基因工程的基本操作程序.docx
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基因工程的基本操作程序
1.2基因工程的基本操作程序
1.2基因工程的基本操作程序
教学过程
教学内容
教学手段
和方法
预期
目标
1.课前预习，引入对基因工程的基本操作程序的学习。
2.学习目的基因的获取
2.1从基因文库中获取目的基因
2.2利用PCR技术扩增目的基因
3.学习基因表达载体的构建
4.将目的基因导入受体细胞
4.1将目的基因导入植物细胞
4.2将目的基因导入动物细胞
4.3将目的基因导入微生物细胞
5.学习目的基因的检测与鉴定
6.布置作业
课前准备：
通过预习解决以下问题
1、基因工程的基本操作程序主要包括哪几个步骤？
2、试分析每一步骤的必要性。
师：
通过预习同学们都能解决第一个问题，基因工程的基本操作程序包括……
生：
目的基因的获取、基因表达载体的构建、将目的基因导入受体细胞、目的基因的检测与鉴定。
师：
第二个问题我们可以将它拆分成四个小问题逐个儿解决：
1、为什么要有“目的基因的获取”这一步？
先请一个同学将基因工程的原理告诉大家。
生：
基因工程是指按照人们的愿望，进行严格的设计，通过体外DNA重组和转基因等技术，赋予生物以新的遗传特性，创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品。
师：
这既是基因工程的原理又是其概念，通过这一表述中的“创造出更符合人们需要的新的生物类型和生物产品”你得出什么样的信息？
生：
这是基因工程的优点也是基因工程的目的，可以实现这一目标的只有目的基因，有了目的基因我们才能赋予一种生物以另一种生物的遗传特性。
师：
很好，良好的开端等于成功的一半，我们继续往下分析
2、为什么要有“表达载体的构建”这一步？
生：
构建表达载体的目的是为了使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传给下一代，同时使目的基因能表达和发挥作用。
（教材P11）
师：
看来同学们课前已经进行了精心预习了，那么第三步“目的基因导入受体细胞”它又是出于什么目的呢？
生：
单独的DNA片段──目的基因是不能稳定遗传的，含有目的基因的表达载体只有进入受体细胞，并且维持稳定和表达，才能实现一种生物的基因在另一种生物中的转化。
（教材P12）
师：
最后一步“目的基因的检测与鉴定”呢？
生：
这是因为目的基因是否真正插入受体细胞的DNA中，是否能够在受体细胞中稳定遗传和正确表达，只有通过检测、鉴定才能得知。
（教材P13）
师：
看来基因工程的每个操作步骤都是必不可少的，下面我们按照基因工程的操作步骤，对每一程序的相关技术和方法进行学习
一、目的基因的获取
通俗地讲就是将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。
阅读教材9～11页相关内容，回答下列问题：
1、什么是目的基因，举例说明。
生：
目的基因主要是指编码蛋白质的结构基因，例如，与生物抗逆性有关的基因、与优良品质相关的基因、与生物药物和保健品有关的基因、与毒物降解有关的基因，以及与工业所需用酶相关的基因等。
师：
同样目的基因还可以是一些具有调控作用的因子。
目前被较广泛提取使用的目的基因有：
苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮藏蛋白基因、植物抗病基因等。
师：
获得目的基因的方法有哪些？
生：
可以从基因文库中获取目的基因，还可以利用PCR技术扩增目的基因。
师：
什么是基因文库？
生：
将含有某种生物不同基因的许多DNA片段，导入受体菌的群体中储存，各个受体菌分别含有这种生物的不同的基因，称为基因文库。
师：
什么是部分基因文库？
生：
只含有一种生物的一部分基因，这样的基因文库叫做部分基因文库。
师：
基因文库包含了某种生物的全部基因，又可称为基因组文库，如果将每个基因看成一本书则基因文库就可以比喻成国家图书馆，这里的资料既多又齐全，而部分基因文库只包含了该生物的部分基因，如，cDNA文库，因此部分基因文库只能比喻成某个市或单位的图书馆。
