8011戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程03.docx

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8011戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程03

文件编码

戴安U3000高效液相色谱仪

标准操作规程

颁发部门

SOP-ZL-8011-03

GMP办公室

复印：

1份

修订者

审核者

质量部审核

修订日期

审核日期

审核日期

批准者

分发部门

质量部

生效日期

批准日期

目的：

建立戴安U3000高效液相色谱仪标准操作规程，确保仪器使用的规范化、标准化。

范围：

适用于戴安U3000高效液相色谱仪的操作。

责任：

QC主管、仪器操作员对本规程的实施负责。

内容：

内容：

1、流动相的配制

1.1首先配制常用流动相以及泵后密封圈清洗液小瓶（5%-10%甲醇溶液）如下图（图1）。

配制过程中有机相必须用有机系0.45µm的滤膜过滤，水相或缓冲盐用水系0.45µm的滤膜过滤。

然后超声20分钟，超声时应避免超声温度过高以使有机相挥发。

一般流动相可以保存3天，含缓冲盐的流动相必须临用新配，注意水相、5%甲醇或10%甲醇溶液（清洗液）必须每天更换！

（图1）

1.2D通道抽滤并超声的10%甲醇；注意各通道必须保证流动相充足，当流动相体积150ml及以下，必须重新配制流动相，

2、开机、仪器方法设置。

2.1稳压电源打开JJW-3KVA稳压器“ON”位置，等2-3分钟稳定后，按下ON-LINE1KVA蓄电池电源前面板的“ON”，等2-3分钟。

2.2打开泵（Pump）、自动进样器（Sampler）及所需检测器后面板电源线下方的电源开关，仪器将开机自动进行自检。

各部分自检成功后，方可进行以下各部操作。

2.3打开电脑，等5-7分钟，电脑稳定。

2.4打开软件，连接仪器。

打开变色龙软件控制面板

双击电脑桌面的“变色龙Chromeleon7”

图标。

出现如下对话框

点击“确定”后出现进样器界面（图2）：

（图2）

输入自己的用户名及密码，进入软件界面如下图（图3）

（图3）

在图3左侧出现两台仪器，一台为—U3000，一台为—U3000-01，根据需要选择操作的仪器。

在主页项中连接“泵”，“Sampler（自动进样器）”，及所需检测器，UV是紫外检测器，FLD是荧光检测器，A2D是蒸发光和示差折光检测器（图4）。

（图4）

然后点击“泵（Pump）”选项，再点击下方的“更多选项”（图5-6），

（图5）

（图6）

将“通过进样器”后“Yes”改为“NO”。

关闭泵-更多选项界面，当电脑关闭或泵断开连接时，需执行此步骤。

（图5-6）

2.5冲洗泵

单击（图5）对话框的“继续”按钮，等一分钟左右出现连接按钮变绿，首先将B通道流动相调节100%，单击“冲洗”按钮，出现如下对话框（图6）：

（图7）

逆时针将

单泵上方的金黄色螺母“排气阀”拧3圈左右，点击“忽略警告执行”按钮。

依次按照BCDA顺序进行冲洗，结束后顺时针轻轻拧紧螺母，注意冲洗过程中流速必须为零。

注意冲洗通道的比例必须是100%，当其他通道为比例0%时，A通道为100%。

2.6流速的调节

一般选用90%甲醇或90%乙腈冲洗色谱柱，调节流速时需等如0.2ml/min的步进速度（每个平衡点保持0.5分钟以上时）进行流速的升降，当达到0.6ml/min时，在此流速平衡20-30min后，进行等度流动相比列或梯度流动相初始平衡比例调整；在此流动相平衡20-30分钟后，调整到方法要求的流动相，并等待压力稳定后方可进行样品分析。

①当比例调整幅度大于40%的变化时，应进行过渡（选择两步或两步以上调整后达到所需要比例），通常先调节待加入流动相比例为5%-10%，平衡约5分钟以上，再调节比例到要求的浓度；

