色步骤:

⒈石蜡切片常规脱蜡至水。

冰冻切片、涂片、印片或培养细胞等材料经适当固定。

⒉必要时用酶适当消化。

⒊用PH7.4PBS洗15分钟。

⒋滴加经适当稀释的荧光抗体，室温或37℃孵育箱内孵育30—60分钟。

⒌用PBS洗3次，5分钟/次。

⒍用50%甘油（用PH9.0碳酸盐缓冲液配制）封片

⒎荧光显微镜下观察。

2）间接法

——此法是直接法的重要改进，先用特异性（对细胞或组织内抗原）抗体（或称第一抗体）与细胞标本反应，随后用缓冲液洗去未与抗原结合的抗体，再用间接荧光抗体（也称第二抗体）与结合在抗原上的抗体（是第二抗体的抗原）结合，形成抗原—抗体—荧光抗体的复合物。

如图

由于结合在抗原抗体复合物上的荧光抗体显著多于直接法，从而提高了敏感性。

如细胞抗原上每个分子结合3～5个分子的抗体，当此抗体作为抗原时又可结合3～5个分子的荧光抗体，所以和直接法相比荧光亮度可增强3或4倍。

特点：

特异性强，灵敏度高，应用更广，只需要制备荧光标记的羊抗鼠或羊抗兔即可应用于多种抗体（第一抗体）的标记显示。

染色步骤：

⒈石蜡切片常规脱蜡至水。

冰冻切片、涂片、印片或培养细胞等材料经适当固定

⒉必要时用酶适当消化。

⒊用PH7.4PBS洗15分钟。

⒋滴加经适当稀释的未标记一抗，在室温或37℃孵育箱内孵育30～60分钟。

⒌用PBS洗3次，5分钟/次。

⒍滴加荧光标记二抗，在室温或37℃孵育箱内孵育30～60分钟。

⒎用PBS洗3次，5分钟/次。

⒏用50%甘油（用PH9.0碳酸盐缓冲液配制）封片

⒐荧光显微镜下观察。

3）补体法

——大多数抗原—抗体复合物都能结合补体。

因此，在染色时先将新鲜补体与第一抗体混合，同时加在抗原标本切片上，经37℃孵育后，如发生特异抗原抗体反应，补体就结合在抗原抗体复合物上，再用抗补体荧光抗体与结合的补体反应，形成抗原——抗体——补体——荧光抗体的复合物。

如图

特点：

只需一种荧光抗体，可适用于各种不同种属来源的第一抗体的检测。

染色步骤：

1石蜡切片常规脱蜡至水。

冰冻切片、涂片、印片或培养细胞等材料经适当固定

⒉必要时用酶适当消化。

⒊用PH7.4PBS洗15分钟。

⒋将抗血清60℃灭活20min，并作适当稀释。

⒌将新鲜豚鼠血清（其中含有补体）稀释10倍

⒍取等量抗血清和豚鼠血清混合，滴加在切片上，将切片置37℃孵育箱内孵育30～60分钟

⒎用PBS洗3次，5分钟/次。

⒏滴加经适当稀释的荧光标记抗补体抗体，在室温或37℃孵育箱内孵育30分钟。

⒐用PBS洗3次，5分钟/次。

⒑用50%甘油（用PH9.0碳酸盐缓冲液配制）封片

⒒荧光显微镜下观察。

4）双重免疫荧光标记法

——在同一细胞组织标本上需要同时检查两种抗原时要进行双重荧光染色，一般均采用直接法。

将两种荧光抗体（如抗A和抗B）以适当比例混合，加在标本上孵育后，按直接法洗去未结合的荧光抗体，抗A抗体用异硫氰酸荧光素标记，发黄绿色荧光；抗B抗体用四甲基异硫氰酸罗达明荧光素标记，发红色荧光，可以明确显示两种荧光抗原的定位。