阅读教材P11的生物技术资料卡，比较cDNA文库和基因组文库的区别。
师：
怎样从基因文库中得到我们所需的目的基因？
生：
根据基因的核苷酸序列、基因的功能、基因在染色体上的位置、基因的转录产物mRNA，以及基因翻译产物蛋白质等特性来获取目的基因。
师：
很好。
除了这种方法我们还可以利用PCR技术扩增目的基因。
PCR是聚合酶链式反应（polymerasechainreaction）的缩写，是一项再生物体外复制特定DNA片段的核酸合成技术。
通过此技术，可获取大量的目的基因。
通过阅读教材完成下列填空。
原理：
（DNA的复制）
条件：
（已知基因的核苷酸序列，四种脱氧核苷酸，一对引物，DNA聚合酶）
方式：
以（指数）方式扩增，即（2n）（n为扩增循环的次数）
结果：
（使目的基因的片段在短时间内成百万倍地扩增）
过程：
a、DNA变性（90℃-96℃）：
目的基因DNA受热变性，（氢键断裂），形成（DNA单链）。
b、退火（复性25℃-65℃）：
系统温度降低，（引物）与（DNA模板）结合，形成局部双链。
c、延伸（70℃-75℃）：
合成链在（DNA聚合酶）作用下进行延伸，合成与模板互补的DNA。
师：
此外，如果基因比较小，核苷酸序列又已知，也可以通过DNA合成仪用化学方法直接人工合成。
二、基因表达载体的构建
这是实施基因工程的第二步也是基因工程的核心。
1.用一定的_________（限制酶）切割质粒，使其出现一个切口，露出_________（黏性末端）。
2.用_____________（同一种限制酶）切断目的基因，使其产生__________（相同的黏性末端）。
3.将切下的目的基因片段插入质粒的______（切口）处，再加入适量_______（DNA连接酶），形成了一个重组DNA分子（重组质粒）
师：
看图1-10基因的表达载体模式图总结基因表达载体的组成。
生：
基因表达载体是由复制原点，目的基因，启动子，终止子，标记基因
师：
它们各自的作用是什么呢？
生：
启动子是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，它是RNA聚合酶识别和结合的部位，有了它才能驱动基因转录出mRNA，最终获得所需要的蛋白质。
生：
终止子位于基因的尾端，是一段特殊结构的DNA短片段，使转录在所需要的地方停止下来。
生：
标记基因的作用是为了鉴别受体细胞中是否含有目的基因，从而将含有目的基因的细胞筛选出来。
师：
并不是所有的基因表达载体都是一样，根据受体细胞的不同它们也会有相应的变化。
三、将目的基因导入受体细胞
师：
将目的基因导入受体细胞的方法，目前开发出来的已有很多种，每种方法都有其利弊，适合于不同的受体细胞，在具体实施过程中，究竟选哪种方法，要根据具体情况而定。
1、将目的基因导入植物细胞
常用的方法有农杆菌转化法、基因枪法、花粉管通道法，阅读教材P12回答下列问题：
你能说说农杆菌转化法的大概过程吗？
根据农杆菌可将目的基因导入双子叶植物的机理，你能分析出农杆菌不能将目的基因导入单子叶植物的原因吗？
生：
根瘤农杆菌具有趋化性，即植物的受伤组织会产生一些糖类和酚类物质吸引根瘤农杆菌向受伤组织集中，而研究表明这种物质是在双子叶植物的细胞壁中合成的，通常不存在于单子叶植物中，这也是单子叶植物不被根瘤农杆菌侵染的原因。
如果想将一个抗病基因导入单子叶植物，理论上你认为该怎么做？
生：
①选择合适的农杆菌菌株，②加趋化和诱导的物质使农杆菌向植物受伤组织靠拢。
2、将目的基因导入动物细胞
显微注射技术是转基因动物中采用最多，也是最为有效的一种将目的基因导入动物细胞的方法。
3、将目的基因导入微生物细胞
思考：
为什么选用微生物作为受体细胞？
生：
原核生物具有一些其他生物没有的特点：
繁殖快，多为单细胞、遗传物质相对较少等，因此，早期的基因工程都用原核生物作为受体细胞。
师：
大肠杆菌细胞最常用的转化方法是:
首先用Ca2+处理细胞,以增大细菌细胞壁的通透性,使细胞处于一种能吸收周围环境中DNA分子的生理状态,这种细胞称为感受态细胞.
第二步是将重组表达载体DNA分子溶于缓冲液中与感受态细胞混合,在一定的温度下促进感受态细胞吸收DNA分子,完成转化过程.
