荧光光谱FL..ppt

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1,仪器分析InstrumentalAnalysis,分子发光光谱法MolecularLuminesenceSpectrumetry,分子荧光:

Fluorescence;分子磷光:

Phosphorescence,2,主要和常用的荧光磷光分光光度计及型号,HITACHI（日立）F-4500荧光分光光度计,荧光/磷光/发光分光光度计（PerkinElmer）LS-55,3,1分子发光的基本原理,第一次记录荧光现象的是16世纪西班牙的内科医生和植物学家N.Monardes，1575年他提到在含有一种称为“LignumNephriticum”的木头切片的水溶液中，呈现了极为可爱的天蓝色。

直到1852年，Stokes在考察奎宁和叶绿素的荧光时，用分光光度计观察到其荧光的波长比入射光的波长稍微长些，才判断这种现象是这些物质在吸收光能后重新发射不同波长的光，而不是由光的漫射作用所引起的，从而导入了荧光是光发射的概念，他还由发荧光的矿石“萤石”推演而提出“荧光”这一术语。

1867年，Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定。

19世纪以前，荧光的观察是靠肉眼进行的，直到1928年，才由Jette和West提出了第一台荧光计。

4,一.分子荧光与磷光的产生,1.单重态与三重态（p79）,2.分子的活化与去活化,3.分子发光的类型,按激发的模式分类：

按分子激发态的类型分类：

光致发光化学发光/生物发光热致发光场致发光摩擦发光,按光子能量分类：

斯托克斯荧光（Stokes）：

exem共振荧光（Resonance）：

ex=em,5,分子的活化与去活化（p78）,外转移,内转移,荧光,系间窜跃,磷光,反系间窜跃,迟滞荧光,振动弛豫,.无辐射跃迁的类型,振动弛豫:

Vr10-12sec外转移:

无辐射跃迁回到基态内转移:

S2S1能级之间有重叠系间跨跃:

S2T1能级之间有重叠反系间窜跃:

由外部获取能量后T1S2,.辐射跃迁的类型,共振荧光：

10-12sec荧光：

10-8sec磷光：

110-4sec迟滞荧光:

10210-4sec,6,二.分子荧光（磷光）光谱,1.荧光（磷光）激发光谱与发射光谱,荧光（磷光）均为光致发光，在光辐射的作用下，荧光物质发射出不同波长的荧光。

A.激发光谱（p79）,固定em=620nm（MAX）,ex=290nm（MAX）,固定发射波长扫描激发波长,荧光激发光谱与紫外-可见吸收光谱类似,B.发射光谱（荧光光谱）,固定激发波长扫描发射波长,7,2.三维荧光光谱,IFf（ex、em）,蒽的激发光谱,固定发射波长、扫描激发波长,8,IFf（ex、em）,蒽的发射光谱,固定激发波长、扫描发射波长,9,蒽的三维等高线光谱图,10,蒽的三维等荧光强度光谱,11,VB1和VB2的三维荧光光谱,12,固定em=620nm（MAX）,固定ex=290nm（MAX）,em=620nm（MAX）,2.激发光谱与发射光谱的镜像关系,1.发射光谱的形状与激发波长无关,分子的激发光谱可能含有几个激发带，但发射光谱只含一个发射带；即使分子被激发到高于S1的电子态，由于经过极快的内转换和振动弛豫降到S1电子态的最低振动、转动能级，然后以辐射形式释放能量回到基态。

三、荧光（磷光）光谱的特征（p81）,13,3.斯托克斯位移,14,对于稀溶液，当bc0.05（磷光bc0.01）时：

IF-荧光强度F-荧光量子产率,k-与仪器灵敏度有关的参数I0-入射光强度。

IP-磷光强度P-磷光量子产率,b-吸收光程-摩尔吸光系数C-荧光物质浓度,四.分子荧光（磷光）强度与荧光物质浓度的关系,1.荧光强度（磷光）与浓度的关系,光吸收定律（LambertBeerLaw）,15,2.荧光（磷光）的平均寿命,分子在激发态的平均时间或者说处于激发态的分子数目衰减到原来的1/2所经历的时间。

