蛋白组学实验流程.docx
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蛋白质组学实验技术流程
1蛋白提取
目的：
尽可能多的将植物组织中蛋白质提取出来。
1.1试剂和溶液
（1）匀浆缓冲液
本实验室蛋白质提取常用的匀浆缓冲液有两种：
1）Tris-HCl匀浆缓冲液；2）磷酸（PBS）匀浆缓冲液。
1）Tris-HCl匀浆缓冲液：
20mM（mmol/L）Tris-HCl（pH7.5），250mM蔗糖，10mMEDTA，1mMPMSF（使用前加入），1mMDTT（使用前加入），1%w/vTritonX-100。
2）磷酸（PBS）匀浆缓冲液：
50mMPBS（pH7.5），250mMsucrose蔗糖，1％（g/mL）PVPP，2mMEDTA-Na2，2％（v/v）β-巯基乙醇（使用前加入），1mMPMSF（使用前加入）。
[附50mMPBS（pH7.5）缓冲液的配制：
称取NaHPO4.12H2O2.9797g和NaH2PO4.2H2O0.1622g溶于100mL超纯水]
（2）蛋白抽提液：
pH7.5Tris-HCl饱和酚。
（3）蛋白沉淀液：
0.1M醋酸铵（配制溶液为甲醇），即200mL甲醇中加入1.54g醋酸铵。
（4）蛋白沉淀洗涤液：
丙酮（内含13mMDTT），即100mL丙酮加入0.154gDTT。
1.2操作步骤
（1）准备冰块和液氮，并打开冷冻离心机（SorvallBiofugeStratos，Germany）低速转动（1000rpm）降温至-4℃；
（2）将植物组织鲜样用液氮研磨至细粉状，再加入匀浆缓冲液和2％（v/v）巯基乙醇（或1mMDTT）以及1mMPMSF继续在冰浴下研磨成匀浆。
（注意：
一般以0.5g植物鲜样加2mL的匀浆缓冲液的量液氮研磨，另外研磨的粉状物越细越好。
）
（3）研磨后的匀浆液装入离心管，加入同体积的pH7.5Tris-HCl饱和酚（酚提取蛋白），放入振荡器入振荡15-30min后，-4℃低温离心机15000rpm离心15min离心取酚相。
（4）离心取的酚相，加入3倍体积的醋酸铵，放入－20℃冰箱沉淀过夜。
（5）离心取沉淀，洗涤沉淀三次，前一次用醋酸铵洗涤，后两次用冷丙酮（－20℃），每次洗完后都要离心。
（6）离心后的蛋白沉淀用真空离心浓缩干燥仪（ChristCT02-50，Germany）冻干。
（如果不立即使用，蛋白干粉冻于－20℃。
）
2蛋白裂解和定量
目的：
尽可能增大蛋白干粉的溶解性，并对溶解的蛋白样品进行准确定量。
（1）样品裂解液：
7M尿素，2M硫脲，4%w/vCHAPS，2%v/v两性电解质（Ampholine，1.6%v/vpH5～8，0.4%v/vpH3.5～10），1%w/vDTT（使用前加入）。
（2）Bradford存储液和工作液，参见《蛋白质技术手册》（汪家政、范明）56-60页。
3双向电泳
目的：
通过双向电泳将蛋白质按等电点和分子量分离，以获得特异蛋白质。
本实验室常用的电泳方法IPG固相电泳。
3.1试剂和溶液
（1）不同pH梯度范围的IPG胶条的规格选择
pHRange
3-10
3-10nonlinear
4-7
3-6
5-8
7-10
3.9-5.1
4.7-5.9
5.5-6.7
6.3-8.3
生物体中大部分蛋白的等电点在pH4－8之间，线性宽pH范围的胶条（pH3－10）可以在同一块凝胶上显示样品中绝大多数的蛋白质，但大量的蛋白点都集中在胶条的中间，两边的蛋白点较少，从而造成中间的分辨率较低。
非线性宽pH范围的胶条（pH3-10nonlinear）将pH4－8之间的距离相对拉大，而两端pH范围的距离相对缩短，因此可以较好地分离大部分pI4－8的蛋白质。
使用窄范围重叠pH梯度的胶条可以大大提高分辨率和灵敏度。
IPG胶条的长度：
7cm、11cm、17cm、18cm、24cm
（2）IPG平衡液
50mMTris-HCl（pH6.8），6M尿素，30%v/v甘油，2.5%w/vSDS，1%w/vDTT（第一次平衡前加），2.5%w/vIAA（第二次平衡前加）。
（3）浓缩胶
浓缩胶贮存液：
29.2%w/v丙烯酰胺，0.8%w/v甲叉双丙烯酰胺。
附100mL浓缩胶储液配方：
Acylamide29.2g
Bis（甲叉）0.8g
超纯水定溶于100mL
浓缩胶缓冲液：
200mMTris-HCl（pH6.8），0.2%w/vSDS。
附100mL浓缩缓冲液配方：
Tris3.03g
SDS0.2g
加80mL超纯水，用盐酸调至pH6.8后定容至100mL
附浓缩胶（4％）配制：
总体积
10mL
15mL
18mL
浓缩胶储液
1.5mL
2.25mL
2.7mL
浓缩胶缓冲液
2.5mL
3.75mL
4.5mL
超纯水
6mL
9mL
10.8mL
10%APS
100μL
150μL
180μL
TEMED
20μL
30μL
36μL
（4）分离胶
分离胶贮存液：