②梯度泵开机时通常选择有机相调节平衡流速，再逐步加入水相；

③含盐流动相系统应以调节有机相比例5-10%平衡约30分钟以上，再逐步转换到盐通道。

注意当达到0.5ml/min及以上才能打开柱温箱、连接自动进样器以及紫外灯等。

2.7柱温箱的设置

根据实验要求，设置合理的温度，选择合适的色谱柱，试验没有要求时，默认柱温箱温度为30.00C,注意柱温箱在待机状态时，流速最低为0.5ml/min,色谱柱不能用100%的纯水冲，最低为5%的甲醇或乙腈。

2.8自动进样器的使用

2.8.1进样针的清洗

单击“进样器（Sampler）”出现如下界面（图8）：

在启动项下点击“灌注注射器”，执行清洗，当模块状态项下绿色的“Ready”方可进行下一步，依次按照“灌注注射器清洗缓冲环外部洗针洗缓冲环”顺序清洗3遍。

（图8）

2.8.2放置样品瓶

将待测物质放置专用样品瓶中（图9），注意：

加样时不能超过瓶口最高的标线位置（样品瓶2/3位置）一般在1.0-1.5ml之间。

样品瓶（9）样品瓶托盘（图10）

点击“样品盘控制”命令项下的红区扇区位置“移动盘到前部”，当仪器面板出现“SamplePosition及InjectVolume”方可放置样品；盖上托盖。

注意：

当批处理正在运行时，不能打开自动进样器的样品盘放置样品，必须等当前批处理中断或停止，进样针清洗结束后，进样阀在“Inject”位置时，点击“盘控制”命令项下的红区扇区位置“移动盘到前部”，当仪器面板出现“SamplePosition及InjectVolume”方可放置样品；样品瓶位置必须与设置样品序列的位置一致。

样品分析结束后及时取出样品瓶防止腐蚀。

2.9紫外检测器

单击“UV”出现如下界面（图11）；等10-20分钟，流速达到0.5ml/min稳定时点击命令项“模块连接”按钮。

（图11）

当“连接”变绿及出现绿色“Ready”时方可进行如下操作：

在波长对应的位置输入待测定条件波长值，按下键盘“enter”确定，等待5分钟左右，方可点击命令项下的紫外灯，等待25-30分钟，方可打开主页界面监视基线，如图（12）

（图12）

根据需要选择监视的通道，紫外选择UV-VIS-1，蒸发光检测器选择A2D-Analog，示差选择A2D-Analog2，荧光选择的是Emission-1和FLD-FlowCell两个同时选中，然后点击确定开始基线监测（如图12）。

2.10衍生化泵的连接

（图13）（图14）

2.10.1需要连接衍生化泵时，将色谱柱流出端接到衍生化泵的红色螺母处。

2.10.2将衍生化泵的Det端口出来的管路接至FLD检测器入口端。

2.10.3荧光检测器的设置

（图15）

当连接FLD时，点击FLD出现如下界面（图16）：

（图16）

等20分钟左右，点击“监视基线”，做黄曲霉毒素时激发波长360nm；发射波长450nm；仪器校验时激发波长290nm；发射波长330nm，其他参数不变。

2.11蒸发光散射检测器设置

2.11.1用蒸发光散射检测器检测时，首先确认XWK-Ш全自动空气发生器干燥管内变色硅胶未变色（做1-2次样需更换变色硅胶），打开XWK-Ш全自动空气发生器开关，等压力稳定在0.44-0.48MPa之间时，打开蒸发光散射检测器（ELSD-UM3000）右下角电源开关；出现如下图所示界面（图17）：