第二步目的基因在受体细胞内，随其繁殖而复制，由于细菌繁殖的速度非常快，在很短的时间内就能获得大量的目的基因。
思考：
为什么要用Ca2＋处理细胞？
生：
因为大肠杆菌等细菌的细胞壁成分主要是肽聚糖，因此一般要先用Ca2＋处理，以增加细菌细胞壁的通透性。
四、目的基因的检测与鉴定
师：
受体细胞摄入DNA分子后就说明目的基因完成了表达吗？
生：
不能，受体细胞必须表现出特定的性状，才能说明目的基因完成了表达。
师：
这是基因工程的最后一步也是检查基因工程是否做成功的一步。
它可以从以下三个是方面进行检测：
检测转基因生物的染色体DNA上是否插入了目的基因，一般采用的方法是DNA分子杂交。
采用一定的技术手段，将两种生物的DNA分子的单链放在一起，如果这两个单链具有互补的碱基序列，那么，互补的碱基序列就会结合在一起，形成杂合双链区；在没有互补碱基序列的部位，仍然是两条游离的单链。
检测目的基因是否转录出mRNA方法是分子杂交。
检测目的基因是否翻译成蛋白质进行抗原—抗体杂交。
作业：
1.教材15页“思考与探究”第4题
2.教材11页“寻根问底”
学生讨论。
引导大家思考。
赞扬也是教育的一种方式。
学生讨论。
讨论中及时发现有创新思维的学生，鼓励发表意见。
学生再次议论。
及时鼓励学生。
学生看书。
教师点拨。
学生看插图。
学生看书。
学生看书，接着议论。
。
。
看书学习。
学生讨论。
将局部问题整合到实际工作的全过程中思考。
学生归纳。
学生结合插图寻找
分析插图
看书学习。
教师点拨
学生讨论，讨论中及时发现有创新思维的学生，鼓励发表意见。
教师点拨
加强预习环节
使学生认识每一步骤的必要性
。
将直白的教学内容变得有思维力度。
以上教学也是将四个操作过程整合到一个完整的过程之中
引导学生对基因组文库和部分基因文库作对比，在比较中加深认识。
让文字与插图结合，使抽象的文字在直观的插图中得以体现。
提高学生思维的深刻性。
解决本课的难点。
以填空的形式，诱导思考，解决难点。
利用插图加深对载体必须具备条件的认识。
培养学生的归纳能力。
体现基础知识的准确运用。
在运用中加深对基础知识的深层次理解
培养思维的广阔性。
以上教学改变直白的教学方式，通过诱思，提高学生的思维能力。
经典例题剖析
［例1］下列有关基因工程技术的正确叙述是
A．重组DNA技术所用的工具酶是限制酶、连接酶和运载体
B．所有的限制酶都只能识别同一种特定的核苷酸序列
C．选用细菌作为重组质粒的受体细胞是因为细菌繁殖快
D．只要目的基因进入了受体细胞就能成功实现表达
【解析】基因操作的工具有限制酶、连接酶，一种限制酶只能识别特定的核苷酸序列。
运载体是基因的运输工具，目的基因进入受体细胞后，受体细胞表现出特定的性状，才说明目的基因完成了表达，基因工程的结果是让目的基因完成表达，生产出目的基因的产物，选择受体细胞的重要条件就是能够快速繁殖。
【答案】C
［例2］应用基因工程技术诊断疾病的过程中必须使用基因探针才能达到探测疾病的目的。
基因探针是指
A．用于检测疾病的医疗器械
B．用放射性同位素或荧光分子等标记的DNA分子
C．合成β—球蛋白的DNA
D．合成苯丙羟化酶DNA片段
【解析】基因诊断是用放射性同位素、荧光分子等标记的DNA作探针，利用DNA分子杂交原理，鉴定被检测标本上的遗传信息，达到检测疾病的目的。
基础试题训练
1、构建基因组DNA文库时，首先雷分离细胞的
A、染色体DNA B、线粒体DNA C、总mRNA D、tRNA
2．在基因工程中，把选出的目的基因（共1000个脱氧核苷酸对，其中腺嘌岭脱氧核苷酸是460个）放入DNA扩增仪中扩增4代，那么，在扩增仪中应放入胞嘧啶脱氧核苷酸的个数是（）
A.540个B.8100个C.17280个D.7560个
2．在基因工程中，科学家常用细菌、酵母菌等微生物作为受体细胞，原因是（）
A.结构简单，操作方便B.遗传物质含量少
C.繁殖速度快D.性状稳定，变异少
3．因工程的操作步骤：
①使目的基因与运载体相结合，②将目的基因导入受体细胞，③检测目的基因的表达是否符合特定性状要求，④提取目的基因，正确的操作顺序是（ ）
A．③②④① B.②④①③ C．④①②③ D．③④①②
4．工程是在DNA分子水平上进行设计施工的，在基因操作的基本步骤中，不进行碱基互补配对的步骤是（ ）