It=I0e-t/TlnIt-t作图得一直线，又斜率可以求得荧光寿命的数值。

利用荧光寿命可以进行荧光化合物分析。

16,3.荧光（磷光）的量子产率,荧光量子产率的定义：

（p91）,kF、kp主要取决与荧光物质的分子结构；st系间窜跃效率。

ki主要取决化学环境，同时也与荧光物质的分子结构有关。

大多数的荧光物质的量子产率在0.11之间；例如：

0.05mol/L的硫酸喹啉，F=0.55；荧光素F=1,17,1.跃迁的类型,二.荧光与有机化合物的结构,对于有机荧光物质:

*,n*max100平均寿命10-510-7sec,*max104平均寿命10-710-9seckST小,*n,*是有机化合物产生荧光的主要跃迁类型。

强荧光的有机化合物具备下特征:

具有大的共轭键结构；具有刚性的平面结构；具有最低的单重电子激发态为S1为*型；取代基团为给电子取代基。

2分子荧光与磷光强度的影响因素,一.荧光的量子产率,18,2.共轭效应,产生荧光的有机物质，都含有共轭双键体系，共轭体系越大，离域大键的电子越容易激发，荧光与磷光越容易产生。

荧光物质的刚性和平面性增加，有利于荧光发射。

3.刚性平面结构,芴,联苯,F=1,F=0.2,19,不产生荧光,产生荧光,产生荧光,不产生荧光,F=0.92,萘,VA,F（萘）=5F（VA）,荧光黄,酚酞,偶氮菲,偶氮苯,20,1）给电子取代剂加强荧光,4.取代基效应,NH2，NHR，NR2，OH，OR，CN,产生p共轭,二苯甲酮：

弱荧光、强磷光S1T1的系间窜跃产率接近1,2）得电子取代基减弱荧光、加强磷光,C=O，COOH，NO2,不产生p共轭,硝基苯：

不产生荧光、弱磷光,21,空间位阻对荧光发射的影响,3）取代基的位置,反式二苯乙烯强荧光物质,F=0.75,F=0.03,立体异构体对荧光发射的影响,顺式二苯乙烯非荧光物质,电离效应对荧光发射的影响（pH值）,pH=1,有荧光,pH=13,无荧光,无荧光,有荧光,22,含有重原子的溶剂，由于重原子效应荧光减弱、磷光增强。

5.重原子取代基效应,Cl，Br，I,S1T1的系间窜跃由于重原子的存在增强,6.环境因素：

溶剂效应、温度,蓝移:

En*En*,红移:

E*E*,在极性溶剂中：

无溶剂化作用,有溶剂化作用,23,三.金属螯合物的荧光,1.螯合物中配位体的发光,2.螯合物中金属离子的发光,8-羟基喹啉弱荧光,8-羟基喹啉-Zn螯合物黄绿色强荧光,2,2-二羟基偶氮苯无荧光,2,2-二羟基偶氮苯-Al螯合物强荧光,T1,系间窜跃,d*df*f荧光,分子内能量转移,24,四.荧光的猝灭,1.碰撞熄灭,荧光猝灭：

荧光分子与溶剂分子或其它溶质分子相互作用引起荧光强度降低或消失的现象。

荧光猝灭剂：

这些溶剂分子或其它溶质分子称为荧光猝灭剂。

相对速率1K1M*K2M*Q,与分子的直径、粘度、温度等因素有关。

2.能量转移熄灭,再吸收过程：

共振能量转移：

分子内能量转移：

激发发射熄灭,25,3.氧的熄灭作用,氧分子是荧光、磷光的熄灭剂，,4.自熄灭与自吸收,当荧光物质的浓度大于1g/L时，常发生荧光的自熄灭（浓度熄灭）,自吸收：

没有除氧，溶液中难以观察到磷光,由于F1，使荧光强度减弱或消失.,形成二聚体：

由于二聚体不发荧光，或发射荧光的能量有改变，造成自熄灭现象。

26,3荧光（磷光）分光光度计,一.主要组成及部件的功能,荧光分光光度计工作原理基及仪器结构框图,光源,氙灯,激发单色器,样品池,光电倍增管,数据处理仪器控制,发射单色器,问题：