3．对照实验与荧光抗体染色结果判断

（1）对照实验

为了保证免疫荧光组织化学染色的准确性，排除某些非特异性染色，必须在初次试验（新抗体首次使用）时进行以下对照实验。

免疫荧光染色的对照实

对照设置

直接法

间接法

抗补体法

标本自发荧光对照

★

★

★

阳性对照

★

★

★

荧光抗体对照

★

★

抑制试验

★

★

★

补体对照

★

自发荧光——组织不经过荧光染色，在紫外光或短光波的照射下，所呈的荧光称自发荧光。

一般自发荧光较弱，多呈蓝绿色或蓝白色，容易与特异性荧光相区别。

例：

胶原纤维蓝绿色

弹力纤维蓝绿色

软骨组织黄绿色

心肌黄绿色

红细胞黄色

标本自发荧光对照：

标本只加PBS或不加PBS，缓冲甘油封片，荧光显微镜观察应呈阴性荧光。

（无与特异性荧光相似的荧光）

阳性对照：

将以知阳性标本用免疫荧光组化技术染色（直接法、间接

法、补体法）结果应呈阳性荧光。

荧光抗体对照：

除不加一抗外，其他染色步骤相同，染色结果呈阴性

荧光。

（即标本只加荧光抗体染色）

抑制试验：

在加荧光标记抗体前或同时，加入未标记的相同抗体，染

色结果呈阴性或荧光减弱。

补体对照：

取新鲜豚鼠血器清1：

10稀释，先作用标本，洗后再用补体荧光抗体染色，结果呈阴性。

（2）特异性染色应具备的条件

1染色只限于特异性抗原。

2不应被荧光素结合的非免疫血清染色。

3用未标记的特异性免疫血清预先处理标本，则特异性染色被抑制；而用未免疫的血清预先处理，则不能抑制特异性染色。

4如果将荧光素标记抗体首先用相应的抗原充分吸收，则特异性染色被抑制；而如果使用无关的抗原进行吸收则不能抑制特异性染色。

4．荧光抗体的制备

荧光抗体的制备方法比较复杂，现在已有各种荧光抗体出售，所以，在这我们不讲。

但大家要知道荧光色素的一些种类，以便对免疫荧光染色结果的观察和判断。

目前主要常用的荧光色素有：

1）异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）呈现黄绿色荧光

2）四已基罗达明（terraethylrodemineB200，RB200）

呈现明亮橙红色荧光

3）四甲基异硫氰酸罗达明（tetramethylrhodamine

isothiocyanate，TRITC）呈现橙红色

4）4-乙酰胺-4-异硫氰酸-2-硫酸氏（SITS）呈蓝色荧光

5.荧光抗体的保存

以0～4℃或-20℃地低保存

6．荧光显微镜：

它是由超高压光源，滤板系统（包括激发光和压制滤板）和光学系统等主要部件组成。

是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统放大以观察标本的荧光图像。

使用注意事项：

1）严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作，不要随意改变程序。

2）应在暗室中进行检查。

进入暗室后，接上电源，点燃超高压贡灯5～15分钟，待光源发出强光稳定后，眼睛完全适合暗室，再开始观察标本。

3）防止紫外线对眼睛的损害。

在调整光源时应带上防护眼睛。

4）检查时间每次以1～2小时为宜，超过90分钟，超高压贡灯发光强度逐渐下降，荧光减弱，标本受紫外线照射3～5分钟后，荧光也明显减弱或退色，所以最多不超过2～3小时。

