外源基因在原核表达体系中的表达.ppt

外源基因在原核表达体系中的表达.ppt

《外源基因在原核表达体系中的表达.ppt》由会员分享，可在线阅读，更多相关《外源基因在原核表达体系中的表达.ppt（90页珍藏版）》请在冰点文库上搜索。

238241外源基因在原核表达体系中的表达外源基因在原核表达体系中的表达王欣王欣生物化学系生物化学系238242前言在分离到某一基因后，要对其编码蛋白质进行研究，最理在分离到某一基因后，要对其编码蛋白质进行研究，最理所当然的工作就是表达即：

有目的地合成外源基因产物所当然的工作就是表达即：

有目的地合成外源基因产物。

基因表达技术是基因工程的核心。

至今，人们已建立了许基因表达技术是基因工程的核心。

至今，人们已建立了许多基因表达系统，既有原核生物基因表达系统，也有真核生物基多基因表达系统，既有原核生物基因表达系统，也有真核生物基因表达系统。

它们各有其特点，包括优势和不足。

由于人们对不因表达系统。

它们各有其特点，包括优势和不足。

由于人们对不同系统的研究深度很不一样，这就决定了它们的成熟程度和应用同系统的研究深度很不一样，这就决定了它们的成熟程度和应用范围。

范围。

238243如何以大肠杆菌质粒如何以大肠杆菌质粒DNADNA为载体克隆一个编码动物激素的为载体克隆一个编码动物激素的基因，并使之在大肠杆菌中进行表达？

简要说明实验中可能遇到基因，并使之在大肠杆菌中进行表达？

简要说明实验中可能遇到的问题及可能的解决办法。

的问题及可能的解决办法。

238244238245现代生物技术发展史上的重要事件现代生物技术发展史上的重要事件年代事件1917KarlEreky首次使用“生物技术”这一名词1943大规模生产青霉素1944Avery,Macleod和Mccarty通过实验证明DNA是遗传物质1953Watson和Crick阐明了DNA的双螺旋结构1961生物技术和生物工程杂志创刊19611966破译遗传密码1970分离出第一个限制性内切酶1971Khorana等人合成了完整的tRNA基因1973Boyer和和Cohan建立了建立了DNA重组技术重组技术1975Kohler和Milstein建立了单克隆抗体技术1976第一个第一个DNA重组技术规则问世（重组技术规则问世（Struhl,Vapnek,Changetal）1977DNA测序技术诞生1978Genentech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1980Guarante等在科学杂志上发表以质粒、乳糖操纵子为基础建立起来的大肠杆菌表达系统，这一发明构成了大肠杆等在科学杂志上发表以质粒、乳糖操纵子为基础建立起来的大肠杆菌表达系统，这一发明构成了大肠杆菌表达系统的雏形。

菌表达系统的雏形。

美国最高法院对Diamond和Chakrabarty专利案作出裁定，认为经基因工程操作的微生物可获得专利1981第一台商业化生产的DNA自动测序仪诞生第一个单克隆抗体诊断试剂盒在美国被批准1982用用DNA重组技术生产的第一个动物疫苗在欧洲获得批准重组技术生产的第一个动物疫苗在欧洲获得批准1983基因工程Ti质粒用于植物转化1988美国授予对肿瘤敏感的基因工程鼠以专利PCR方法问世1990美国批准第一个体细胞基因治疗方案美国批准第一个体细胞基因治疗方案1997美国科学家培养出第一只克隆绵羊多莉1998美国批准爱滋病疫苗可以进行人体实验日本科学家培养出克隆牛，英美等国培养出克隆鼠2000英国科学家培养出转基因克隆猪2001人类基因组筐架图公布2002水稻基因组筐架图公布小鼠基因组筐架图公布2003中国科学家研制的重组腺病毒-p53注射液获得国家食品药物监督管理局首次批准的新药证书，成为世界上第一个获得正式批准的基因治疗药物2004英国当局（HumanFertilisationandEmbryologyAuthority,HFEA）首次批准英国一科研单位进行人类细胞核移植治疗性克隆研究2005人类基因组“差异图”公布10月27日,全球科学家通过分析全球不同人群之间的遗传基因信息,初步绘制出首张人类DNA序列中变异基因片段的遗传图谱。