（图17）

2.11.3按面板上“MENU”出现如图18所示界面，通过、、、调节温度（Te）至75oC，按面板上的“ENTER”键确定，如下图（图18）：

（图18）

2.11.4然后如下图所示界面，通过、、、调节流速F至2.50L/M，按面板上的“ENTER”键确定，如下图（图19）：

（图19）

2.11.5按面板上的“RUN”键，再按面板上“VALVE”键，POWER、RUN、VALVE三灯全亮出现如下图20：

（图20）

2.11.6当T=075、F=2.50P=3.10左右，再调节试验所需流动相。

2.11.7关闭蒸发光检测器时先停止流动相，继续用空气吹30min左右，再按面板上的“VALVE”键，再按面板上的“MENU”键，再关黑色开关。

再间断地按XWK-Ш全自动空气发生器红色放液按钮，直至压力表上的压力为“0”，然后关机。

2.11.8蒸发光界面一般打开软件自动连接。

模块状态显示连接（绿色）才可做样。

如下图（图21）；

（图21）

2.12示差检测器设置

2.12.1将色谱柱流出端接到检测器“IN”端口，检测器“OUT”端口是废液流出端。

按下左下角的电源开关，检测器显示如下（图22）：

（图22）

2.12.2设置操作参数。

用左右方向键切换到参数设置界面。

如下（图23）：

（图23）

通过按上下方向键，切换当前显示的参数界面。

顺序如下图所示（图24）。

（图24）

参数设置说明（图25）

（图25）

请按照下列步骤更改参数设置：

2.12.2.1切换当前显示的参数界面至需要更改的参数；

2.12.2.2按下确认键（ENTER），参数部分的光标开始闪烁；

2.12.2.3通过上下方向键来更改具体参数数值；

2.12.2.4按确认键（ENTER）使新设置的参数生效；

2.12.2.5按ESC键返回监控界面；

2.12.3将流动相的流速定为1ml/min通过参比池（冲洗）。

2.12.4间隔十秒钟按下冲洗键（PURGE），以打开/关闭冲洗阀（当打开时，LED灯亮，流路通过参比池，再按一次就关闭），持续几分钟。

2.12.5从上述步骤2.12.3开始让洗脱液流经参比池，保持约20分钟。

2.12.6按下冲洗键（PURGE）关闭冲洗阀，流动相流入样品池。

2.12.7等待基线稳定。

2.12.8按归零键（Zero）自动调节零点。

2.12.9开始进样操作。

2.13建立程序文件

2.13.1选择所要使用的仪器（图26）

2.13.2点击文件菜单，再点击创建选择“序列”出现下（图27）

（图26）

（图27）

1、选择样品瓶数2、进样次数3、起始位置4、进样量选择好之后点击下一步出现下（图28）

（图28）

点击“浏览”选择仪器方法出现下（图29）、

（图29）

点击黑色圈标注的图标选择U3000/U3000-01仪器方法出现下图一般常用的仪器方法有UV（紫外）、ELSD蒸发光检测器/示差检测器、FLD（荧光）检测器，根据样品检测要求选择所需要的检测器（图30）。

（图30）

仪器方法选定之后回到一下界面（图31）：

（图31）

点击“下一步”完成新建序列完成接下来选择保存序列界面（图32）：

（图32）

选择需要保存路径，完成即可。

所有检测器使用之前都应提前打开预热半个小时，波长调到所需波长，流动相调到做样需要的比例即可开始基线测试如（图33）

（图33）

3、运行批处理程序如（图34）

（图34）

新建序列的命名以前列舒乐为例如下（图35）

（图35）

各品种对应各自的对照品及样品，修改完之后点击上方的“开始”即可做样。

4、数据处理

4.1批处理完成后双击打开需要处理的色谱图进行积分处理如下（图36）：

（图36）

4.2先点击结果

再点击矫正处理

4.3再点击色谱峰下面检测项目中的“运行Cobra向导…”如下（图37）

（图37）

4.4出现Cobra向导后，选择积分区域（图38）

（图38）

点击下一步选择合适的极限噪音范围，点击下一步；

选择合适的平滑度，点击下一步；

选择合适的最小峰面积，点击下一步；

通道和进样类型保持默认；点击完成；

色谱图处理完成后保存即可。

4.5Cobra向导完成后在色谱图下方“组分表”项目中设置组分名称（图39）。

（图39）

（图40）

5、打印报告

5.1在主界面左侧下方点击“报告设计器”出现色谱图和结果项目（图40）。

5.2选择色谱图下方需要打印的项目，然后点击窗口左上方的变色龙图标

，再点击打印即可。

6、培训：

6.1培训对象：

仪器操作员

6.2培训负责人：

QC主管

6.3培训时间：

2小时

7、修订历史：

日期

修订原因

原文件编号

新文件编号

备注