5）荧光显微镜光源寿命有限，标本应集中检查，以节省时间，保护光源。

天热时，应用电扇散热降温，新换灯泡应从开始就记录使用时间，灯熄灭后欲再启用时，须待灯光充分冷却后才能点燃。

一天中应避免数次点燃光源。

6）标本染色后立即观察，因时间久了荧光会逐渐减弱。

最好是在稍加观察后即显微摄影。

将标本放在聚乙烯塑料袋中4℃保存，可延缓荧光减弱时间，防止封裱剂蒸发。

7）载玻片厚度应为0。

8～1。

2毫米之间，盖玻片厚度在0。

17毫米左右，标本不能太厚，因太厚会使激发光大部分消耗在标本的下部，而物镜观察到的上部不能充分激发，此外细胞重叠会影响结果判断。

8）荧光亮度的判断标准：

（质量控制和结果解释）

“－”——无或可见微弱自发荧光

“＋”——仅能见明确可见荧光

“＋＋”——可见明亮的荧光

“＋＋＋”——可见耀眼的荧光

（二）免疫酶组织化学技术（免疫酶细胞化学技术）

免疫酶组织（细胞）化学是继免疫荧光后，于60年代发展起来的技术。

1．基本原理：

先以酶标记的抗体与组织或细胞作用，然后加入酶的底物，生成有色的不溶性产物或具有一定电子密度的颗粒，通过光镜或电镜，对细胞表面和细胞内的各种抗原成分进行定位研究。

●常用标记酶的种类：

辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase，HRP）

碱性磷酸酶（alkalinephosphatase，AKP、ALP、AP）

酸性磷酸酶（acidphosphatase，ACP）

葡萄糖氧化酶（glucoseoxidase，GOD）

目前，用的最多的酶是HRP，AKP

●用于标记酶的要求：

1.酶催化的底物必须是特异的，且容易被显示，所形成的产物易于光镜或电镜下观察。

2.所形成的终产物沉淀必须稳定，即终产物不能从酶活性部位向周围组织弥散，影响组织学定位。

3.获得的酶分子，最好有商品出售。

4.中性PH值时，酶应稳定，酶标记抗体后，活性不应改变，且酶的活性越高越好。

5.酶标过程中，酶与抗体连接，不影响二者的活性。

6.被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶

其中1.,2.两点最重要。

因为并非容易显示的酶均有形成不可溶性的复合物。

一般认为，辣根过氧化物酶（HRP）较佳，是最常用的一种酶。

●酶标抗体的制备及纯化：

略

●酶的底物及沉淀颜色：

见下表

酶

底物

沉淀颜色

HRP

AKP

DAB（3，3--二氨基联苯胺）+H2O2

AEC（3氨基--9—乙基卡巴唑）+H2O2

NBT（四氮唑蓝）+5—嗅--4氯—3吲哚--磷酸盐

棕色

红色

蓝色

●免疫酶技术与免疫荧光技术不同在于：

①可用普通显微镜代替荧光显微镜，易于推广

②切片不易退色，可长期保存

③阳性细胞定位精确，较易与非特异性反应鉴别，因此判断容易，主观性少

④组织结构清晰，可与HE切片对照观察

⑤可作免疫电镜超微结构观察

2．分类：

直接法

间接法

补体法

免疫酶桥法

免疫酶双桥法

过氧化物酶抗过氧化物酶法（PAP）

双PAP法等

1）直接法

原理：

用酶直接标记在特异性一抗上，与标本中的抗原结合，让酶催化底物反应产生有色产物，沉淀在抗原—抗体反应部位，即可在镜下对标本中的抗原进行检测。

优点：

简便，快速，特异。

缺点：

敏感性差，标记一种抗体只能检测一种抗原，所以应用受限制。

染色步骤：

1切片按免疫组化常规处理

20.3%H2O2甲醇。

室温10～30分钟

3必要时，如石蜡切片用0.1%胰蛋白酶消化，37℃10～30分钟，PBS洗

41∶20正常血清，室温孵育15分钟

5滴加适当稀释的酶标一抗，室温或37℃，孵育30～60分钟

6PBS洗3次，每次5分钟

7加酶的底物溶液，5～10分钟，显微镜下观察，至特异性染色清晰，背景无染色时，终止显色。

8苏木素衬染，脱水，透明，封片。

　　　　　２）间接法

　　　　　　　原理：

在间接法中先用未标记的特异性一抗与标本中相应抗原结合，再用酶标记的抗球蛋白抗体（二抗）结合，然后再加酶的底物显示抗原－—抗体——抗抗体复合物存在的部位，以对抗原进行检测。

