生物工程专业英语第五章翻译.docx

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生物工程专业英语第五章翻译

第五章、酶和固定化细胞技术

微生物，特别是酵母菌，已使用了几千年生产啤酒，葡萄酒和其他发酵产品。

然而，这是不到1878的实际组成部分的酵母细胞负责发酵为酶（来源于希腊语意味着它在年）。

不到二十年后非生命的性质的酶是清楚地表明与无细胞提取物对酵母，能促进葡萄糖转化为乙醇。

最后验证了酶是蛋白质仅在1926的纯化和结晶尿酶。

在接下来的几年里，与演化的新的学科生物化学，酶被证明是在所有活的生物体，并利用活细胞催化特定的化学反应。

随后，酶已被证明是非常具体的作用，运作的高转换率，和温和的生理条件下运作低压力和温度，在水溶液中。

虽然正常的酶的作用位点是细胞能排泄到环境中的酶来打破大的有机分子（蛋白质，脂肪，淀粉）（分泌）（胞外酶）有无数的例子，在活细胞的内部否则不能进入细胞，一些微生物的胞外酶生产的正常生长非常重要的是，它是从这个源酶首次投入商业利用。

5.1、商业作用的酶

所有产品的商业发酵过程的最终结果是酶活性在生产者有机体。

可以孤立的酶替代生产生物在特定发酵？

这是个常见的问题，但令人满意的成果很少被意识到实践。

使用整个生物体造成一定的缺点在发酵过程：

1、最佳条件可能不同的增长和产品的形成。

2.一个高比例的基板可以转化为生物量。

3.副反应可以发生；

4.转化率所需的产品可能是缓慢的；

5.所需的产品从发酵可能是困难的。

因此，使用分离和纯化酶最，如果不是全部，这些限制可以减少或克服的。

最明显的优点是简单的处理，更大的可预测性的活动和改善特异性催化作用。

然而，大多数发酵使用传统的整个生物体有可能持续到未来。

虽然超过2000酶已被分离出的微生物，植物和动物，少于20的使用规模上可以被视为重要的，无论是商品生产者或用户在行业或服务。

目前主要的输出商业生产者关注的是相对简单的酶用于天然的形式主要是在食品及相关行业和洗涤剂制造（图.5.1）。

大多数的水解酶，如淀粉酶，蛋白酶，纤维素酶，果胶酶，等等，和功能主要是作为添加剂或过程助剂中烘烤，乳制品，啤酒和果汁行业。

与此相反的粗散装酶是一个迅速扩大的市场一定的高度纯化的酶，如葡萄糖异构酶和葡萄糖氧化酶。

这些酶和许多其他的发现越来越多的应用在制药行业，在治疗应用在临床化学分析。

5.2酶来源

商业用酶是来自植物和动物组织,和来自选育的微生物.从植物中得到的酶包括蛋白酶,淀粉酶,脂氧合酶和一些特殊的酶.从动物组织中的酶主要是胰腺的胰岛素和脂肪酶及制作奶酪的凝乳酶.植物和动物原料会出现供应问题,由于季节变化,低浓度和生产植物酶的高成本,而;来自肉类工业副产品的动物酶,它的供应有限,并且会和其他的使用者竞争.现在出现许多传统的源料都不足以满足现在的酶需求,正在寻找为现有的和新的酶的微生物来源。

在实践中，微生物的酶是从一个相对有限的微生物和微生物，特别是，一个历史悠久的可接受性的食品和饮料生产商的首选。

这是特别昂贵的制造商获得批准，立法机关使用的产品来自未经证实，微生物作为他们必须评估毒性和安全。

出于这个原因，大多数工业微生物的酶是从很少超过11，真菌，细菌和酵母菌和84在实践生产商通常寻求新的酶在这一组（表5.1）。

除非更便宜的方法进行安全性测试可以发展将有相当大的限制的新产品开发微生物活动。

筛选方案，酶的生产是极其复杂，特别是种植方式被用来确定菌株的选择。

它已经表明，某些菌株只会产生高效价在表面或固体培养，而其他菌株适合于深层培养或液体培养。

因此，选择的技术必须与最终的商业化生产工艺。

5.3酶生产

在选择菌体之后,生长必须在酶生产量最大化条件下进行.胞外酶比胞内酶有一些特殊的优势,因为它们的产品不需要昂贵的细胞破碎技术;胞外酶在液体培养基中以一种相对较纯的状态存在,而胞内酶需要更为复杂的分离和纯化方法.工业生产的酶大部分是胞外酶,但是胞内酶在医学和工业中作为诊断酶起着越来越重要的作用.