该研究结果不但会进一步改变人们对生物学和人类进化的理解,而且将帮助科研人员更方便地找出与人类主要疾病（如哮喘、糖尿病、心脏病和癌症）密切相关的变异基因,从而改进对这些疾病的预防、诊断和治疗技术。

（Nature,2005，437:

1299）2006Piwi-干扰RNA2007在涉及胚胎干细胞和DNA重组方面的一系列突破性发现238246基因工程技术基因工程技术是将一种生物细胞的基因分离出来，在体外进行酶切和连接是将一种生物细胞的基因分离出来，在体外进行酶切和连接并插入载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主细胞后并插入载体分子构成遗传物质的新组合，引入另一种宿主细胞后使目的基因得以复制和表达的技术。

其特点是打破物种界限，赋使目的基因得以复制和表达的技术。

其特点是打破物种界限，赋予生物新的遗传性；目的是使外源基因在受体细胞内按人们期望予生物新的遗传性；目的是使外源基因在受体细胞内按人们期望的方式进行表达。

的方式进行表达。

让任何一种生物接让任何一种生物接受另一种生物的遗传物质受另一种生物的遗传物质并在其细胞内表达并在其细胞内表达功能和稳定遗传功能和稳定遗传在试管内直接在试管内直接操作遗传物质改变操作遗传物质改变基因功能基因功能,调节基因调节基因表达方式表达方式238247基因工程的主要研究内容基因工程的主要研究内容1获得具有遗传信息的目的基因获得具有遗传信息的目的基因22选择基因载体获得重组选择基因载体获得重组DNADNA33将重组将重组DNADNA分子导入宿主细胞分子导入宿主细胞44鉴定带有目的基因的克隆；目的基因的扩增及获得目的产物鉴定带有目的基因的克隆；目的基因的扩增及获得目的产物238248基因工程药物基因工程药物指利用基因工程技术研制和指利用基因工程技术研制和生产的药物，主要包括重组蛋白多肽药物、反生产的药物，主要包括重组蛋白多肽药物、反义核酸药物、义核酸药物、DNADNA药物、药物、siRNAsiRNA药物和基因工药物和基因工程抗体等程抗体等。

238249基因工程制药的特点基因工程制药的特点和传统制药业相比，基因工程制药有如下突出优点。

和传统制药业相比，基因工程制药有如下突出优点。

1.1.可以获得天然来源难以得到的生理活性物质，使之成为新药。

可以获得天然来源难以得到的生理活性物质，使之成为新药。

2.2.利用基因工程技术使得活性蛋白、多肽基因可以在微生物、真核细胞乃至动利用基因工程技术使得活性蛋白、多肽基因可以在微生物、真核细胞乃至动物反应器、植物反应器中获得高效表达，使生理活性蛋白多肽可以批量生产，物反应器、植物反应器中获得高效表达，使生理活性蛋白多肽可以批量生产，保障临床治疗需要。

保障临床治疗需要。

3.3.提供足够数量的生理活性物质以对其结构、功能、性质进行深入研究，从而提供足够数量的生理活性物质以对其结构、功能、性质进行深入研究，从而进一步扩大这些活性物质的使用范围。

进一步扩大这些活性物质的使用范围。

4.4.通过基因工程技术可以不断发掘和开发更多的新型生理活性物质。

通过基因工程技术可以不断发掘和开发更多的新型生理活性物质。

5.5.利用基因工程、蛋白工程技术可以改造内源生理活性物质，进一步提高其生物利用基因工程、蛋白工程技术可以改造内源生理活性物质，进一步提高其生物活性。

活性。

6.6.采用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物来源。

采用基因工程技术可以获得新型化合物，扩大药物来源。

2382410研究重组表达技术的目的及意义研究重组表达技术的目的及意义1.1.研究蛋白质的作用机理和功能；研究蛋白质的作用机理和功能；2.2.是研究蛋白质的一大基础技术，当生化提取方法难以获得足量是研究蛋白质的一大基础技术，当生化提取方法难以获得足量的蛋白质时；的蛋白质时；3.3.重组技术使蛋白质结构变化，获得各类异构体。