　　　　　　　优缺点：

提高了敏感性，而且用一种酶标记一种抗体就可检测多种抗原，因此较直接法使用广，但其较费时，非特异性染色较多。

　　　　　　　染色方法：

⒈切片按免疫组化常规处理

⒉0.3%H2O2甲醇。

室温，10～30分钟

⒊必要时，如石蜡切片用0.1%胰蛋白酶消化，37℃10～30分钟，PBS洗

⒋1∶20正常血清，室温孵育15分钟

⒌滴加适当稀释的特异性一抗于标本上，室温或37℃，孵育30～60分钟

⒍PBS洗3次，每次5分钟

⒎滴加适当稀释的酶标二抗于标本上，室温或37℃，孵育30～60分钟

⒏PBS洗3次，每次5分钟

⒐加酶的底物溶液，5～10分钟，显微镜下观察，至特异性染色清晰，背景无染色时，终止显色。

⒑苏木素衬染，脱水，透明，封片。

　以上两种方法都是通过化学方法将酶直接标记在抗体上，所以通称为酶标抗体法。

　　　　　３）酶桥法

　　　　　　　　　在酶标记抗体过程中，酶与抗体的化学反应交联过程可影响酶

的活性和抗体的效价，同时产生非特异酶标记抗体，可增加非

特异性背景染色，为了避免上述缺点，相继发展了酶桥法和

PAP法。

它们是以酶为抗原免疫动物，产生抗酶抗体，通过酶

与抗体的特异性结合进行标记，属于非酶标记的抗体酶法。

原理：

先用酶作为抗原免疫动物，制备效价高，特异性强的抗酶抗体，然后以二抗为桥梁，将在组织中与抗原结合的一抗与酶抗体连接起来，再将酶结合在抗酶抗体上，经酶的底物显示出抗原的分布。

如图

●第一抗体（假设来自种属A）孵育60分钟，37℃。

第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合，较牢固，振洗时不易丢失。

●切片与第二抗体（桥抗，抗种属AIgG抗体）孵育1小时37℃。

应用过量的桥抗体能保证一个Fab段与第一抗体结合，另一个Fab段游离。

●切片与抗酶抗体（来自种属A）孵育1小时37℃。

因抗酶抗体和第一抗体均系种属AIgG，具有相同的抗原性，所以桥抗体游离的Fab能与抗酶抗体结合，起到桥的作用，将抗酶抗体结在与组织抗原结合的第一抗体上。

●切片与酶（HRP）孵育30分钟，酶与抗酶抗体结合。

●显色

优缺点：

在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连接对抗体和酶活性的损害，提高方法敏感性，又能节省第一抗体的用量。

但其最大的缺点是抗酶抗体必须高度纯化。

因为抗酶抗体中非特异性抗体不能与酶结合，但能与抗酶抗体竞争桥抗体的结合位点，从而减少了抗酶抗体的结合，而大幅度降低呈色能力。

另外，抗酶抗体的酶结合是低亲和力的，冲洗时易丢失而降低其敏感性。

染色步骤：

⒈切片按免疫组化常规处理

⒉0.3%H2O2甲醇。

室温，10～30分钟

⒊必要时，如石蜡切片用0.1%胰蛋白酶消化，37℃10～30分钟，PBS洗

⒋1∶20正常血清，室温孵育15分钟

⒌滴加适当稀释的特异性一抗于标本上，室温或37℃，孵育30～60分钟

⒍PBS洗3次，每次5分钟

⒎加适当稀释的二抗，37℃或室温，孵育30分钟

⒏PBS洗3次，每次5～10分钟

⒐加抗酶抗体，室温或37℃，30分钟

⒑PBS洗3次，每次5～10分钟

⒒加酶溶液，37℃，孵育30分钟

⒓酶的底物显色

⒔衬染，脱水，透明，封片。

4）PAP法

原理：

与酶桥法相似，都是借助桥抗体将酶连结在组织抗原结合的第一抗体上，所不同的是先将抗酶抗体与酶结合制成酶——抗酶复合物（PAP），PAP复合物中的抗酶抗体和第一抗体为同种属动物的IgG，所以桥抗体能够作为“桥”将PAP复合物连结在第一抗体上。

如图

PAP复合物：

是离体制备的HRP抗HRP复合物，它的制备方法较多，在这不介绍。

PAP复合物为五边形环状结构，这种结构极为稳定，冲洗时酶分子不会脱落，从而大大提高了PAP法的灵敏度，约比免疫荧光法敏感100～1000倍。

比酶桥法灵敏20倍。

优缺点：

灵敏度高，PAP背景染色低，但制备较复杂。

染色步骤：

⒈切片按免疫组化常规处理

⒉0.3%H2O2甲醇。

室温，10～30分钟

⒊必要时，如石蜡切片用0.1%胰蛋白酶消化，37℃10～30分钟，PBS洗

⒋1∶20正常血清，室温孵育15分钟

⒌滴加适当稀释的特异性一抗于标本上，室温或37℃，孵育30～60分钟

⒍PBS洗3次，每次5分钟

⒎加适当稀释的二抗，37℃或室温，孵育30分钟

⒏PBS洗3次，每次5～10分钟

⒐加PAP复合物，室温或37℃，孵育30分钟

⒑PBS洗3次，每次5～10分