选择的微生物应该很稳定和酶生产.并且能够形成孢子,能够在廉价的培养基上升长良好,不产生有毒的底物,并且没有抗生素活性.

现在工业酶生产主要依靠深层发酵或者是固体发酵方法.

由于微生物酶通常是小体积生产的,所以很难从经济上证明深层培养生产所需的特殊发酵设备的发展是合理的.通常,所用的设备和抗生素生产所用的在设计上和功能是很相似.一个典型的酶生产反应器是用不锈钢制成的,带有机械搅拌和空气鼓泡器,容量大概是10-50m3.这种生物反应器有嵌入式的灵活性,可以很容易的转变成其他的生产模式.

通常保外酶是用持续30个到50个小时的分批发酵过程来生产的.停止发酵的最佳时间在产量最大化和酶活性最大化之间.最佳时间是由原料成本,工厂规模和恢复的难易决定的.

连续培养技术可以在实验规模上用于酶生产在实验,但是几乎没有证据证明有任何生产商用这种方法.分批培养方法常可以扩大,通过连续的或分批添加碳水化合物或蛋白质可以提高酶产量.

现在还没有通用的酶动力学模型,但是有可能研究特定酶的调控机制.仅仅一小部分重要的商业酶是在指数期生产的,大部分是在指数生长周期之后合成的,有用的酶蛋白的产量大概是最初的培养基干底物的1%到5%,典型的发酵中细胞产量可以是2%到10%

怎样调控生物反应器中的酶生产达到商业操控的最优势?

现在有很多方法可以克服可能限制目的酶产量的控制机制中任何一个问题.在原则上有俩类,操控遗传物质和操控微生物生长环境.通常一起用这两种方法会出现最成功的结果.

微生物的遗传操控在第三章有讨论,许多公认的已经应用于调控研究.突变体的形成依然是工业应用最广的方法,但是ＤＮＡ技术的应用范围会增加，　特别是在非食品行业．　

过程控制员可以通过选择合适的培养基组分或者培养参数来控制生长环境从而克服由调控机制引起的酶合成抑制，　诱导物的添加可能会非常有效．　应用最广的诱导物是非代谢底物的类似物．

酶合成的终产物的抑制我们可以通过以下的方法进行阻止：

（a）通过在培养基中添加抑制剂来限制终产品的积累

（b）确保终产品不出现在供应的培养基中

（c）选择一调节性的不会受终产品抑制的突变体

许多重要的工业酶都会受到代谢的抑制．　实践上通过以下的方法可以避免代谢抑制：

（a）抵抗代谢抑制的突变体

（b）避免使用抑制性碳源

（c）通过生来抑制来去酶合成抑制，包括抑缓慢添加抑制性底物或者代谢类似物和底物的衍生物的缓慢利用．

在许多重要的此生代谢产物的工业生产中，　产品形成通常是出现在在繁殖期．例如在快速生长的初期之后．这些现象第一次报道是出现在抗生素生产上．但是现在知道有很多相关的因子．启动次生代谢的因子不是很清楚,但是它和细胞中特定酶的组成的明显的变化有关.

固体底物培养方法起到了重要的作用在商业酶生产中,特别是在日本.特别是曲霉中的淀粉酶,曲霉和毛酶中的蛋白酶,长久以来在商业上就有重要的作用.其他的酶产品包括果胶酶和纤维素酶,最初,培养是在托盘上的用手工操作,但是随后清洗,培养基装配及托盘清理的机械系统逐渐发展起来了.固体培养系统和深层培养方法相比,优点和缺点都有深入的分析.酶生产的固体培养方法的主要的优点优点是:

（a）单位体积发酵罐的酶产量高

（b）耗能少

（c）所需控制最少　

（d）提取的浓缩酶溶液产量高

（e）设备规模通常较小

（f）规模放大不是很困难

连续操作可以在培养过程中和底物添加一起.