30%w/v丙烯酰胺，0.135%w/v甲叉双丙烯酰胺。
附100mL分离胶储液配方：
Acylamide30g
Bis（甲叉）0.135g
超纯水定溶于100mL
分离胶缓冲液：
1MTris-HCl（pH8.8），0.27%w/vSDS。
附100mL分离胶缓冲液配方：
Tris12.11g
SDS0.27g
加80mL超纯水，用盐酸调至pH8.8后定容至100mL。
附分离胶（12%和15%）70mL（两块板）配制：
总体积
12%分离胶70mL
15%分离胶70mL
分离胶储液
28mL
35mL
分离胶缓冲液
26mL
26mL
超纯水
16mL
8.5mL
10%APS
400μL
400μL
TEMED
80μL
80μL
（5）0.5%琼脂糖：
0.5g琼脂糖（IPG需要用低熔点琼脂糖）溶解在100mL电泳缓冲液，加热融化，于室温保存。
（6）SDS-PAGE电极液
0.3%w/vTris，1.44%w/v甘氨酸，0.1%w/vSDS。
也即，1L电极缓冲液配方为：
SDS1g
甘露醇14.4g
Tris3g
溶至1L水中。
（7）固定液：
40%v/v乙醇，10%v/v冰乙酸。
（8）染色液
本实验室用到的染色液有三种：
1）R-250染色液（常用）
0.116%w/v考马斯亮蓝（CBB）R-250，25%v/v乙醇，8%v/v冰乙酸。
附考马斯亮蓝染液（1L）：
考马斯亮蓝R-2501.0g
甲醇450mL
蒸馏水450mL
冰醋酸100mL
2）G-250染色液（常用）
0.12%G-250,10%（NH4）2SO4，10%H3PO4，20%甲醇
附1LG-250染色液配方：
100mlH2O+100mlH3PO4（先混匀，产热的）+100g粉末状（NH4）2SO4（边搅拌，边加）先溶解,然后加入1.2gG-250再溶解（其实不能真正溶解），用水定容到800ml，边搅拌边加入200ml甲醇，终体积1000ml。
3.2操作步骤
样品裂解：
5mg蛋白干粉加入裂解液，裂解液溶解的样品放于冰浴上超声助溶后10℃15000rpm离心30min去除沉淀，取上清测量样品蛋白浓度。
IPG上样
根据蛋白浓度选择适当的体积的样品上样（5mg蛋白）。
取蛋白样品，用移液枪沿着水化盘中槽的边缘至左而右线性加入样品；然后从-20℃冰箱中取出冷冻保存的IPG预制胶条（18cmpH4-7线性），放于室温1分钟。
再用镊子轻轻的去除IPG胶条上的保护层，轻轻地将IPG胶条胶面朝下置于水化盘中样品溶液上，为了让胶条更好的吸收样品溶液，避免样品溶液跑到胶条背面的塑料支撑膜上，也不要让胶条下面的溶液产生气泡。
如果已经产生气泡，用镊子轻轻地提起胶条的一端，上下移动胶条，直到气泡被赶到胶条以外。
最后，在每根胶条上覆盖2-3ml矿物油，防止胶条水化过程中液体的蒸发。
需缓慢的加入矿物油，沿着胶条，使矿物油慢慢加在塑料支撑膜上；
等点聚焦
水化12hr后，将胶条转入聚焦盘。
分清胶条的正负极，轻轻地将IPG胶条胶面朝上置于聚焦盘，使得胶条的正极（标有+）对应于聚焦盘的正极。
在胶条和电极的之间加上湿润的小纸片，它可以吸收盐离子和补充水分；连通电源选择聚焦参数进行等电聚焦电泳。
表格3聚焦参数
Steps
Voltage（V）
Time（h）
Step1
300（gradient）
1
Step2
500
1
Step3
1000
1
Step4
8000（gradient）
8
Step5
8000
1
第二向SDS-PAGE电泳
平衡
聚焦完成后取出IPG胶条，用滤纸吸去附着的矿物油后将其放入1%DTT的平衡缓冲液中平衡15min，再转入2.5%IAA平衡缓冲液中平衡15min。
平衡过程在摇床上进行。
电泳
将平衡好的胶条转移到第二向垂直板胶（15%分离胶，4%浓缩胶）的上端；用0.5%的低熔点琼脂糖密封（避免产生气泡），加入电极缓冲液（含0.001%溴酚蓝显色剂）进行SDS－PAGE凝胶电泳，恒定电流20mA/gel，待溴酚蓝至胶底端关闭电源。
（2）固定、染色和脱色
电泳完成后，取下凝胶，置于固定液中进行固定，时间为30min。
固定好的凝胶置于CBBR-250染色液中，室温下染色3小时以上。
倒出染色液（可以回收利用3次以上），加入脱色液进行脱色。
15分钟后更换脱色液，继续脱色3小时左右，其间更换数次脱色液，至凝胶背景合适，蛋白点鲜明为止。
固定、染色以及脱色过程均在脱色摇床上晃动进行。
（3）蛋白质凝胶扫描
CBB染色后的凝胶用UniscanM3600扫描仪直接扫描。
扫描参数设置为256阶灰度、300dpi透射扫描，图像保存为Tiff格式。
（4）PDQuest软件进行图像分析
扫描后的图像用PDQuest7.1.0软件（Bio-rad）进行分析，包括蛋白点的检测、匹配以及标准化等。
通过比较分析寻找出显著差异的蛋白点。
软件使用参照用PDQuest软件使用说明。
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