重组技术使蛋白质结构变化，获得各类异构体。

2382411原核表达体系原核表达体系大肠杆菌表达系统大肠杆菌表达系统Escherichiacoli枯草杆菌表达系统枯草杆菌表达系统Bacillusanthracis芽孢杆菌表达系统芽孢杆菌表达系统Bacillus链霉菌表达系统链霉菌表达系统Streptomyces2382412各表达系统的使用率（各表达系统的使用率（PubMed）PubMed）E.coliE.coliPichiapastorisPichiapastorisBaculovirusBaculovirusMammalianMammalian200520052006200620072007486481236076610701441005125521401264550020002000400040006000600080008000100001000012000120002382413大肠杆菌表达体系大肠杆菌表达体系Escherichiacoli内容提要内容提要原核表达的基本知识原核表达的基本知识提高外源基因表达水平的措施提高外源基因表达水平的措施介绍几种表达载体介绍几种表达载体外源基因在大肠杆菌中表达的进展外源基因在大肠杆菌中表达的进展2382414大肠杆菌质粒大肠杆菌质粒一类独立于染色体外自主复制的双链、闭环一类独立于染色体外自主复制的双链、闭环DDNANA分子；分子；结合转移型结合转移型非结合转移型非结合转移型不在宿主间转移不在宿主间转移,整合到染色体上的频率低整合到染色体上的频率低,具有遗传学上的稳定性和安全性具有遗传学上的稳定性和安全性.2382415理想的大肠杆菌表达载体必须具备的基本条件理想的大肠杆菌表达载体必须具备的基本条件1.1.稳定的遗传复制、传代能力稳定的遗传复制、传代能力2.2.抗菌素抗性基因（显性的转化筛选标记）抗菌素抗性基因（显性的转化筛选标记）3.3.适用于外源基因插入的酶切位点或具有若干限制酶单一识别位的点适用于外源基因插入的酶切位点或具有若干限制酶单一识别位的点4.4.较小的分子量和较高的拷贝数较小的分子量和较高的拷贝数5.5.启动子的转录是可以调控的，抑制时本底转录水平较低启动子的转录是可以调控的，抑制时本底转录水平较低6.6.启动子转录的启动子转录的mRNAmRNA能够在适当的位置终止，转录过程不影响表达能够在适当的位置终止，转录过程不影响表达载体的复制载体的复制2382416表达载体的基本元件表达载体的基本元件1复制子复制子2筛选标记筛选标记3启动子启动子4终止子终止子5核糖体结合位点核糖体结合位点复制子：

是一段包含复制起始点、反式因子作用区在内的复制子：

是一段包含复制起始点、反式因子作用区在内的DNADNA片段片段，其功能是通过复制使质粒能稳定存在于大肠杆菌内。

，其功能是通过复制使质粒能稳定存在于大肠杆菌内。

在同一大肠杆菌细胞内，同一复制子类型的不在同一大肠杆菌细胞内，同一复制子类型的不同质粒不能存在于同一细胞中，不同复制子类型的不同同质粒不能存在于同一细胞中，不同复制子类型的不同质粒可以存在于同一细胞中，这就是质粒可以存在于同一细胞中，这就是同种不相容、异种相容现象。

同种不相容、异种相容现象。

2382417表达载体表达载体将克隆的真核基因置于大肠杆菌的转录转译信号控制之下。

将克隆的真核基因置于大肠杆菌的转录转译信号控制之下。

这种按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源基因的编这种按特殊设计构建的，能使克隆在其中特定位点的外源基因的编码序列，在大肠杆菌中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。

码序列，在大肠杆菌中正常转录并转译成相应蛋白质的克隆载体。

它分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载体。

它分为表达型质粒载体和表达型噬菌体载体。

可控转录启动子转录调控序列。

可控转录启动子转录调控序列。

2382418基因表达基因表达系指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所系指结构基因在生物体中的转录、翻译以及所有有加工过程。