毫无疑问,深层培养方法目前在商业酶生产中占优势,由于操作成本和更容易控制过程中感染杂菌的风险.对于酶生产是使用固体底物还是用深层发酵的方法最终取决于两个过程的相对成本.然而固体底物发酵和许多微生物的自然生长环境相似.特别是真菌.这样可能更好的提供了酶活性的混合.未来酶生产的固体底物发酵的方法的成功将很大程度上取决于下面的研究成果,包括颗粒内部的质量传递,不溶性底物的酶降解和生物反应器设计和过程操作的提高.

5.4酶相关法规

微生物酶产品需要在毒性和其他的安全方面满足严格的规定.商业酶产品在安全方面潜在的关注领域主要是:

（a）产品中有其他蛋白质引起的变态反应,包括酶蛋白质和其他的外来的材料

（b）酶的催化活性

（c）有毒物质的存在,例如真菌毒素和抗生素

酶不同,它们的抗原性也不同,虽然它们会变化,但是它们对使用者的影响可以通过配方达到最小化.大多数的问题都是酶以粉末的形式产生的,但是这可以通过包裹在惰性载体中来消除.液体状体的酶应用的更广.

由于酶催化活性产生的直接影响现在并不是很关注下.通常,纯酶是没有毒的.

在酶制剂中的有毒物质主要以两种方式出现.有毒物质可能存在发酵的培养基中,由于大多数的酶产品只是经过相对简单的纯化工艺,所以有毒物质可能出现在最终的产品中.因此为了确保没有携带有毒物质,食品或食品级的添加剂材料必须规定,并且所有的系统应该测试微生物污染物.

对真菌酶毒理学的关注主要是生产菌种的真菌毒素.在最近的二十年,逐渐的意识到许多真菌产生的有毒代谢产物或者真菌毒素,也必须检测所有的真菌酶样品的真菌毒素.许多真菌毒素在测试菌上会表现出致癌性,雌激素性,诱变性或者致畸性.危险的定量评价是相当的困难.因为人类对低浓度的真菌毒素几乎没有什么信息但是,假如真菌毒素能够检测到,那么这些产品就不能使用.

用于酶生产的微生物可以分成三类.根据分类,将有不同的毒性测试要求.类型A微生物是长久以来用于食品或食品生产过程.在这类中不需要毒理学研究.类型B微生物是食品中无害的污染物,这类需要短期的毒性测试.在类型C是不存在类型A和B中的所有微生物.这些微生物需要更为严格的毒理学研究,包括在多种动物上的长久的食物检测.

负责酶产品安全的主要是生产商和新产品需要通过相关的政策.国家和国际组织已经对一些酶制定相关的规格和建议.

总结来说,酶产品必须是均一的,可靠地和安全的,并且这是生产商的责任来满足这些规格.

5.5酶固定化

使用分离酶主要的缺点是它们在操作条件下不够稳定,作为水溶性的自由分子,很难将它们和底物及产品分离开来并循环使用.

在最近的一些年,试图利用酶固定化过程来克服这些不利因素.固定化通常看作是酶从水溶性的,可移动性的状态转变成不容的,不可移动的状态.固定化阻止酶在反应混合物中的扩散,并且有利于从产品液体中回收酶,通过简单的固液分离技术.因此反应的产品中不含有酶类,并且这些酶可以重新.固定化酶可以应用于连续的操作反应器中.

酶固定化技术已经发展了一百多年.他们可以分成不同的种类.实践上,可以通过将酶共价连接到不溶性材料的表面;和不溶于水的合适的颗粒载体交联;捕获到多孔的基质或凝胶内部;底物和产品的交联化;以及吸附到固体支持物上面等来实现酶的固定化.