荧光分光光度计与紫外-可见分光光度计有何异同点？

27,二.光源,1.光源的要求：

发射强度足够且稳定的连续光谱光辐射强度随波长的变化小有足够长的使用寿命,2.氙灯光源,常用气体放电灯类型：

氙灯光源高压汞光源,波长范围：

2001000nm工作压力：

520atm启动电压：

2040KV使用寿命：

10002000h,最广泛应用的连续光源：

发射波长范围宽发射光强度大,28,3.高压汞灯光源,应用广泛的线光源：

253.7296.5302.2312.6313.2365.0365.5366.3404.7435.8546.1557.0579.0（nm）,29,三.单色器,四.检测器,光电倍增管放大倍数：

2n5n;n=10,103107，最大108109,五.样品池：

液池、荧光池,1.样品池的材料：

与紫外-可见分光光度计的吸收池一样,2.吸收池的形状：

紫外-可见分光光度计的吸收池两面透光荧光分光光度计的样品池四面透光,波长范围,3.使用注意事项,容易破碎,问题：

紫外-可见分光光度计的吸收池与荧光分光光度计的样品池有什么区别？

沾污问题,激发单色器、发射单色器,30,紫外-可见分光光度计:

荧光（磷光）分光光度计:

31,紫外-可见分光光度计测量池（吸收池）,荧光分光光度计样品池,I0,It,I0,It,IF,p,32,六.磷光分光光度计,1.光学系统与荧光分光光度计的区别,共振荧光：

10-12sec,荧光：

10-8sec,磷光：

110-4sec,迟滞荧光：

10010-4sec,2.样品池与荧光分光光度计的区别,通常情况下，样品池需要放在盛液氮的石英杜瓦瓶内，来测定低温磷光。

33,荧光分析法的应用,一.工作曲线法,荧光分析的灵敏度比紫外可见分光光度法高103104.,荧光熄灭工作曲线法,直接荧光标准曲线法,二.荧光分析法的灵敏度,注意：

低浓度时成线性关系；高浓度时由于自猝灭、自吸收等原因不成线性关系。

34,在紫外光照射下会发生荧光的无机化合物很少，主要依赖于有机试剂形成的螯合物。

三.荧光分析的应用,1.无机化合物,直接荧光测定法,其中，较常测定的元素有：

Be、Al、B、Ga、Se、Mg、Zn、Cd与某些稀土元素；测定的灵敏度有些可以达到10-10;,某些元素虽然不与有机试剂形成发荧光的配合物，但是它会与发荧光的配合物争夺配位体，组成不发荧光的配合，使其产生荧光熄灭，由荧光熄灭的强度此该元素的含量。

较常测定的元素有：

F、S、Fe、Ag、Co、Ni、Cu、Mo、W,荧光熄灭测定法,自从1867年Goppelsroder进行了历史上首次的荧光分析工作，应用铝桑色素配合物的荧光进行铝的测定以来，采用有机试剂可以测定70多种元素。

35,催化荧光测定法,较常测定的元素有：

Cr、Nb、U、Te、Pb,某些元素虽然与有机试剂形成发荧光的配合物，但是反应速度慢，在某些微量元素的催化下，反应速度会加快，在特定的时间内可用来测定微量元素。

低温荧光测定法,常测定的元素有：

Cu、Be、Fe、Co、Os、Ag、Au、Zn、Al、Ti、V、Mn、Er、H2O2、CN,某些微量元素存在，会催化发荧光的配合物产生荧光熄灭，在特定的时间内可用来测定微量元素。

溶液温度的降低，显著增强溶液的荧光强度。

液氮1960C,较常测定的元素有：

Ce、Sm、Tb等稀土元素Sb、V、Pb、Bi、Nb、Mn,固体荧光测定法,固体荧光发在荧光分析中也经常用到。

36,芳香族化合物存在共轭的不饱和体系，是有机化合物荧光测定的主要类型。

.有机化合物,3.生命与生物物质（如：

DNA相互作用，VB的测定等）,37,小分子与DNA相互作用研究,D.Watson&H.Crick,应用,38,激发波长525nm，发射波长500700nm的荧光图谱,39,40,Scatchard,金属配合物的ScarchardPlot,轴上的截距即n值为：

0.234,结合常数为8.24*104L/mol,41,分子识别研究,