加工过程。

外源基因在原细胞中的表达外源基因在原细胞中的表达系指令克隆的外源基因系指令克隆的外源基因在原核细胞中以发酵的方式在原核细胞中以发酵的方式快速、高效地合成基因产物快速、高效地合成基因产物2382419用途用途克隆化基因导入大肠杆菌用于大量表达蛋白质方法克隆化基因导入大肠杆菌用于大量表达蛋白质方法1.1.以融合蛋白的形式制备抗真核蛋白的多克隆或单克隆抗体以融合蛋白的形式制备抗真核蛋白的多克隆或单克隆抗体2.2.大量产生完整的天然蛋白质分子以研究其结构和功能大量产生完整的天然蛋白质分子以研究其结构和功能3.3.产生由病毒癌基因和细胞癌基因所编码的蛋白质，微注射到体产生由病毒癌基因和细胞癌基因所编码的蛋白质，微注射到体外培养的哺乳动物细胞中，以表明其生物学活性外培养的哺乳动物细胞中，以表明其生物学活性4.4.PULL-DOWNPULL-DOWN实验，研究蛋白质与蛋白质的相互作用实验，研究蛋白质与蛋白质的相互作用23824205.5.在编码目的蛋白的基因中引入突变并在细菌中大量在编码目的蛋白的基因中引入突变并在细菌中大量生产蛋白突变体的方法，为蛋白质工程的研究奠定生产蛋白突变体的方法，为蛋白质工程的研究奠定基础基础6.6.生产具有医用价值的人体蛋白等生产具有医用价值的人体蛋白等2382421原核生物与真核生物基因表达的比较原核生物与真核生物基因表达的比较2382422原核生基因表达的特点原核生基因表达的特点1.1.只有一种只有一种RNARNA聚合酶聚合酶（真核细胞有三种真核细胞有三种），识别原核细胞的启，识别原核细胞的启动子，催化所有动子，催化所有RNARNA的合成。

的合成。

2.2.表达是以操纵子为单位的。

表达是以操纵子为单位的。

3.3.原核生物由于无核膜原核生物由于无核膜,所以转录与翻译是耦联的，二者是连续所以转录与翻译是耦联的，二者是连续进行的。

特点是当进行的。

特点是当mRNAmRNA还在生长中时，即还在被还在生长中时，即还在被DNADNA转录的转录的时候，它就开始翻译了。

时候，它就开始翻译了。

2382423原核生基因表达的特点原核生基因表达的特点4.4.不含内含子不含内含子（intron）（intron），原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加，原核细胞中缺乏真核细胞的转录后加工系统。

因此外源基因要以工系统。

因此外源基因要以cDNAcDNA克隆于载体上。

克隆于载体上。

5.5.其基因的表达控制主要是在转录水平。

其基因的表达控制主要是在转录水平。

6.6.大肠杆菌大肠杆菌mRNAmRNA的核糖体结合位点上，有一保守顺序即的核糖体结合位点上，有一保守顺序即AGGAGGAGGAGGUU，叫，叫SD（Shine-Dalgarno）SD（Shine-Dalgarno）顺序。

与核糖体小亚基上的顺序。

与核糖体小亚基上的16SrR16SrRNA3NA3末端序列互补。

末端序列互补。

2382424真核基因组的特点真核基因组的特点1.1.基因组存在于细胞核内，一般是线状基因组存在于细胞核内，一般是线状DNADNA。

2.2.存在大量的重复序列和很多不编码的序列。

存在大量的重复序列和很多不编码的序列。

3.3.基因中常有内含子，功能上相关的基因集中程度总基因中常有内含子，功能上相关的基因集中程度总的来讲不如原核生物。

的来讲不如原核生物。

2382425原核细胞表达真核基因的障碍原核细胞表达真核基因的障碍1.1.缺乏真核细胞转录后的加工系统，成熟的缺乏真核细胞转录后的加工系统，成熟的mRNAmRNA不能不能形成。

形成。

2.2.缺乏真核细胞翻译后的加工系统。

缺乏真核细胞翻译后的加工系统。

2382426外源基因在原核细胞中外源基因在原核细胞中表达的重要调控元件表达的重要调控元件启动子启动子在转录过程中，首先与在转录过程中，首先与RNARNA聚合酶结合并准确有效地起始转录的特异聚合酶结合并准确有效地起始转录的特异DNDNAA序列叫做启动子。