酶共价偶联到固体支持物上已经利用了多种的支持物,包括多孔性玻璃,陶瓷（淀粉转葡萄糖苷）,合成的聚合物（胰蛋白酶）,纤维素（天冬氨酸酶,淀粉酶）,尼龙（尿酶）和氧化酶（葡萄糖氧化酶）.来自多肽和蛋白质化学的方法可以用于实现连接.共价键的形成有形成连接的优势,就是不可由pH,离子强度和底物逆转.虽然化学反应是用于产生共价键,但是它也有可能导致酶部分或全部的失活.现在有多种共价结合的方法和固定化方法至少包括两个步骤,支持物的激活酶本身的结合.在实际中涉及化学键形成的基团是氨基,亚氨基,氨基化合物,羟基,羧基,巯基,甲巯基,酰基,咪唑基和苯酚基类.

凝胶中酶的捕获总体上所用的这种方法是非常温和的,不可能伤害酶的活性.在凝胶形成之前酶可以添加到单体溶液中.通过改变温度或增加诱导化合物可以形成凝胶.凝胶依然保存本来的状态,并没有阻塞活性位点,基团或通过化学键形成的酶分子的危险.但是,这种形成的固定化主要的缺点是酶的不连续性,通过孔和由底物和产品传递扩散控制的酶反应的延迟,它是和高分子化合物密切相关的.

载体物质包括硅胶,橡胶,淀粉,聚丙烯酰胺.聚丙烯酰胺是用的最广的捕获材料.已经应用于天冬酰胺酶,葡萄糖异构酶,过氧化酶和许多其他的酶类.

酶的胶囊化这种方法是包裹方法的变异,涉及在半透膜内的胶囊化.这些膜是不能通过酶和其他的分子物质,但是可以通过小分子物质和产品.所用的材料类型包括火胶棉（过氧化氢酶,天冬酰胺酶）,纤维素衍生物（脂肪酶）,聚苯乙烯（催化酶）和常用的尼龙（胰蛋白酶和尿酶）.这些材料可以形成薄的,球形的半透膜,这些半透膜通过包裹酶形成微囊剂.

固体表面的酶吸附吸附方法最显著的特点是简单.吸附条件没有特异性反应,并且对酶没有修饰.最常用的吸附剂包括许多有机的和无机的材料,例如氧化铝（氨基酰化酶,淀粉酶）,纤维素（纤维素酶）,粘土（过氧化氢酶）,玻璃（淀粉）.离子交换剂容易吸附大多数蛋白质,由于支个原因它广泛用于酶的固定化.酶的结合是可逆的,因此在底物存在或增加离子强度的时候它可以解吸附.

和多功能的载体交联假如反应是在没有固体支持物存在的情况发生的,那么这种方法会导致三维的酶分子形成.实践上更多是交联在合适的载体物质表面吸附后才进行的.最常用的交联剂是脂肪族的二元胺,二甲基己二亚胺肽脂二甲基辛二胺脂,和特殊的戊二醛.交联可以在分子间（产生不溶性集合）和分子内.酶通过工聚合作用可以实现固定化.例如共价连接成聚合物,通常包括与顺丁烯二酸酐和乙烯的共聚作用.一种广泛应用的方法包括最初在玻璃膜上的吸附和与戊二醛的交联（淀粉酶,过氧化氢酶,葡萄糖氧化酶）.对于包埋和微胶囊化,这些衍生物没有或很少对大分子物质表现出生理活性.

商业化固定酶一种合适的固定化方法的选择将主要取决于这种酶怎样影响酶的活性.共价连接和交联方法会在酶和支持物之间产生很强的化学键.这些方法相对困难和昂贵.它们可能引起酶失活,并在.相反,通过吸附和凝胶包埋的固定化方法简单而且有效,并不会再没和基质之间产生很强的化学键.当然,酶经常会从基质中泄露出来.这个问题可以通过将吸附或包埋的酶与戊二醛交联来克服.

许多酶的固定化已经在实验水平上实现了,但是仅仅一小部分成功的放大到工业生产了.两个最解除的商业成功的例子是食品工业中葡萄糖异构酶的使用和抗生素工业中青霉素酰化酶的使用.