A．人工合成基因 B．目的基因与运载体结合
C．将目的基因导入受体细胞D．目的基因的检测和表达
5．就分于结构而论，质粒是
A、环状双链DNA分子 B、环状单链DNA分于
C、环状单链RNA分子 D、线状双链DNA分子
6．聚合酶链反应可表示为
A、PEC B、PER C、PDR D、PCR
7．在已知序列信息的情况下，获取目的基因的最方便方法是
A、化学合成法 B、基因组文库法
C、CDNA文库法 D、聚合酶链反应
8．有关基因工程的叙述正确的是（ ）
A.限制性内切酶只在获得目的基因时才用
B.重组质粒的形成在细胞内完成
C.质粒都可作运载体
D.蛋白质的结构可为合成目的基因提供资料
9．不属于目的基因与运载体结合过程的是（）
A．用一定的限制酶切割质粒露出黏性末端
B．用同种限制酶切割目的基因露出黏性末端
C.将重组DNA导入受体细胞中进行扩增
D．将切下的目的基因插入到质粒切口处
10．科学家通过基因工程的方法，能使马铃薯块茎含有人奶蛋白。
以下有关该基因工程的叙述错误的是
A．采用反转录的方法得到的目的基因
B．基因非编码区对于目的基因在块茎中的表达是不可缺少的
C．马铃薯的叶肉细胞可作为受体细胞
D．用不同种限制酶处理质粒和含有目的基因的DNA，可产生黏性末端而形成重组DNA
分子
11．基因工程常用的受体细胞有
①大肠杆菌②枯草杆菌③支原体④动植物细胞
A．①②③④B．①②③
C．②③④D．①②④
12．用DNA探针检测饮用水中病毒的具体方法是
A．与被检测病毒的DNA碱基序列进行比较
B．与被检测病毒的DNA碱基序列进行组合
C．与被检测病毒的DNA碱基序列进行杂交
D．A、B、C三种方法均可
13．1976年，美国的H.Boyer教授首次将人的生长抑制素释放因子的基因转移到大肠杆菌，并获得表达，此文中的“表达”是指该基因在大肠杆菌（）
A．能进行DNA复制B.能传递给细菌后代
C.能合成生长抑制素释放因子D.能合成人的生长素
14．在遗传工程技术中，限制性内切酶主要用于（）
A．目的基因的提取和导入
B．目的基因的导入和检测
C．目的基因与运载体结合和导入
D．目的基因的提取和与运载体结合
15、（05广东）以下有关基因工程的叙述，正确的是
A.基因工程是细胞水平上的生物工程
B．基因工程的产物对人类全部是有益的
C．基因工程产生的变异属于人工诱变
D．基因工程育种的优点之一是目的性强
16．（多选）一个基因表达载体的构建应包括（）
A．目的基因B．启动子C．终止子D．标记基因
创新应用训练
1、在药品生产中，有些药品如干扰素，白细胞介素，凝血因子等，以前主要是从生物体的组织、细胞或血液中提取的，由于受原料来源限制，价价十分昂贵，而且产量低，临床供应明显不足。
自70年代遗传工程发展起来以后，人们逐步地在人体内发现了相应的目的基因，使之与质粒形成重组DNA，并以重组DNA引入大肠杆菌，最后利用这些工程菌，可以高效率地生产出上述各种高质量低成本的药品，请分析回答：
（1）在基因工程中，质粒是一种最常用的，它广泛地存在于细菌细胞中，是一种很小的环状分子。
（2）在用目的基因与质粒形成重组DNA过程中，一般要用到的工具酶是
和。
（3）将含有“某激素基因”的质粒导入细菌细胞后，能在细菌细胞内直接合成“某激素”，则该激素在细菌体内的合成包括和两个阶段。
（4）在将质粒导入细菌时，一般要用处理细菌，以增大。
2、下图是将人类的生长激素基因导入细菌B细胞内制造“工程菌”的示意图，所用的载体为质粒A。
已知细菌B细胞内不含质粒A，也不含质粒A上的基因，质粒导入细菌B后，其上的基因能得到表达。
请回答下列问题：
（注：
质粒中的a点即是四环素抗性基因的存在位置，又是与目的基因的结合点；斜线部分为抗氨苄青霉素基因）
（1）人工合成目的基因的途径一般有哪两条？
（2）如何将目的基因和质粒结合成重组质粒？
（3）目前把重组质粒导入细菌细胞时，效率还不高，导入完成后得到的细菌，实际上有的根本没有导入质粒，有的导入的是普通质粒A，只有极少数导入的是重组质粒。
可通过以下步骤鉴别得到的细菌是否导入了质粒A或重组质粒；将得到的细菌涂布在一个含有氨苄青霉素的培养基上，能够生长的就是导入了质粒A和重组质粒的细菌，反之则没导入。
使用这种方法鉴别的原因是什么？
（4）若把通过鉴定证明导入了普通质粒A或重组质粒的细菌放在含有四环素的培养基上培养，发生的现象是什么？