序列叫做启动子。

-50bp-50bp+起始点起始点+立即下游少数碱基立即下游少数碱基。

由于细菌。

由于细菌RRNANA聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所应用的启动必聚合酶不能识别真核基因的启动子，因此原核表达载体所应用的启动必须是原核启动子，将外源基因克隆在其下游，原核须是原核启动子，将外源基因克隆在其下游，原核RNARNA聚合酶识别原核启聚合酶识别原核启动子，并带动真核基因在原核细胞中转录。

与启动子强度有关的结构要素动子，并带动真核基因在原核细胞中转录。

与启动子强度有关的结构要素有：

有：

-35-35区顺序、区顺序、-10-10区顺序、两者的间隔。

区顺序、两者的间隔。

2382427原核系统中通常使用的可调控原核系统中通常使用的可调控的强启动子有如下几种的强启动子有如下几种1.LacLac启动子启动子操纵子操纵子:

在原核生物中，共同完成某一生理功能的一些基因，编成一个结构在原核生物中，共同完成某一生理功能的一些基因，编成一个结构基因簇即构成一个操纵子。

基因簇即构成一个操纵子。

LacLac启动子来自大肠杆菌的乳糖操纵子。

启动子来自大肠杆菌的乳糖操纵子。

2.LacUV2.LacUV是大肠杆菌经紫外诱变，而产生的一个突变的乳糖启动子对分解代谢抑制不是大肠杆菌经紫外诱变，而产生的一个突变的乳糖启动子对分解代谢抑制不敏感，即使在没有敏感，即使在没有CAP-cAMPCAP-cAMP的情况下，转录也能照常进行。

它的的情况下，转录也能照常进行。

它的-10-10区同感区同感序序列由列由TATGTTATGTTTGG突变为突变为TATAATATAATTGG，这是此同感序列中最好的和出现最多的一个，这是此同感序列中最好的和出现最多的一个。

2382428238242923824303.3.trptrp启动子来自于大肠杆菌的色氨酸操纵子。

启动子来自于大肠杆菌的色氨酸操纵子。

4.4.T7T7噬菌体噬菌体RNARNA聚合酶聚合酶/启动子系统启动子系统2382431表达宿主中的表达宿主中的T7RNAT7RNA聚合酶可以通过两种方式提供聚合酶可以通过两种方式提供1.1.这是一类以这是一类以BL21（DE3）BL21（DE3）为代表的宿主细胞，为代表的宿主细胞，T7RNAT7RNA聚合酶基因聚合酶基因整合到宿主染色体上，此基因受整合到宿主染色体上，此基因受LacUV5LacUV5启动子控制，用启动子控制，用IPTGIPTG可以诱导可以诱导LacUV5LacUV5启动子表达启动子表达T7RNAT7RNA聚合酶，从而表达目的蛋聚合酶，从而表达目的蛋白。

白。

2.2.以以HMSI74HMSI74为代表的一类宿主细胞，它们不产生为代表的一类宿主细胞，它们不产生T7T7噬菌体噬菌体T7RNT7RNAA聚合酶，可以用带有聚合酶，可以用带有T7RNAT7RNA聚合酶基因的聚合酶基因的CE6CE6噬菌体感染含噬菌体感染含有表达质粒的宿主细胞，以提供有表达质粒的宿主细胞，以提供T7RNAT7RNA聚合酶表达处源基因。

聚合酶表达处源基因。

2382432T7T7噬菌体启动子噬菌体启动子10启动子是启动子是T7DNA最强的启动子，由相对于转录起最强的启动子，由相对于转录起始始位点位点-17至至+6位置的位置的23个碱基组成，由个碱基组成，由10起始的转起始的转录多录多数终止于数终止于T10。

238243323824345.PL和和PR启动子启动子噬菌体的噬菌体的PL和和PR启动子，它们都是强启动子启动子，它们都是强启动子，比，比Lac启动子的活性高启动子的活性高8-10倍。