葡萄糖异构酶可以催化部分的葡萄糖转化成果糖从而生产出低成本的甜味剂,这将改变世界内甘蔗糖和甜菜糖的使用格局,传统的甜味剂来源.现在至少有五家公司供应大量的用不同的微生物生产的果糖甜味剂（链霉菌,凝结芽孢杆菌,游放线菌）.实践上这些酶为达到最大的活性需要高浓度的葡萄糖底物,这些有廉价淀粉生产的添加到生物反应器中的糖浆含葡萄糖应达到40%-50%的水平.在连续的泵操作中可能会出现黏度的问题,但是这些问题可在高温和高pＨ的操作环境中克服．　已经发展了色谱技术来分开果糖和葡萄糖从而含有５５％或更高的果糖产量的浓缩的果糖糖浆．现在每年用上千吨的酶生产百万吨的果糖糖浆．葡萄糖异构酶工业应用包括酶的固定化和细胞的固定化．

工业使用的第二重要的固定化酶是抗生素纤维素酶（来自大肠杆菌），它可以催化自然出现的侧链的脱乙酰作用，从而生产６－氨基青霉烷酸（６－ＡＰＡ）．６－ＡＰＡ可以用于合成几种半合成的抗生素，这有重要的医药应用．用这种方法，重要的抗生素氨苄青霉素是用于合成苯基甘氨酸和６ＡＰＡ．

每年至少生产3500吨6APA,但是这仅仅需要30吨的酶制剂.固体床生物反应器中使用的酶是颗粒形式的.

5.6固定化酶的性能

固定化酶在他的性能上有很重要的改变.这些变化可能归因于酶结构的化学和/或构象改变,固定化酶对催化作用的抑制性特性,和所用载体的物理和化学性质.

在生物技术中最具挑战的问题是提高酶的稳定性.当酶在生物反应器系统中使用时,环境通常比在体内反应时更为严格.实践上他们可能遭受高温,失活杂质和活性中保护性的平衡条件的缺失.甚至酶化学很多年都不知道酶失活的机制.

尽管有很多的通过固定化提高酶稳定性的例子,但是通常固定化不是一种提高酶稳定性的方法.固定化像许多其他的随机处理一样,可提高,可能降低或对酶的活性没有影响.

热量代表了一种生物反应器中酶失活主要的因素.酶的热失活毫无疑问是蛋白质分子中构象改变的结果.当蛋白质共价连接到固体支持物上时,蛋白质分子变得更加钢性,并且更不容易展开,因此失活的可能性更小.蛋白质结构的解折叠是不同的酶失活模型共有的特性,通常是由例如有机溶剂,变性剂和pH的改变.因此通过多点连接到固体支持物的酶固定化将会给酶的稳定性提供一种更为普遍的方法.

酶的固定化可能是有些功能特性改变造成的.当酶以自由状态发挥功能的时候,系统将会对所有过程组分底物,产物,激活剂,抑制剂,辅助因子是同质的.当它们是固定化状态时,新系统的物理化学性能会在固定化酶和水相之间产生分割,因此产生一个抑制性系统.这是可以预料到酶的一些特性和自由的水溶液相比,将会发生重大的改变.同样的,底物转移到催化剂表面是也会受到扩散阻力的影响.当底物需要从主液流中跨过水界面转移到固定化酶和在固定化酶颗粒内部时会出现扩散阻力,可能是凝胶,微胶囊或者中空纤维.

固定化酶可能用过改良已有的过程,或者创造全新的一个.但是到目前为止,它们在商业的应用还是很少.到1983年,用固定化酶系统的商业操作也仅仅限于七种葡萄糖异构酶,四种抗生素酰胺酶,三种氨基酸酰基转氨酶和乳糖分解酶,两种葡萄糖糖化酶,一种天冬氨酸酶和一种延胡索酸梅.固定化酶系统的进一步的应用预计在分析和药用领域,并且会产生全新的想法而不只只为改良.

到目前为止那些因素限制它们的成功应用?

理论上它们可能是以下因素共同作用的结果.

a、许多工业过程中使用的酶相对是廉价的

b、与已经存在过程相比,新引进的设备所需的资本要高

c、这个令人失望的表现在实践中的固定系统与整体运行的经济性和工厂设计规模

进一步酶技术的工业应用中可以看到两只情况：

已在使用或接近的应用和那些需要研究的重大承诺，才能切实成为技术和商用。

这二代酶工程无疑是一个最令人兴奋的和智力要求的许多方面的生物技术（表5.10）。