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缺Mg对玉米幼苗生长发育及功能特性的影响

缺Mg对玉米幼苗生长发育及生理功能特性的影响

XXX

(中山大学生命科学院广州510275)

摘要:

植物缺少一部分必需元素之后,会出现一系列的缺素症状。

本次试验采用缺Mg培养液与完全培养液同时进行玉米幼苗的缺素实验培养。

观察了玉米幼苗缺Mg时的外部症状,测定了缺Mg对于玉米幼苗光合作用、原生质膜结构、根系活力、叶绿素含量、过氧化物酶活性、蛋白质代谢及合成、可溶性糖含量、硝态氮含量等各项生理指标的影响。

结构表明:

缺Mg胁迫会使植株表现老叶叶缘发黄失绿、叶尖干枯,根系不发达等,植物抗逆性弱、糖合成含量低、光合作用能力低、叶绿素含量显著降低、蛋白质合成和代谢受阻等症状。

关键词:

玉米幼苗;缺Mg培养;生长发育;生理功能

引言

Mg2+是植物细胞中重要的二价阳离子,它参与能量代谢,是酶的辅因子,并且是叶绿素结构的中心原子[1],在叶绿体发育和执行功能过程中发挥重要作用。

Mg参与了类囊体膜的组装和基粒垛叠,对维持叶绿体结构有重要功能[2]。

Mg对于类囊体膜的稳定性和跨膜电子梯度的建立以及mRNA的稳定也是非常重要的,可促进光合作用的碳同化。

Mg还是许多酶的活化剂,几乎所有磷酸化酶和激酶都需要Mg2+活化。

Mg能够稳定DNA和RNA,对于转录和翻译过程有重要作用[3]。

因此,Mg对于植物生命活动特别重要,对于提高作物产量和森林蓄积量具有重要作用。

玉米是我国主要的栽培植物之一,在当前市场经济迅速发展的过程中,玉米也是改善人民生活出口外贸重要的物质之一。

玉米具有的很高的营养价值,这为发展畜牧业的优质饲料和工业原料提供了优良的发展条件。

同时玉米也具有易栽培、易生长的优良特性,因此,为了更好地了解缺素培养对与植物生长发育及生理功能特性的影响,并掌握相关植物栽培以及其生理生化检验技术。

本实验选用了玉米幼苗作为实验材料,试探究了缺Mg对其生长发育及生理功能特性的影响。

旨在加深矿质元素对植物生长、生理作用的认识以及增强一般植物生理检测的实验技能水平,研究和探索缺素对植物生长发育的影响。

1实验材料和方法

1.1实验材料

玉米幼苗(ZeamaysL,由中山大学东校区植物生理实验室提供)

1.2玉米幼苗培养

选取已长出第二片真叶的玉米幼苗进行溶液培养,将幼苗接种于塑料培养缸中(选取大小、生长状况相近的植株,每缸3株,共6缸),进行完全溶液培养两周。

培养期间,每天通气一次,每5天添加一次蒸馏水。

培养两周后,将6缸培养缸分为2组(缺Mg组、完全组),分别更换缺Mg培养液和完全培养液。

继续培养两周,培养期间,每天通气一次,每5天添加一次缺Mg培养液和完全培养液。

记录缺Mg植株所表现的症状及最先出现病症的部位,并拍照。

培养结束后,取出植株,剪下对应部位的叶子,编号后分别装在不同的袋子里-80℃超低温冰箱保存,并进行各项生理指标数据的测定。

1.3光合作用测定

采用“LCi便携式光合仪”进行缺Mg组、完全组两组玉米苗光合作用的测定。

1.4电导率的测定

制备叶片浸出液以后,室温下使用电导率仪测定溶液电导率为初始电导率(S1),煮沸后冷却再测量为终点电导率(S2),并计算相对电导率(SR)=S1/S2×100。

1.5根系活力的测定(TCC法)

采用氯化三苯基四氮唑(TTC)法,利用氯化三苯基四氮唑(TTC)可被根系细胞内琥珀酸脱氢酶等还原的作用,生成红色不溶于水的三苯基甲臢(TTF),根据最后玉米根被三苯基甲臢染色程度估测其根系活力。