倍。

PL和和PR启动子受启动子受噬菌体噬菌体CI基因的的负调控。

基因的的负调控。

CI阻遏蛋白是温度敏感蛋白。

在阻遏蛋白是温度敏感蛋白。

在2832培养时，培养时，CI产生抑制作用，在温度生高至产生抑制作用，在温度生高至42时，时，CI被被可逆的破坏，这样就解除了对启动子的封闭，使可逆的破坏，这样就解除了对启动子的封闭，使PL和和PR启动启动子开始转录。

因此有人称子开始转录。

因此有人称CI是一个温度敏感抑制因子是一个温度敏感抑制因子。

23824356.Tac启动子启动子Tac启动子是一组由启动子是一组由lac和和trp启动子人工构建的启动子人工构建的杂合杂合启动子，是非常强的启动子，它比启动子，是非常强的启动子，它比lacUV5启动子强启动子强7倍。

倍。

它受它受lac阻遏蛋白的负调节，并被阻遏蛋白的负调节，并被IPTG诱导。

诱导。

2382436SD顺序顺序（Shine-Dalgarno）这段序列是翻译所必须的，它是这段序列是翻译所必须的，它是mRNA能进入核糖体能进入核糖体的关键。

通过序列分析已发现，一般在翻译起始密码前的关键。

通过序列分析已发现，一般在翻译起始密码前10个左右个左右的核苷酸处有一段序列恰与大肠杆菌中核蛋白体中的小亚单位的核苷酸处有一段序列恰与大肠杆菌中核蛋白体中的小亚单位16SrRNA羧端的序列有互补关系，这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与羧端的序列有互补关系，这段序列富含嘌呤核苷酸，刚好与16SrRNA3末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体末端的富含嘧啶的序列互补，是核糖体RNA的识别的识别与结合位点。

与结合位点。

UAAGAAGG和和AAGGA是最常见的典型序列。

是最常见的典型序列。

2382437终止子终止子（terminator）（terminator）在一个基因的在一个基因的3末端或是一个操纵子的末端或是一个操纵子的3末端往往还有一末端往往还有一特定的特定的核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一核苷酸序列，它有终止转录的功能，这一DNA序列称为终止子，序列称为终止子，在在构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因干扰载构建表达载体时，为了稳定载体系统，防止克隆的外源基因干扰载体的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的体的稳定性，一般都在多克隆位点的下游插入一段很强的rrnB核糖核糖体体RNA操纵子的操纵子的T1，T2串联转录终止子。

串联转录终止子。

2382438RBS（ribosomebindingsite）指的是指的是SDSD序列、起始密码子以及两者之间的序列序列、起始密码子以及两者之间的序列。

2382439TIR（translationalinitiationregion）指一切与翻译起始有关的顺式序列，不仅包括指一切与翻译起始有关的顺式序列，不仅包括RBSRBS，还包括另一些核糖体结合位点，以及其它参与二级结构形成影响还包括另一些核糖体结合位点，以及其它参与二级结构形成影响翻译的序列。

因而翻译的序列。

因而TIRTIR的范围涉及的范围涉及55不翻译区，甚至在多顺反不翻译区，甚至在多顺反子中涉及到上游基因，在子中涉及到上游基因，在33端涉及编码序列。

对于不同的基因端涉及编码序列。

对于不同的基因，TIRTIR范围不尽相同。

范围不尽相同。

2382440如何得到符合要求的目的基因如何得到符合要求的目的基因鸟枪克隆法鸟枪克隆法人工合成目的基因人工合成目的基因酶促方法酶促方法从真核细胞中分离mRNA，体外反转录成cDNA.化学合成法化学合成法体外合成。

聚合酶链反应聚合酶链反应设计并合成两段引物，以cDNA为模板，进行PCR扩增。

2382441化学合成基因化学合成基因按照大肠杆菌惯用密码子及设计要求将其编码的氨基酸转化按照大肠杆菌惯用密码子及设计要求将其编码的氨基酸转化成核苷酸序列，根据如下原则：

引物内尽量避免二级结构；引物二成核苷酸序列，根据如下原则：

引物内尽量避免二级结构；引物二二相互重叠的二相互重叠的G+