（5）导入细菌B细胞的目的基因成功表达的标志是什么？
３、科学家通过基因工程培育抗虫棉时，需要从苏云金芽孢杆菌中提取出抗虫基因，“放入”棉花的细胞中与棉花的DNA结合起来并发挥作用，请回答下列有关问题：
（1）从苏云金芽孢杆菌中切割抗虫基因所用的工具是 ，此工具主要存在于 中，其特点是 。
（2）苏云金芽孢秆菌一个DNA分子上有许多基因，获得抗虫基因常采用的方法是“鸟枪法”。
具体做法是：
用 酶将苏云金芽孢杆菌的 切成许多片段，然后将这些片段 ，再通过 转入不同的受体细胞，让它们在各个受体细胞中大量 ，从中找出含有目的基因的细胞，再用一定的方法把 分离出来。
（3）进行基因操作一般要经过的四个步骤是 、 、 、 。
基础试题训练
1、A2、C3、C4、C5、A6、D7、D8、D9、C10、D
11、【解析】基因工程常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌、酵母菌和动植物细胞。
答案：
D
12、【解析】用DNA探针检测饮水中病毒的具体方法是使用一个特定的DNA片段制成探针，与被检测的病毒DNA杂交，从而检测出饮用水中病毒来。
答案：
C
13、C14、Ｄ15、Ｄ １６、ＡＢＣＤ
【答案】
创新应用训练
1、
（1）基因的运载体DNA
（2）限制性内切酶DNA连接酶（3）转录翻译
（4）氯化钙细菌细胞壁的通透性
2、【解析】此题是对基因操作“四步曲”比较全面的考查，而且注意联系实际。
（1）据课本内容知人工合成基因的两条途径是：
①将从细胞中提取分离出的目的基因作为模板，转录成mRNA
单链DNA
双链DNA；②据蛋白质中氨基酸序列
mRNA中碱基序列
DNA碱基序列
目的基因。
（2）将目的基因和质粒结合形成重组质粒的过程是：
①用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有粘性末端的切口；②用同种限制酶切割目的基因，产生相同的粘性末端；③将切下的目的基因片段插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。
（3）检测质粒或重组质粒是否导入受体细胞，均需利用质粒上某些标记基因的特性。
即对已经做了导入处理的、本身无相应特性的受体细胞进行检测，根据受体细胞是否具有相应的特性来确定。
抗氨苄青霉素基因在质粒A和重组质粒上，且它与目的基因是否插入无关，所以，用含氨苄青霉素这种选择培养基培养经导入质粒处理的受体细胞，凡能生长的则表明质粒导入成功；不能生长的则无质粒导入。
（4）抗四环素基因不仅在质粒A上，而且它的位置正是目的基因插入之处，因此当目的基因插入质粒A形成重组质粒时，此处的抗四环素基因的结构和功能就会被破坏，含重组质粒的受体细胞就不能在含四环素的培养基上生长，而质粒A上无目的基因插入的，抗四环素基因结构是完整的，这种受体细胞就能在含四环素的培养基上生长。
（5）基因成功表达的标志是受体细胞通过转录、翻译合成相应的蛋白质，即人的生长激素。
【答案】
（1）①将从细胞中提取分离出的目的基因作为模板，转录成mRNA
单链DNA
双链DNA；②据蛋白质中氨基酸序列
mRNA中碱基序列
DNA碱基序列
目的基因。
（2）①用一定的限制酶切割质粒，使其出现一个有粘性末端的切口；②用同种限制酶切割目的基因，产生相同的粘性末端；③将切下的目的基因片段插入到质粒的切口处，再加入适量的DNA连接酶，使质粒与目的基因结合成重组质粒。
（3）普通质粒A和重组质粒都含有抗氨苄青霉素基因。
（4）有的能生长，有的不能生长。
导入普通质粒A的细菌能生长，因为普通质粒A上有抗四环素基因；导入重组质粒的细菌不能生长，因为目的基因插在抗四环素基因中，抗四环素基因的结构被破坏。
（5）受体细胞通过转录、翻译合成相应的蛋白质，即人的生长激素。
３、（１）限制性内切酶 微生物 一种限制性内切酶只能识别一种特定的核苷酸
系列，并在特定的点位切割
（２）限制性内切酶 ＤＮＡ 分别与载体结合 载体 复制
带有目的基因的ＤＮＡ片段
（３）提取目的基因 目的基因与载体结合 将目的基因导入受体细胞
目的基因的检测和表达
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