1.6叶绿素总量的测定

利用皂化反应分离叶绿素和类胡萝卜素,并根据皂化叶绿素的颜色与原来叶绿素几乎相同,其颜色的深浅与含量成正比的特性,将皂化叶绿素溶液与已知浓度的标准溶液在650nm的波长下,进行比色测定,测得叶绿素含量。

1.7过氧化物酶活性的测定

利用过氧化物酶(POP)在H2O2存在条件下,能使愈创木酚氧化,生成茶褐色的4-邻甲基苯酚。

该物质在470nm处有最大吸收峰,可用分光光度计测量470nm的吸光度变化可测定过氧化物酶(POD)活性。

1.8可溶性蛋白质含量的测定及SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

使用考马斯亮蓝G-250与蛋白质产生颜色反应,在一定范围内,蛋白质含量与颜色的深浅成正比,可以在595nm下比色法测定其蛋白质含量。

制作SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离提取得到的叶片蛋白质,根据Marker的条带分析叶片中蛋白质种类

1.9可溶性糖含量的影响

可溶性糖在强酸、高温的条件下发生分子内的脱水作用,生成糠醛或羟甲基糠醛,糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮作用形成一种蓝绿色的糠醛络合物,在一定范围内,其颜色的深浅与可溶性糖含量成正比关系,故可用在620nm波长下进行比色法测定。

1.10硝态氮含量的测定

根据硝酸根还原成亚硝酸根后,与对氨基苯黄酸及-萘胺结合,生成玫瑰红色的偶氮化合物,生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰,其颜色深浅与硝态氮含量在一定范围内成正比关系,故可用比色法进行测定。

2结果与分析

2.1缺Mg对玉米幼苗生长的影响

缺Mg培养的前一周,无明显变化,缺Mg植株与完全培养植株均生长良好,两组玉米未出现很明显的外部形态差异。

如图1所示:

图1培养第7天的玉米幼苗生长情况(图中上部分三缸为完全培养;下部分三缸为缺Mg培养)

在缺Mg培养的的第9天,缺Mg植株的部分老叶开始出现叶片边缘发黄的现象,而完全培养植株老叶长势正常。

如图2所示:

图2培养第9天玉米幼苗老叶生长情况(左:

缺Mg培养老叶;右:

完全培养老叶)

比较根部后发现,缺Mg培养与完全培养相比,缺Mg培养根部的侧根生长要比完全培养弱,但根的长度,缺Mg培养要普遍长于完全培养。

如图3所示:

图3玉米幼苗根部生长情况(上:

缺Mg培养根部;下:

完全培养根部)

2.2缺Mg对植物光合作用的影响

使用LCiSD便携式光合仪测定缺Mg培养与完全培养玉米植株叶片的光合速率与蒸腾速率。

选取叶片为缺Mg培养与完全培养中长势相近的第一片老叶,将在叶片放置在LCiSD便携式光合仪叶室中后,测量7min。

待CO2和H2O数值达到稳定时,开始记录光合速率值与蒸腾速率值。

记录结果如下表一所示:

表一缺Mg培养和完全培养玉米植株叶片光合速率的测定结果

完全培养第一片老叶

缺Mg培养第一片老叶

比率(完全/缺Mg)

光合速率A(umolCO2m-2s-1)

49.62

41.62

1.19

蒸腾速率E(umolH2Om-2s-1)

11.76

10.91

1.08

根据结果可见,完全培养的光合速率与蒸腾速率均大于缺Mg培养。

但是完全培养的光合速率并没有显著的强于缺Mg培养光合速率,其中完全培养的蒸腾速率只是微微大于缺Mg培养的蒸腾速率。

将光合速率与蒸腾速率比率相比较,可知Mg的缺失对光合速率的影响要大于对蒸腾速率的影响。

而由于本次试验选用的玉米幼苗为缺Mg培养第一周的玉米幼苗,缺Mg对叶绿素的光合作用尚未造成明显影响,因此完全培养的光合速率只是微高于缺Mg培养的光合速率。

2.3缺Mg对植物组织细胞原生质膜结构的影响(电导率法测定)

采用电导率法测量植物细胞浸提液的电导率,可以分析得到植物组织细胞原生质膜的膜透性水平并进一步分析逆境胁迫对植物组织细胞原生质膜结构的影响。

通过电导率仪测得的缺Fe培养和完全培养玉米植株叶片电导率值。

记录结果如下表二所示:

表二缺Fe培养和完全培养玉米植株叶片电导率值结果

电导率(μs/cm)

完全培养叶片

缺Mg培养叶片

本底电导率

5.72

初始电导率(S1)

173.8

184.0

终点电导率(S2)

456.0

438.0

相对电导率(SR)

37.33%

41.24%

比率(缺Mg/完全)

1.11

(相对电导率(SR)=S1/S2×100%)

结果表明缺Mg培养的相对电导率要高于完全培养,说明在缺Mg培养的情况下,玉米幼苗的原生质膜的结构遭到破坏,膜透性增大,导致细胞质内电解质外溢,进而引起了电导率的升高。

但是虽然在缺Mg培养的情况下,能够使玉米幼苗叶片的电导率增高,但是增高的比率不是很明显,说明Mg元素并不是玉米细胞原生质膜结构构成的关键元素,但也是影响元素之一。

查阅相关文献后发现,缺Mg培养会降低Calvin循环的效率,从而导致了NADPH利用率的减少,使光合作用的电子传递系统过度饱和,过剩的激发能产生较多电子,传递至O2后产生O2—和其他的活性氧,活性氧有很强的氧化能力,对许多生物功能是起破坏作用的,包括引起膜质的过氧化作用,从而破坏了膜的结构和功能[4],导致叶片的电导率增高。

2.4缺Mg对植物根系活力的影响(TTC法测定)

通过TTC法处理之后,得到染色结果,拍照。

结果如图4所示:

图4TTC法染色结果(左:

缺Mg培养根;右:

完全培养根)

通过TTC法测定得到的结果即根中脱氢酶的活性,可作为根系活力的指标。

如果染色越深说明脱氢酶活性越高,根系活力也越强。

理论上,当植物受到营养胁迫时,根系脱氢酶活力会明显降低,完全培养植株根部染色应该会深于缺素培养植株。

本次实验中,缺Mg培养和完全培养根的染色程度相近,用肉眼难以辨别。

因此本实验并不能很好的得到关于缺Mg对植物根系活力的影响结果。

因此猜测,Mg对植物根系活力存在一定的影响,但同时植物根系活力也受到诸如温度、生长状态等各种因素的综合作用。

2.5缺Mg对植物叶片叶绿素含量的影响

本实验给出标准曲线,在得出实验叶片研磨液的叶绿素吸光度后查出数值,计算总量。

标准曲线如图5下所示:

(由老师提供)

图5叶绿素总量测定的标准曲线

本实验测得的OD值为:

完全培养组OD值=0.102,缺Mg培养组OD值=0.081。

根据标准曲线算得:

完全培养组C=10.60μg/mL,缺素培养组C=8.46μg/mL。

根据计算公式:

叶绿素含量(mg/g样品)=(V1×C/W×103)×V2/V3计算样品中叶绿素含量。

其中:

V1——皂化液(即10%KOH的甲醇溶液)体积(mL);

C——为标准曲线叉的叶绿素含量(μg/mL);

V2——为叶绿素提取液总体积(mL);

V3——为用于皂化的叶绿素提取液体积(mL);

W——为样品重量(g)。

(实验中V1=10mL,V2=20mL,V3=5mL,m=0.5g)

带入数据计算得到:

完全培养组叶绿素总量=0.848mg/g样品,

缺素培养组叶绿素总量=0.677mg/g样品。

相对比率(完全/缺Mg)=1.25

根据实验数据可以知道,缺Mg会导致植物叶片叶绿素含量显著减少。

原因是Mg元素的缺失导致了叶绿素合成受阻,最终导致植物叶片中叶绿素含量的降低。

查阅相关文献发现,缺少Mg2+植物不能合成叶绿素,缺Mg对植物光合膜的垛叠、激发能在PSI和PSII2个光系统之间的分配、光合电子传递速率、叶绿素荧光、PSⅡ活性和原初光能转化效率以及光合碳代谢等一系列重要的生理生化过程都有明显的影响[5]。

2.6缺Mg对植物组织中过氧化物酶的影响

将制备好了的完全培养组和缺Mg培养组的待测酶液置于分光光度计中,在470nm波长下进行比色测定。

每隔30s记录一次OD值,总共记录12组数据。

结果如表三所示:

表三完全培养和缺Mg培养玉米POD活性OD值测定

时间

完全培养组OD值

缺Mg培养组OD值

0min

0.095

0.065

0.5min

0.115

0.074

1.0min

0.135

0.087

1.5min

0.151

0.099

2.0min

0.166

0.111

2.5min

0.182

0.124

3.0min

0.198

0.137

3.5min

0.213

0.151

4.0min

0.232

0.165

4.5min

0.240

0.171

5.0min

0.251

0.179

5.5min

0.262

0.187

将表三中的OD值根据时间作图可达到完全培养组和缺Mg培养组POD活性OD值的变化趋势图。

如图5所示:

图5完全培养组和缺Mg培养组POD活性OD值的变化趋势

以每分钟光密度变化值表示酶活性大小,即以每分钟OD值减少0.01定义为1个活力单位。

做得完全培养组和缺Mg培养组POD活性OD值的变化线性回归方程得:

完全培养组:

y=0.0296x+0.1061R²=0.9928

缺Mg培养组:

y=0.0233x+0.065R²=0.9916

由此可得:

完全组ΔOD470/t=0.0296,缺素组ΔOD470/t=0.0233

最后根据计算公式:

过氧化物酶活性(U/gFW/min)=

其中:

ΔOD470——反应时间内光密度值的变化;

m——植物鲜重(g);

V0——提取酶液总体积(mL);

V1——测定时取用酶液体积(mL);

t——反应时间(min)。

(实验中V0=15mL,V1=0.1mL,m=0.3g)

带入数据计算得到:

完全培养组过氧化物酶活性=1480U/gFW/min,

缺素培养组过氧化物酶活性=1165U/gFW/min。

相对比率(完全/缺Mg)=1.27

根据实验数据可以知道,缺Mg会导致植物叶片中过氧化物酶活性减小。

这与前面电导率增加、质膜破裂的原因类似,由于缺Mg使过氧化物酶活性减小,从而使得大量的活性氧存在,导致了许多生物功能的破坏。

但是通过文献查阅发现,一部分实验测得缺Mg会导致POD活性的增高。

如Tewari等在研究缺镁胁迫对桑树的影响时发现,桑树叶片中H2O2含量明显提高,保护酶POD、APX和SOD活性增强[6]。

Candan等对薄荷叶缺镁的研究表明,在2-6叶期,薄荷抗氧化防御系统增强,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和过氧化物酶(POD)活性提高[7]。

上述实验的研究材料为桑树、薄荷等双子叶植物,并没有发现有关缺Mg导致玉米等单子叶植物POD活性增高的文章。

因此,缺Mg导致玉米POD活性的增高、降低与否需要进一步进行重复实验以及不同组织细胞的酶活性实验来加以证明。

2.7缺Mg对植物组织内蛋白质代谢及合成的影响

2..7.1蛋白质含量测定

提取得到玉米叶片的可溶性蛋白提取液,利用考马斯亮蓝G-250进行比色测定其浓度。

由牛血清蛋白标准溶液制得标准曲线。

具体数据如表四所示、标准曲线如图6所示:

表四可溶性蛋白含量测定的标准曲线相关数据

标准蛋白含量(ug/0.1mL)

20

40

60

80

100

吸光度值(595nm)

0.083

0.165

0.216

0.272

0.329

图6可溶性蛋白含量测定的标准曲线

本实验测得:

完全培养水溶蛋白OD值=0.526

缺Mg培养水溶蛋白OD值=0.521

根据标准曲线计算得到蛋白含量:

完全培养水溶蛋白含量=159.41ug/0.1mL

缺Mg培养水溶蛋白含量=157.84ug/0.1mL

最后根据计算公式:

蛋白质含量(mg/FW)=

其中:

m0——查标准曲线得到的样品测定管中蛋白质的质量(mg);

V0——提取液总体积(mL);

V1——测定时取样液体积(mL);

m1——取样量(g)。

(实验中V0(完全)=1.8mL,V0(缺素)=1.785mL,V1=0.1mL,m1=0.5g)

带入数据计算得到:

完全培养组水溶蛋白含量=5.74mg/g,

缺素培养组水溶蛋白含量=5.68mg/g。

相对比率(完全/缺Mg)=1.01

根据实验数据可以知道,缺Mg会导致植物叶片中水溶性蛋白质含量与完全培养组相比,含量相差不大。

说明Mg元素可能不是玉米叶片中蛋白质合成的主要元素,也有可能是Mg对蛋白质合成有影响,但是影响不大,所以在低量的情况下,相差效果不明显。

查阅文献发现,Mg能稳定蛋白质合成所必需的核糖体构型,缺Mg导致核蛋白体解离成小的核蛋白体亚单位。

因此,缺Mg时,蛋白质合成受阻,蛋白质N占总N的比率下降。

Mg对RNA聚合酶,进而对核中RNA的形成也是必需的,缺Mg时RNA的净合成立即停止,之后使蛋白质合成迅速下降[8]。

2.7.2SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳

本次实验先制备分离胶,接着制备浓缩胶。

上样量一般为15μg。

电泳时,电流设定为60mA,继续进行电泳。

等条带接近胶底部时停止电泳,进行染色、脱色等处理,最后拍照分析实验结果。

电泳结果如图7所示:

图7蛋白质电泳图

已知标准蛋白共条带,如上图所示,分子量分别为170kDa、130kDa、100kDa、70kDa、55kDa、40kDa、35kDa、25kDa、10kDa。

最上和最下两条带表示溴酚蓝移动的起始位点和终点。

可清晰选取出上图所示6个蛋白,分别记为蛋白1、蛋白2、蛋白3、蛋白4、蛋白5、蛋白6。

利用AdobePhotoshop软件测量样品、Marker蛋白及溴酚蓝移动距离。

由相对迁移率(Rf)=样品移动距离A(cm)/溴酚蓝移动距离b(cm)可得标准蛋白的相对迁移率。

数据分别如表五、表六所示:

表五Marker蛋白的相对移动距离

Marker蛋白分子量

170kDa

130kDa

100kDa

70kDa

55kDa

40kDa

35kDa

25kDa

10kDa

移动距离

2.58

3.93

6.71

9.73

12.50

16.75

21.11

24.80

31.11

相对迁移率

0.083

0.126

0.216

0.313

0.402

0.538

0.679

0.797

1

表六样品蛋白相对移动距离

蛋白1

蛋白2

蛋白3

蛋白4

蛋白5

蛋白6

完全组

4.80

10.12

11.78

13.37

19.52

20.99

相对迁移率

0.154

0.325

0.379

0.430

0.627

0.675

缺Mg组

4.80

10.08

11.74

13.41

19.50

21.02

相对迁移率

0.154

0.324

0.377

0.431

0.627

0.676

根据标准蛋白分子量的对数作纵坐标,相对迁移率作横坐标制作标准曲线。

标准曲线如图8所示:

 

图8蛋白质分子量测定的标准曲线(纵坐标以e为对数运算的底数)

将样品的相对迁移率带入回归方程后可算得其相对分子质量的指数,以e为底数求指数的结果为其算得结果即其相对分子质量。

计算结果如表七所示:

表七样品中蛋白的相对分子质量

蛋白1

蛋白2

蛋白3

蛋白4

蛋白5

蛋白6

完全组相对分子质量(kDa)

122.57

76.41

65.82

57.17

33.17

29.05

缺Mg组相对分子质量(kDa)

122.57

76.62

66.18

57.01

33.17

28.97

由实验结果不难看出,缺Mg对蛋白质合成种类并无不良的影响。

完全培养组和缺Mg培养组电泳的蛋白质条带结果类似,所以可以推断,Mg元素的缺失,不影响玉米叶片中可溶性蛋白的合成种类。

2.8缺Mg对植物组织中可溶性糖含量的影响

采用蒽酮法测定,经分光光度计比色后,所得结果:

第一组:

完全培养组OD值=0.288,缺Mg培养组OD值=0.170;第二组:

完全培养组OD值=0.285,缺Mg培养组OD值=0.165。

其标准曲线如图9所示:

(由实验老师提供)

 

图9可溶性糖含量的测定标准曲线

根据标准曲线计算得到可溶性糖含量:

完全培养水溶蛋白含量=50.56ug/mL

缺Mg培养水溶蛋白含量=29.68ug/mL

最后根据计算公式:

可溶性糖含量%=(C×V/m×10-6)×100

其中:

C——提取液的糖含糖量(从标准曲线上查得数值,ug/mL);

V——样品稀释后的体积(mL);

m——样品重量(g)。

(实验中V=100mL,m=0.3g)

带入数据计算得到:

完全培养组可溶性糖含量=1.69%,

缺素培养组可溶性糖含量=0.99%。

相对比率(完全/缺Mg)=1.71

由数据看出,缺Mg培养导致植株可溶性糖含量大大减少,这表明缺Mg已经导致了整个植株生长状态紊乱,导致植株叶绿素合成减少,影响植株光合作用,结果使植株合成可与可溶性糖相互转化的碳水化合物能力下降,进而导致缺铁植株可溶性糖含量较低。

2.9缺Mg植物组织中硝态氮含量的影响

通过对氨基苯黄酸法测定叶片中的硝态氮,经分光光度计比色后,所得结果:

完全培养组OD值=0.520,缺Mg培养组OD值=0.228。

硝态氮含量的制作标准曲线如图10所示:

图10植物组织中硝态氮含量的测定标准曲线

根据标准曲线计算得到可溶性糖含量:

完全培养硝态氮含量=1.64ug/mL

缺Mg培养硝态氮含量=0.75ug/mL

最后根据计算公式:

X={[(5×C×2×25)/V]/W}×0.1=(25×C)/(W×V)

X为100g样品中硝态氮毫克数

其中:

C——比色液中硝态氮含量(ug/mL);

V——所取分析液体积(mL);

W——样品重量(g)。

(实验中V=4mL,W=0.5g)

带入数据计算得到:

完全培养组硝态氮含量=20.50mg/100g样品,

缺素培养组硝态氮含量=9.38mg/100g样品。

相对比率(完全/缺Mg)=2.19

由数据很明显可以看出,缺Mg培养使得植物叶片中的硝态氮含量大量减小,N是可移动元素。

Mg的缺失可能导致了N在植物体内的重新分布,由此引起了叶片中硝态氮的减少。

查阅文献发现,缺镁胁迫增加了根中N元素积累,而在新叶和老叶中,N元素含量均降低,这可能是因为镁可提高硝酸还原酶活性,促进NO3-同化,缺镁则抑制硝酸还原酶活性,导致根部吸收的NO3-不能顺利同化为有机氮化物,而植物体内N元素的运输主要是氨基酸等有机氮形式,因此导致根中积累N元素,叶中氮元素含量下降[9]。

3.讨论

通过对玉米幼苗进行缺Mg培养液培养,系统地对培养结果以及各项生理指标进行观察和研究。

结果表明:

①缺Mg会造成植株出现老叶叶缘发黄失绿、叶尖干枯,根系不发达等外部表现缺素症状。

鉴于Mg是可移动元素,所以对于缺素胁迫来说,最早的缺素症状最易出现在老叶中。

②缺Mg会造成植株原生质膜结构发生破坏,减低了植物的抗逆性。

缺Mg培养会使光合作用的电子传递系统过度饱和,产生过剩的活性氧进而破坏生物功能,包括引起膜质的过氧化作用,从而破坏了膜的结构和功能。

③实验发现缺Mg培养对于根活力影响不大,用肉眼难以辨别。

猜测,Mg对植物根系活力应该存在一定的影响,但同时植物根系活力也受到诸如温度、生长状态等各种因素的综合作用。

④缺Mg会造成植株的光合作用速率下降,叶绿素含量减小。

Mg是叶绿素合成的中心元素,缺Mg将会使植株无法正常合成出叶绿素,并对植物光合膜的垛叠、激发能在PSI和PSII2个光系统之间的分配、光合电子传递速率、叶绿素荧光、PSⅡ活性和原初光能转化效率以及光合碳代谢等一系列重要的生理生化过程。

⑤缺Mg会造成植株过氧化物酶活性降低,虽然大量文献证明缺Mg会提高过氧化物酶活性,但目前并没有发现有关缺Mg导致玉米等单子叶植物POD活性增高的文章。

因此,缺Mg导致玉米POD活性的增高、降低与否需要进一步进行重复实验以及不同组织细

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